Summary
Intramyocardial cel levering in muriene modellen van cardiovasculaire ziekten, zoals hypertensie of myocardiaal infarct, wordt veel gebruikt om het therapeutisch potentieel van verschillende celtypes in regeneratieve studies testen. Daarom zal een gedetailleerde beschrijving en een duidelijke visualisatie van deze chirurgische procedure helpen om de beperkingen en voordelen van cardiovasculaire cel therapeutische analyses in kleine knaagdieren te definiëren.
Abstract
Eerdere studies toonden aan dat de cel levering bevordert de hartfunctie verbetering door afgifte van cytokinen en factoren die hartweefsel revascularisatie en overleving van cellen te verhogen. Bovendien aanvullende opmerkingen bleek dat stamcellen, zoals hart stamcellen, mesenchymale stamcellen en cardiospheres hebben de mogelijkheid om te integreren in het omliggende myocard door differentiëren in cardiomyocyten, gladde spiercellen en endotheelcellen.
Hier presenteren we de materialen en methoden betrouwbare levering noncontractile cellen in de linker ventriculaire wand van immunologisch muizen. De meest opvallende stappen van deze microchirurgische procedure te betrekken anesthesie en analgesie injectie, intratracheale intubatie, incisie aan de borst te openen en het hart en de levering van de cellen bloot door een steriele 30-gauge naald en een precisie microliter spuit.
Weefselverwerking bestaande uit hart oogsten, embedding snijden en histologische kleuring toonde aan dat intramyocardial celinjectie produceerde een kleine beschadiging het epicardiale gebied, en in de ventriculaire wand. Noncontractile cellen werden gehandhaafd in de myocardiale wand van immuungecompromitteerde muizen en werden omringd door een laag van fibrotisch weefsel, waarschijnlijk tegen cardiale druk en mechanische belasting.
Introduction
Verschillende cel leveringsprotocollen zijn getest in muizen en ratten modellen van cardiovasculaire ziekten teneinde vertalen de efficiëntie, doeltreffendheid en veiligheid van deze experimentele procedure menselijke patiënten. In kleine knaagdier harten, intramyocardiale cel levering is de meest haalbare methode van cel levering 1,2, terwijl in de rat hart antegrade 3 en 4 retrograde intracoronaire cel infusie kan ook worden gebruikt. Beide methoden hebben beperkingen en voordelen. Cel levering intracoronair heeft theoretische voordelen ten opzichte van directe intramusculaire injectie in de bevordering van de wereldwijde verspreiding cel 3, maar het heeft ook het risico van het veroorzaken van coronaire embolie 3,5. Beperkingen op intramyocardiale levering worden geassocieerd met mechanische schade, acute ontsteking, en myocardschade 6,7. Bij de mens, zijn cellen voor cardiale reparatie door intramyocardiale injectie geleverd via een endocardiale of chirurgische epicardiaalbenaderen of door intracoronair arteriële route 8. Injectie door transvasculaire routes is geschikt bij patiënten met acute infarct en gereperfundeerde myocard, maar is niet altijd mogelijk in het geval van totale afsluitingen of slechte doorstroming binnen de vaten van de getroffen gebied 9. Directe injectie in de ventriculaire wand van transendocardial of transepicardial injectie technisch mogelijk afhankelijk van de patiënt gezondheidstoestand. Inderdaad is aangetoond dat deze techniek veilig 10,11, hoewel voor transepicardial injectie open borstchirurgie noodzakelijk en transendocardial benaderingen een elektrofysiologische afbeelding voor elke patiënt moet plaatsen van levensvatbare ischemisch myocardium of littekens 9 differentiëren.
Belangrijk in celtherapie studies de keuze van de beste cel te transplanteren wordt nog onderzocht. Korte termijn analyses (4 weken) aan dat injectie van cardiale stamcellen gedefinieerd cardiospheres
In muis en rat modellen, lange-termijn studies blijkt dat celinjectie geen verdere verbetering van de hartfunctie (12 maanden). Inderdaad, enten van menselijke embryonale stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hESC-CM) werden grotendeels geïsoleerd van de host myocard door een laag van fibrotische weefsel 22,23. Vergelijkbare resultaten zijn waargenomen na intramyocardiale transplantatie van skeletmyoblasten naar het hart van geïnfarceerde muizen 24. Furthermore, de lange termijn kan van allogene MSC om te functioneren in het infarct hart bewaren is beperkt door overgang van een immunoprivileged tot een immunogeen staat na differentiatie 25.
Rekening houdend met de uitdagingen en vooruitzichten hierboven geschetste, tonen we hier hoe cellen leveren door intramyocardiale injectie bij muizen. We zien dat de cellen zonder cardiomyocyte contractiele eigenschappen niet verbonden met de gastheer myocard en vormen een samenhangende massa met een dunne fibrotische barrière. Hoewel in sommige gevallen uitkomst voordelig kunnen zijn, kan de volgende analyse nuttig zijn om te begrijpen hoe cellen innesteling kunnen variabel zijn om functioneel verbonden myocard structuren genereren ook.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de internationale (Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement) en nationale (UK Home Office, Act 1986) regelgeving. De hierin beschreven procedures maken deel uit van ons plan van het werk volgens de Britse autoriteiten van afgifte en zijn niet uitgevoerd voor het doel van de opname.
1. Bereiding van Cellen
Dit protocol beschrijft de bereiding van een bepaalde cellijn (humane embryonale nier, HEK293 cellen) voor demonstratiedoeleinden. Cel-specifieke protocollen moeten worden gebruikt voor het kweken en uiteindelijk differentiëren pluripotent of volwassen stamcellen in specifieke cellijnen.
- Groeien cellen in DMEM media (hoge glucose, 4.500 mg / L) met 1% natriumpyruvaat, 2 mM glutamine, 1% antibioticum Pen / Strep en 10% foetaal runderserum (FBS). Een 10 cm plaat moet normaliter worden gesplitst op 1:03 en media aangevuld vers om de twee dagen.
- Behandel cellen mild met trypsin 1x en resuspendeer in DMEM medium volgens 1:1.
- Tellen cellen in een hemocytometer kamer en laat 3 x 10 6 cellen in een afzonderlijke buis.
- Centrifugeer in een swing bucket rotor bij 100 g gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en was de cel pellet met steriele fosfaatbuffer 2x.
- Resuspendeer in PBS 1x bij een concentratie van 10 6/50 ul voor injectie in de linker ventrikel van immunologisch muizen.
2. Prechirurgische Voorwaarden
- Handhaaf immunologisch muizen (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) met steriel voedsel pellets en water in een temperatuurgecontroleerde isolator (22 ° C, Tabel 1) voor elke operatie.
- Voer chirurgie van immunologisch muizen onder een laminaire stroming kap. Reinig de werkruimte met 70% ethanol en autoclaaf chirurgische instrumenten (tang en schaar).
- Schakel de verwarming pads voor de operatie en voor de terugvordering. Verwarming pads zijn belangrijkde vermindering van de temperatuur die tijdens en na de operatie blokkeren.
- Plaats een schone en geautoclaveerd kooi op de herstel-verwarming pad.
- Vervoer de muizen in hun oorspronkelijke kooien van de isolator naar de operatie kamer in een steriele zak geautoclaveerd.
- Weeg de muis en naar het lichaamsgewicht inject subcutaan (sc) een oplossing met medetomidine en ketaminehydrochloride verdund in 0,9% steriele zoutoplossing voor de muis te verdoven, alsmede de spieren ontspannen (medetomidine 1 mg / kg; ketaminehydrochloride 75 mg / kg).
- Verwijder de muis uit de kooi bij volledige narcose (binnen 1-2 minuten, geen teen-snuifje reflex na stimulatie)
- Solliciteer ontharingscrème aan de linkerkant van de borst en de keel. Nadat een geschikte hoeveelheid tijd (ongeveer 2-5 minuten), veeg de losse haren met een met water vochtig doekje.
- Plaats de muis op de operatie paneel in liggende positie. Vangezichtspunt van de chirurg de positie is verticaal, staart omlaag-head up.
- Injecteren pijnstillende oplossing bij 0,1-0,2 ug / g verdund in steriele zoutoplossing (buprenorfine) in de achterste ledematen subcutaan en bedek het geschoren gebied met de aseptische oplossing povidonjood met behulp van een katoenen tip applicator.
- Focus van de microscoop (2.5x objectief) op de keel gebied.
3. Chirurgische Voorwaarden
- Met stompe schaar maak een middellijn ventrale incisie in de huid van ongeveer 0,5-1 cm lengte iets onder het ringkraakbeen. Scheid de huid bindweefsel naar de speekselklieren visualiseren.
- Splits de speekselklieren op hun natuurlijke middellijn deling door gelijktijdig trekken elk deel zijwaarts met pincet en magnetische borst oprolmechanisme en de luchtpijp bloot.
- Trek de tong voorzichtig naar de zijkant om het strottenhoofd bloot. Schuif de intubatie tube voorzichtig in de luchtpijp. De buis tip is zichtbaar door de weergegeven larynx en luchtpijp. Belangrijk, indien de buis in, maar niet duidelijk zichtbaar is in de slokdarm. Verwijderen en veranderen van de positie van de buis tip.
- Sluit de buis naar de ventilatie machine. Stel het slagvolume bij 200 pl en 150 slag / min. Zet de ventilatie slangen op de operatie-paneel met een tape.
- Met stompe schaar en pincet, maak een verticale staart aan het hoofd 1 - tot 1,5-cm lange incisie in de huid over de linker thorax gebied.
- Maak de huid van het bindweefsel / spierlagen en de grote en kleine borstspieren zonder insnijdingen.
- Voer thoracotomie tussen de derde en vierde ribben als volgt:
- Perforeren de intercostale spierlaag door te knijpen en krabben met kleine, ronde tang.
- Zodra de intercostale spierlaag is geperforeerd, plaatst de borst oprolmechanisme maximaal te openen de borstholte. De bovenste en middelste delen van de linker ventrikel (LV) met overliggende boezem (atrium) zijnnu zichtbaar.
- Bereid een precisie spuit met cellen. De spuit moet in staat zijn tot een bedrag van volume van 10 ul leveren voor elke injectie. Wierp een 30 G naald aan het uiteinde van de spuit.
- Bevestig met tape een klein plastic canule (van een Introcan-W 20 G) op de naald, waardoor blootgesteld slechts 1 mm inclusief de open uiteinde van de naald. Hierdoor wordt voorkomen dat de naald perforeren de gehele linker ventriculaire wand en het injecteren van de cellen in de linker ventrikel holte.
- Met behulp van een 5x doelstelling visualiseren deze vergroting het linker ventrikel en injecteer de cellen in de linker ventriculaire wand in 5 verschillende locaties (elke injectie staat 10 ul in totaal 106 cellen geïnjecteerd). Als de injectie is geslaagd, wordt een wit gebied en de afwezigheid van grote terugslag van de cellen zichtbaar zijn (als de injectie niet succesvol was, zou het dier uit de functionele analyse worden uitgesloten).
- Verwijder het oprolmechanisme. Sluit de thoraxwand by omsluiten de twee afzonderlijke ribben met twee steken van 6-0 zijden hechtdraad.
- Hydrateren de borstspieren en de huid met een wattenstaafje gedrenkt in PBS 1x en voorzichtig zet de spieren terug in de oorspronkelijke positie met de tang.
- Sluit de huid met 3-4 steken van 6-0 zijden hechtdraad. Hecht de keel incisie met 2-3 steken om de huid te sluiten.
- Injecteer atipamezol (1 mg / kg eindconcentratie) aan de verdovende effecten terug.
- Zodra de muis begint zelfstandig ademen, haal de buis van de luchtpijp en zet de muis op de rechterzijde. De muizen zullen aantrekken binnen minuten.
- Wanneer de muis begint te draaien en lopen, plaats deze in de warme herstel kooi (kleine IVC kooi met gesloten gefilterd top) voor een uur.
- Laat de dieren 's nachts in een gecontroleerde verwarmde doos (37 ° C).
- Vul een schaaltje met water en pellet voedsel om herstel te ondersteunen tijdens de eerste 2 dagen na de operatie.
Tien harten geïnjecteerd met cellen en 10 controle niet geïnjecteerd harten zijn histologisch als volgt geanalyseerd:
- Voer analyse van de geënte cellen 1 week na de injectie (Figuren 1 en 3).
- Na euthanasie door overdosis isofluraan, perfuseren de harten met 20 ml 4% paraformaldehyde (PFA) om het weefsel vast. Dehydrateer vaste weefsel in toenemende percentages ethanol (70-100%) en inbedden in paraffine blokken.
- Sectie van de harten in paraffine met een microtoom op 5 micrometer en vlek met hematoxyline en eosine voor morfologische analyse.
- Visualiseer bindweefsel door Masson Trichrome vlek.
- Analyseer de beelden onder een dia scanner microscoop (figuren 1A, 2A, 3A, 3B en 3C) en visualiseer het gehele hart in korte as bekijken met behulp van een digitale dia scanner microscoop (Figures 1B en 1C).
- Na de bovenstaande analyse, deparaffinize het hartweefsel in xyleen, hydrateren door onderdompeling specimens afnemende percentages ethanol (100% water) en een werkwijze voor Scanning Electron Microscopy (SEM) als volgt:
- Incubeer gedeparaffineerd blokken met 1% looizuur in 0,1 M fosfaatbuffer gedurende 1 uur.
- Dehydrateer exemplaren in toenemende percentages ethanol (25-100%).
- Droge monsters met HMDS (hexamethyldisilazaan).
- Monteer de specimens op Stubbs met Acheson Zilveren Dag en smeer ze met goud-palladium.
- Bekijk monsters in een analytische scanning elektronenmicroscoop (Figuur 2B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geïnjecteerd HEK293 cellen, die onderscheiden van de hartcellen door hun verschillende morfologie (figuur 1) zijn, met een geplaveide vorm opzichte van de langwerpige cardiomyocyten (Figuur 1A). HEK293 cellen waren meer reactief naar hematoxylin kleurstof (blauw) vergeleken met hartspiercellen (roze kleur), waarschijnlijk vanwege hun toegenomen nucleaire inhoud (figuur 1A). Om verder te onderscheiden van de geïnjecteerde cellen van het gastheerweefsel werden HEK293 cellen gelabeld met DAPI 2 uur voor injectie. Gelabelde cellen zichtbaar waren in het myocardium zie figuur 1E. Controle schijn-geopereerde muizen bleek geen schade in het hele hart (figuur 1C) en de integriteit van het weefsel (figuur 1D).
In een heel korte as aanzicht van het hart, geïnjecteerde cellen zichtbaar waren als een homogene groep in het gebied van injectie (figuur 1B). De gegroepeerde cellen werden omringd door een dunne laag van fibrotisch weefsel, die op de trichroomkleuring (Figuur 2A) verscheen als blauwe gebied. Cellen werden geen verband met de gastheer myocardiale weefsel, zoals blijkt uit Scanning Electron Microscopy (figuur 2B), waarschijnlijk vanwege hun noncontractile functie en verschillende cellulaire structuur.
Naast de bovenstaande overwegingen hebben we geconstateerd kleine beschadigingen waar de naald geïnjecteerd (Figuur 3A). Deze gebieden lopen vanaf de externe epicardial laag van het hart in de hartspier (figuur 3A). Geïnjecteerde cellen (groene pijl, figuur 3B) zijn aanwezig in de nabijheid van de gewonde gebied (zwarte pijlen, Figuur 3B). DAPI-positieve cellen zichtbaar langs de injectieplaats (figuur 3C, witte pijlen). Een week na verwonding heeft Tunel assay niet verhoogd vertonen apoptotische cellen op de plaats van verwonding, suggereert dat necrosein plaats van apoptose is opgetreden na injectie met een naald (Figuur 3D).
Figuur 1. Histologische analyse van de geïnjecteerde cellen. A) Een week na celinjectie harten werden ingebed in paraffine en verwerkt voor hematoxyline en eosine kleuring. Geïnjecteerd HEK293 cellen waren aanwezig in de wand van het linker ventrikel. Beelden werden verkregen met een stereo fluorescentiemicroscoop. B) Trichrome gekleurde weefsels toonde aan dat de cellen werden gegroepeerd in hetzelfde gebied waar ze werden geïnjecteerd (pijl). Rechts onderaan panelen tonen de korte as te bekijken met de juiste (RV) en linker ventrikel (LV). De rode rechthoek toont het gebied waar de cellen worden vastgehouden (1.5X). De beelden werden opgenomen met een slide scanning microscoop. C) Trichrome staining controle schijn-geopereerde harten. Hele hart aanzicht 5X doel. D) Trichrome kleuring van schijn-geopereerde muizen geeft hartspierweefsel rechtschapen. E) HEK293 cellen werden gekleurd met DAPI 2 uur voor injectie. Een week na de injectie harten waren ingebed in oktober en coupes in een cryostaat op 6 micrometer. Cellen werden zichtbaar gemaakt onder UV in een fluorescentiemicroscoop. Links en rechts ventrikels worden getoond. In het rechter ventrikel, rechter paneel, de witte lijn markeert de epicardial laag. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Vorming van een fibrotische laag tussen geïnjecteerde cellen en gastheer weefsel. A) trichroomkleuring tonencollagene weefsel gevormd tussen HEK293 cellen en muizen hartspierweefsel (pijlen). De beelden werden opgenomen met een digitale scanning microscoop. B) Harten werden gedeparaffiniseerd en verwerkt voor Scanning Electron Microscopy. Beelden werden opgenomen met een scanning elektronenmicroscoop en tonen collageenvezels (pijlen) tussen de geïnjecteerde HEK293 cellen (links) en de gastheer myocard (rechts). Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Celinjectie geproduceerd kleine beschadigingen. A) trichroomkleuring toont kleine beschadigingen waar de naald werd geïnjecteerd (blauwe kleur;. Pijlen) B) Paraffinecoupes werden gekleurd door Trichrome stazoekvan en het gebied waar de cellen werden geïnjecteerd wordt aangegeven met zwarte pijlen. Geïnjecteerde cellen (groene pijl) waren zichtbaar in de nabijheid van het aangetaste gebied. C) HEK293 cellen gekleurd met DAPI 2 uur voor injectie, aanwezig langs de injectieplaats (witte pijl) waren. De plaats van injectie wordt aangegeven met een groene pijl en de witte open lijn markeert de pericardiale laag. D) Tunel Assay, uitgevoerd op paraffinecoupes, bleek niet relevant fluorescerende positieve kernen. Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript, hebben we laten zien hoe intramyocardiale injectie van cellen uit te voeren in muizen harten. Als bewijs van deze methode, hebben we gebruik gemaakt HEK293 cellen. Het is belangrijk te benadrukken dat HEK293 cellen niet worden gebruikt in een celtherapie studie en de vaststellingen van dit manuscript zijn niet geschikt voor directe vertaling van een therapeutische benadering. Het feit dat HEK293 cellen niet contractiele cellen en niet transdifferentiëren in andere celtypen richt de aandacht op technische aspecten zoals de eigenschappen van de cellen te leveren en de wijze van levering.
Er werd gemeld dat een intramyocardial route meestal celgroepen ingebed in het hartweefsel 24,26 veroorzaken, terwijl intracoronair homogenere verdeling kan leveren op de plaats van verwonding. Voor cardiomyocyte vervangen, moet de ideale donor cel de elektrofysiologische, structurele en contractiele properti vertonenes van hartspiercellen en moeten kunnen structureel en functioneel geïntegreerd in het gastheerweefsel, suggereert de noodzaak van een celdifferentiatie programma worden gebruikt voor transplantatie.
De belangrijkste punten voor een succesvolle chirurgie kan als volgt worden samengevat:
- Verdoven muizen met injecteerbare verbindingen de hartslag te vertragen en celinjectie vergemakkelijken
- Voer intratracheaal canulatie van muizen naar de longen functionaliteit bevoordelen.
- Voer thoracotomie vermijden spier incisie te borstspier functionaliteit behouden voor een juiste ademhaling.
- Na het belichten het hart, acht het linkerventrikel onder een microscoop om te visualiseren of injectie heeft plaatsgevonden (zichtbaar als een bleke kleur).
- Gebruik een dunne naald en een spuit precisie uitgebreide perforatie van het myocardium te voorkomen en de gewenste hoeveelheid materiaal respectievelijk injecteren.
- Schede de naald met een plastic buis systeem bloot olleen het topdeel. Dit zou invoering van de naald een bepaalde diepte in de linker ventrikel (0,5 mm) mogelijk, vermeden injectie in de ventriculaire holte.
- Sluit de borst en de ruimte tussen de ribben goed naar blootstelling van de longen aan externe druk te voorkomen.
Deze techniek heeft een hoge mate van succes als postoperatieve gezondheidsproblemen hebben voorrang. Dieren moeten intensief worden gecontroleerd elke dag tot een week voor de tekenen van nood en pijn. Injectie van pijnstillende stoffen om pijn te controleren moet worden toegediend als nodig post-operatief. Topicale toediening van pijnbestrijding, zoals lidocaïne, kunnen eveneens worden gebruikt. Bloeden te voorkomen door zorgvuldige chirurgische technieken. Indien optreedt, kan worden gestopt door druk of ligatie van vaartuigen. We hebben opgemerkt dat dieren herstellen beter en sneller als ze in een verwarmingskast bij 37 ° C gedurende 12-20 uur na chirurgie. Deze behandeling zal een snelle daling van lichaamstemperatuur blokkeren, nochMally zich voordoen na chirurgische ingreep en anesthesie. Postchirurgische infecties kunnen optreden, maar moet minder zijn dan 1%. Aseptische procedures moeten strikt worden gevolgd om infectie te voorkomen. Lokale infectie kan worden behandeld met gebruik van antibiotica. Belangrijkste is dat dehydratatie worden gecontroleerd door subcutane injectie van zoutoplossing.
Het verdient de voorkeur injecteerbare toedienen via inhalatie-anestheticum, zoals isofluraan. Inderdaad, we hebben geconstateerd dat injecteerbare verdoving verminderde hartslag, waardoor gemakkelijker injectie en minder bloeden zonder dat dier ongemak.
Hoewel invasieve, injectie van kleine hoeveelheden cellen (25-50 pi) bij muizen is haalbaar en veilig is. We hadden minder dan 1% sterfte door injectie 50 pl HEK293 cellen in 5 verschillende gebieden van de linker ventriculaire wand (10 ul / injectie). Deze werkwijze zorgde voor de aanwezigheid van cellen in verschillende gebieden van de hartspier, wat belangrijk is instamceltherapie toen uitgebreid gebied van ischemische schade moet worden bereikt door de geleverde cellen. Om minder invasieve chirurgie, zijn verscheidene protocollen onlangs verschenen, hoewel hun reproduceerbaarheid in verschillende laboratoria moet nog worden geverifieerd. Bijvoorbeeld, kan celinjectie worden uitgevoerd door close-borst techniek met behulp van hoge resolutie echocardiografie 27. Het gebruik van dit systeem vereist hoge exploitant vaardigheden om duidelijk te visualiseren afbeelding van een twee-dimensie in de wand van de linker hartkamer en de naald op een bepaalde locatie te behouden tijdens de normale systolische / diastolische cycli. Het voordeel van deze techniek is de implantatie van de cellen in de muis myocardium gewenste locaties in een klinisch relevante termijn na myocardiaal infarct inductie. Echter, deze benadering is niet mogelijk met chirurgische ingrepen, zoals een hartinfarct inductie of transaortale strepen als gevolg van de toegenomen sterfte van dieren die in een tweede operatie 27. Interessant, Hamdi en collega's vergeleken direct intramyocardiale injectie versus levering van cellen in een Gelfoam bouwen op de epicardial gebied 28. Zij merkten op dat overlappen de cel te construeren op de epicardium resulteerde in betere transplantaat functionaliteit vergeleken met intramyocardiale celinjectie en meldde dat deze techniek is reproduceerbaar, gebruiksvriendelijk, en minder traumatisch voor de dieren 28.
Een belangrijk kenmerk van celinjectie experimenten is het traceren van de cellen en hun overleving. We hebben aangetoond dat HEK293 cellen eenvoudig te detecteren door hun onderscheiden morfologie vergeleken hartcellen. Deze cellen overleefden de injectie (gegevens niet getoond) en werden een week in het weefsel vastgehouden na chirurgie. Om cellen voor lange termijn studies op te sporen en hun innesteling in het weefsel van levering en in andere weefsels te analyseren, verschillende technieken in gebruik zijn, met inbegrip van fluorescentielabelling en FISH eennalyse in seks-mismatch transplantatie-experimenten 29. Belangrijk is dat in vivo beeldvorming een belangrijke rol spelen bij het in-vitro-analyses in toekomstige studies. Inderdaad, een voordeel van in vivo beeldvorming via histologische werkwijzen is het volgen van de cellen in longitudinale studies bij dezelfde dieren zonder euthanasie 29. In deze methode, kunnen cellen worden gemerkt met bioluminescentie reagentia, ijzerdeeltjes en reporter genen te beelden met positron emissie tomografie (PET) en magnetische resonantie (MRI).
Onze analyses toonden aan dat noncontractile cellen zoals HEK293 cellen voorkeur gegroepeerd in het gebied waar ze werden geïnjecteerd omgeven door een dunne collageen weefsel. Hoewel de pathofysiologische mechanismen die leiden tot de vorming van fibrotisch weefsel in een immunologisch muis onbekend zijn, kan het collageen weefsel zichtbaar rond de getransplanteerde cellen vergelijkbaar eindpunt van zijnweefsel compatibele implantaat. In dit geval kan het exogene materiaal niet worden verwijderd door de ontstekingscellen en wordt ingekapseld in een dichte laag fibrotisch bindweefsel, die hem beschermt tegen de omringende weefsels. Evenals het eindstadium fasen van wondgenezing, dit granulaire weefsel vaatrijke en zorgt overleving van het geïmplanteerde materiaal.
Technisch de hier beschreven werkwijze is geslaagd maar intramyocardial naald injectie produceerde een klein gebied van schade aan het omringende weefsel. Hoewel de hartfunctie metingen waren niet het doel van deze herziening, moet toekomstige studies onderzoeken of kleine weefselschade celtherapie analyses kunnen verstoren. Bovendien zou het belangrijk zijn te onderzoeken of de schade die in het geïnjecteerde gebied wordt veroorzaakt door de naald, door de hoeveelheid geïnjecteerde cellen of een combinatie van beide.
Ter ondersteuning van onze bevindingen is aangetoond dat transplantation van gemengde populaties van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen (hESC) met 20-25% hartspiercellen (hESC-CM) in het gezonde hart van immuungecompromitteerde muizen (NOD-SCID) resulteerde in een snelle vorming van enten waarbij de hartspiercellen werd georganiseerd en gerijpt in de tijd en de noncardiomyocyte bevolking werd verloren 23. Interessant is dat de auteurs opgemerkt dat hESC-CM grotendeels werden geïsoleerd uit de gastheer myocardium door een laag fibrotische weefsel dat de vorming van een elektrofysiologische syncytium 22,23 voorkomen. In een andere studie, Kehat et al.. Vonden dat hESC-CM met succes liep het ventrikel bij varkens met complete hartblok. Deze studie toonde aan dat de getransplanteerde cellen overleefden, functioneerde en geïntegreerd gastheercellen bewijs voor hun vermogen om te functioneren als een biologisch alternatief voor de elektronische pacemaker 30. Deze twee tegenstrijdige uitkomsten kunnen worden verzoend door het verschil in structuur en functie van host en donor soorten. Inderdaad is het mogelijk dat de efficiëntie van koppeling van getransplanteerde hartspiercellen kan afhangen van de relatieve frequentie van kloppen gastheer en donorcellen. In Van Laake studie 23, kan de vorming van functionele verbindingen worden aangetast door de verschillende kloppen frequentie van menselijke cardiomyocyten (60-100 bpm) versus knaagdier cardiomyocyten (300-600 bpm). Dit zou het geval zijn in humane versus varken transplantatie-experimenten, zoals beschreven in Kehat analyse 30.
De duur van de waarneming is een verstorende factor. hESC-CM getransplanteerd in het knaagdier hart na een hartinfarct veroorzaakt hartfunctie verbetering alleen voor de korte termijn tijdstippen (4 weken). Echter, bij 12 weken, de hartfunctie werd niet verder opgelopen ondanks entoverleving 23. De auteurs opgemerkt dat graft grootte (verhoogde hoeveelheid cellen) niet werd geassocieerd met een verbeterde lange termijn cardiale survival en functionele verbetering 31, wat aangeeft dat de lange termijn analyses versus korte-of middellange termijn analyses moeten in toekomstige studies worden uitgevoerd zonder dat er een verhoogd aantal cellen voor injectie.
In deze studie verscheidene vragen blijven over het soort cellen te transplanteren, de keuze van de gastheer-donor soorten worden getest en een gedetailleerde evaluatie van de aritmische potentieel van de cellen. Idealiter stamcellen geïmplanteerd in het myocard voor vervanging of pacemakerfunctie moet functioneel koppel met de resterende myocytes. In een ratmodel van hartinfarct, Fernandes et al.. 32 gebruikt Geprogrammeerde elektrische stimulatie (PES) aritmie gevoeligheid evalueren, groeit de induceerbaarheid van ventriculaire aritmieën in myoblasten geïnjecteerde harten vergeleken met controles. In dezelfde studie heeft injecties van beenmerg afgeleide autologe cellen niet leiden tot een verhoogde inducibilteit van ventriculaire aritmie in vergelijking met de controlegroep, hetgeen leidt de auteurs concluderen dat myoblasts vertoonden een specifieke arrhythmogenic risico. In een andere studie, beenmerg-afgeleide cellen (BMC) efficiënt geënt in clusters binnen het infarct litteken of grenszone, maar toonde geen elektronisch opgewekte Ca transiënten 33. Interessant, Wei et al.. Bleek dat mesenchymale stamcellen (MSC) in het voortbestaan periode in het infarct harten niet de elektrofysiologische eigenschappen van volwassen hartspiercellen weet te verwerven. Ze kunnen echter de elektrische kwetsbaarheid te verminderen en niet bevorderen ventriculaire aritmie 34.
De werkzaamheid en het optreden van aritmie stamceltherapie afhankelijk van de cellen en op de toedieningsroutes. Inderdaad, in rattenharten na MI 35, intramyocardiale BMC injecties, hoewel het verbeteren van de hartfunctie, verhoogde opeenvolgende ventriculaire premature contracties en ventriculaire tachycardia voor de eerste 14 dagen. Wanneer intracoronair werd gebruikt, werd ventriculaire aritmie optreden duidelijk verminderd. In klinische studies, de pro-aritmische werking van geïnjecteerde cellen moeilijk te bepalen omdat de meeste patiënten beta-blokkeermiddelen zoals aangegeven voor ischemische hartziekten. Behandeling met bètablokkers kan een potentieel pro-aritmische effect van de getransplanteerde cellen maskeren. Dierproeven zijn daarom van cruciaal belang om de bases van pro-aritmische stimuli in stamceltherapie beoordelen.
Kortom, onze gegevens tonen de haalbaarheid van intramyocardiale cel-injectie bij muizen maar benadrukt ook de noodzaak van een gedetailleerde analyse over de veiligheid van de cel enten. Bij de mens is aangetoond dat celinjectie is geassocieerd met pro-aritmie 36-38, restenose 39, versnelde atherosclerose 40 en coronaire obstructie 41. Fundamenteel onderzoek is van groot belang in de toekomstige klinische appcaties te begrijpen welke cellen moeten worden afgeleverd, de wijze van levering, de mechanismen van cel-gemedieerde myocardfunctie reparatie, en het ontwerp van een allogene versus autologe stamceltransplantatie protocol dat alle menselijke bevolking ten goede komen. Vanwege de hoge kosten van grote klinische proeven, reproduceerbaarheid efficiëntie en effectiviteit van transplantatie protocollen heeft in preklinische modellen zoals die welke hier beschreven worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de Magdi Yacoub Instituut (MYI) voor het ondersteunen van microscopie analyse en de projecten waarbij cardiale reparatie, de technici en de manager van onze dierlijke faciliteit. Dit werk werd ondersteund door de British Heart Foundation (BHF), Project subsidie PG/10/019. MPS wordt ondersteund door de MYI en BHF. TP is een BHF-Research Excellence Fellow. NR is een NH & MRC Australië Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolator | Pfi systems | Quotation needed | |
| Heating Pad | Vet Tech Solutions | HE006 | For small animals |
| Medetomidine | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Ketamine hydrochloride | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Atipamezole | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Hair removal cream | commercial shops | ||
| Buprenorphine | NVS | Veterinary prescription is necessary | |
| Leica MZFLIII microscope | Leica | Model S6E | With swing arm stand TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner | Hamamatsu | RS series | |
| Scanning Electron Microscope | Jeol | JSM-6610 | |
| Blunt scissors | FST | 14084-09 | |
| Minivent | Harvard Apparatus | 73-0043 | Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844) |
| Forceps | FST | 11052-10 | |
| Retraction system | FST | 18200-20 | Kit for animals up to 200 g |
| 30 G 12 mm; ½ inch | BBraun | A210 | Fine yellow |
| Microliter syringe | ESSLAB | 81201 | Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700 |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | W1614T |
References
- Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
- Taylor, D. A., et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929-933 (1998).
- Suzuki, K., et al. Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation. 104, 207-212 (2001).
- Suzuki, K., et al. Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function. Circulation. 110, 225-230 (2004).
- Robinson, S. W., et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant. 5, 77-91 (1996).
- Muller-Ehmsen, J., et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 107-116 (2002).
- Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M., Schneider, M. D. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J. Clin. Invest. 115, 572-583 (2005).
- Oettgen, P., Boyle, A. J., Schulman, S. P., Hare, J. M. Cardiac Stem Cell Therapy. Need for Optimization of Efficacy and Safety Monitoring. Circulation. 114, 353-358 (2006).
- Krause, K., et al. Percutaneous intramyocardial stem cell injection in patients with acute myocardial infarction: first-in-man study. Heart. 95, 1145-1152 (2009).
- Rodrigo, S. F., et al. Intramyocardial injection of bone marrow mononuclear cells in chronic myocardial ischemia patients after previous placebo injection improves myocardial perfusion and anginal symptoms: an intra-patient comparison. Am. Heart J. 164, 771-778 (2012).
- Smith, R. R., et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation. 115, 896-908 (2007).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 2, 173-181 (2009).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Malliaras, K., et al. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Circulation. , 125-1100 (2012).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, 763-776 (2003).
- Bearzi, C., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15885-15890 (2009).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, 2369-2379 (2012).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, 895-904 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, 1847-1857 (2011).
- Brunt, K. R., Weisel, R. D., Li, R. K. Stem cells and regenerative medicine - future perspectives. Can. J. Physiol. Pharmacol. 90, 327-335 (2012).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem Cell Res. 1, 9-24 (2007).
- Leobon, B., et al. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7808-7811 (2003).
- Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, 2419-2429 (2010).
- Reinecke, H., Poppa, V., Murry, C. E. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 241-249 (2002).
- Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, 1307-1314 (2005).
- Hamdi, H., et al. Cell delivery: intramyocardial injections or epicardial deposition? A head-to-head comparison. Ann. Thorac. Surg. 87, 1196-1203 (2009).
- Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marban, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circ. Res. 106, 479-494 (2008).
- Kehat, I., et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
- van Laake, L. W., et al. Improvement of mouse cardiac function by hESC-derived cardiomyocytes correlates with vascularity but not graft size. Stem Cell Res. 3, 106-112 (2009).
- Fernandes, S., et al. Autologous myoblast transplantation after myocardial infarction increases the inducibility of ventricular arrhythmias. Cardiovasc. Res. 69, 348-358 (2006).
- Scherschel, J. A., Soonpaa, M. H., Srour, E. F., Field, L. J., Rubart, M. Adult bone marrow-derived cells do not acquire functional attributes of cardiomyocytes when transplanted into peri-infarct myocardium. Mol. Ther. 16, 1129-1137 (2008).
- Wei, F., et al. Mesenchymal stem cells neither fully acquire the electrophysiological properties of mature cardiomyocytes nor promote ventricular arrhythmias in infarcted rats. Basic Res Cardiol. 107, 274 (2012).
- Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
- Bartunek, J., et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 112, 178-183 (2005).
- Britten, M. B., et al. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation. 108, 2212-2218 (2003).
- Smits, P. C., et al. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2063-2069 (2003).
- Kang, H. J., et al. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 363, 751-756 (2004).
- Fernandez-Aviles, F., et al. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res. 95, 742-748 (2004).
- Vulliet, P. R., Greeley, M., Halloran, S. M., MacDonald, K. A., Kittleson, M. D. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 363, 783-784 (2004).
