Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Intramyocardique cellulaire livraison: Observations aux coeurs murins

doi: 10.3791/51064 Published: January 24, 2014

Summary

Fourniture de cellules intra-myocardique dans des modèles murins de maladies cardio-vasculaires telles que l'hypertension ou de l'infarctus du myocarde, est largement utilisé pour évaluer le potentiel thérapeutique de différents types de cellules dans les études de régénération. Par conséquent, une description détaillée et une visualisation claire de cette intervention chirurgicale aideront à définir les limites et les avantages des analyses thérapeutiques de cellules cardiovasculaires chez les petits rongeurs.

Abstract

Des études antérieures ont montré que la capacité des cellules favorise l'amélioration de la fonction cardiaque par la libération de cytokines et de facteurs qui augmentent la revascularisation du tissu cardiaque et la survie cellulaire. En outre, des observations ont révélé que les cellules souches spécifiques, tels que les cellules souches cardiaques, les cellules souches mésenchymateuses et cardiospheres ont la capacité d'intégrer au sein du myocarde environnant en se différencier en cardiomyocytes, les cellules musculaires lisses et les cellules endotheliales.

Ici, nous présentons les matériaux et les méthodes susceptibles de fournir de manière fiable les cellules non contractiles dans la paroi ventriculaire gauche de la souris immunodéplétion. Les étapes marquantes de cette procédure microchirurgicale impliquent l'anesthésie et l'injection de l'analgésie, intratrachéale intubation, incision pour ouvrir le coffre et exposer le coeur et la livraison des cellules par une aiguille stérile de calibre 30 et une seringue de précision microlitre.

Le traitement des tissus comprenant de coeur récolte, embedding, de sectionnement et coloration histologique a montré que l'injection intra-myocardique de cellules produit une petite dommages dans la zone épicardique, ainsi que dans la paroi ventriculaire. Les cellules non contractiles ont été retenues dans la paroi du myocarde de souris immunodéprimées et sont entourés par une couche de tissu fibreux, de nature à l'abri de la pression cardiaque et de la charge mécanique.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Divers protocoles de transport cellulaire ont été testés dans des modèles murins de rat et de maladies cardio-vasculaires, dans le but de traduire l'efficacité, l'efficacité et l'innocuité de cette procédure expérimentale chez des patients humains. Dans les petits coeurs de rongeurs, la livraison de cellules intramyocardique est la méthode la plus réaliste de la prestation de cellule 1,2, alors que dans le antérograde de coeur de rat 3 et rétrograde injection de cellules de 4 intracoronaire peut également être utilisé. Les deux méthodes ont des limites et avantages. livraison cellulaire par voie intracoronaire présente des avantages théoriques sur l'injection intramusculaire directe dans la promotion de la diffusion de la cellule mondiale 3, mais il a aussi le risque de provoquer une embolie coronarienne 3,5. Limitations de livraison intramyocardique sont associées à une lésion mécanique, une inflammation aiguë et des lésions myocardiques 6,7. Chez les humains, les cellules pour la réparation cardiaque sont administrés par injection intra-myocardique par un épicardique endocavitaire ou chirurgicalapprocher ou par intracoronaire artère 8. Injection par voie transvasculaire est adapté chez les patients présentant un infarctus aigu du myocarde et reperfusé, mais peut-être pas possible dans le cas d'occlusions totales ou mauvaise circulation dans les vaisseaux du territoire effectuée 9. L'injection directe dans la paroi ventriculaire par injection transendocardique ou transépicardique est techniquement réalisable en fonction de l'état de santé du patient. En effet, il a été montré que cette technique est sûre 10,11, bien que pour l'injection transépicardique une chirurgie à thorax ouvert est nécessaire pour transendocardique et se rapproche d'une cartographie électrophysiologique pour chaque patient est nécessaire pour différencier les sites de myocarde ischémique ou portant des cicatrices viable 9.

Fait important, dans les études de thérapie cellulaire du choix de la meilleure cellule pour être transplanté est encore à l'étude. Analyses à court terme (4 semaines) ont montré que l'injection de cellules souches cardiaques définies comme cardiospheres 13 la récupération fonctionnelle cardiaque chez le rat et la souris 14 15 modèles de l'infarctus du myocarde en réduisant la taille de la cicatrice et la mort cellulaire. L'allogreffe de cardiospheres dans un modèle de l'infarctus du myocarde de rat sans immunosuppression a été trouvé pour être sûr, promu la régénération cardiaque et améliore la fonction cardiaque par stimulation des mécanismes de réparation endogènes 15. Lin-/c-kit + adultes de cellules souches dans le coeur ont été montrés pour être auto-renouvellement, clonogenic, et multipotentes in vitro et in vivo, et lorsqu'il est injecté dans un coeur de rat ischémique reconstitué une grande partie de la paroi du myocarde blessé 16 et eu l' capacité à former des artères coronaires 17 conductrice et de taille intermédiaire. Ces données prometteuses ont alimenté la phase I et II des essais cliniques chez l'homme: l'injection de cellules souches mésenchymateuses autologues et allogéniques (MSC) 18, 19 cardiospheres, ou de cellules souches cardiaques positifs c-Kit (SCC) 20 dans les cœurs ischémiques chaque montré des effets bénéfiques de la fonction cardiaque dans les études à long terme. Néanmoins, vaste à long terme de suivi et de méta-analyse rétrospective ont montré que la thérapie de cellules souches apporte un bénéfice important à certains patients, mais pas dans d'autres avec une série de résultats imprévisibles 21. Il est possible que ces limitations nécessiteront la conception de protocoles spécifiques de délivrance de cellule pour chaque individu et de chaque maladie.

Dans des modèles de souris et de rat, des études à long terme ont montré que l'injection de cellules n'a pas d'améliorer encore la fonction cardiaque (12 mois). En effet, les greffes de cardiomyocytes souches embryonnaires humaines dérivées de cellules (CSEh-CM) ont été largement isolés du myocarde hôte par une couche de tissu fibreux 22,23. Des résultats similaires ont été observés après transplantation de myoblastes squelettiques intramyocardique dans le cœur de souris ayant subi un infarctus 24. Furthermore, la capacité à long terme de cellules souches mésenchymateuses allogènes pour préserver la fonction cardiaque en l'infarctus a été limité par la transition d'un état ​​à un immunoprivilégiés immunogène après différenciation 25.

Prenant en considération les défis et les perspectives énoncées ci-dessus, nous montrons ici comment offrir cellules par injection intra-myocardique chez la souris. Nous observons que les cellules sans propriétés contractiles des cardiomyocytes ne sont pas connectés avec le myocarde hôte et forment une masse homogène avec une barrière fibreuse mince. Bien que dans certains cas, ce résultat peut être avantageux, l'analyse qui suit peut être utile de comprendre comment la prise de greffe de cellules peut être modulée pour générer des structures du myocarde fonctionnellement connectés ainsi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les organisations internationales (la directive 2010/63/UE du Parlement européen) et national (Home Office britannique, loi de 1986) des règlements. Les procédures décrites ici font partie de notre plan de travail en vertu des autorisations de licence au Royaume-Uni et n'ont pas été entrepris dans le but de l'enregistrement.

Une. Préparation des cellules

Ce protocole décrit la préparation d'une lignée cellulaire spécifique (rein embryonnaire humain, des cellules HEK293) à des fins de démonstration. Protocoles spécifiques aux cellules doivent être utilisées pour la culture et, éventuellement, la différenciation des cellules souches pluripotentes ou adultes dans des lignées cellulaires spécifiques.

  1. Cultiver les cellules dans du milieu DMEM (taux élevé de glucose, 4500 mg / L) contenant du pyruvate de 1% de sodium, 2 mM de glutamine, 1% d'antibiotique Pen / Strep et 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Une plaque de 10 cm doit être normalement divisée à 01h03 et médias complétée frais tous les deux jours.
  2. Traiter les cellules légèrement avec trypsen 1x et remettre en suspension dans du milieu DMEM décrit dans 1:1.
  3. Compter les cellules dans un hémocytomètre et la chambre de collecte de 3 x 10 6 cellules dans un tube séparé.
  4. Centrifuger dans un seau rotor oscillant à 100 g pendant 5 min.
  5. Jeter le surnageant et laver le culot de cellules avec un tampon de phosphate stérile 2x.
  6. Remettre en suspension dans du PBS 1x à une concentration de 10 6/50 pi pour l'injection dans le ventricule gauche de souris immunodéplétion.

2. Conditions préchirurgicales

  1. Maintenir souris immunodéplétion (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) avec des granulés stériles alimentaires et de l'eau dans un isolateur à température contrôlée (22 ° C; tableau 1) avant chaque intervention.
  2. Effectuer la chirurgie de souris immunodéplétion sous une hotte à flux laminaire. Nettoyer la zone de travail avec 70% d'éthanol et l'autoclave outils chirurgicaux (pinces et ciseaux).
  3. Mettez coussins chauffants pour la chirurgie et pour la reprise. Les coussins chauffants sont importantspour bloquer la diminution de la température du corps se produisant pendant et après la chirurgie.
  4. Placez une cage propre et stérilisé sur le pavé de récupération de chauffage.
  5. Transporter les souris dans leur cage d'origine à partir de l'isolateur de la salle d'opération à l'autoclave dans un sac stérile.
  6. Peser la souris et en fonction du poids corporel injection sous-cutanée (sc) une solution contenant la médétomidine et de chlorhydrate de kétamine dilué dans 0,9% de solution saline stérile pour anesthésier les souris, ainsi que pour relaxer la musculature (médétomidine 1 mg / kg; chlorhydrate de kétamine 75 mg / kg).
  7. Débranchez la souris de la cage lorsqu'il est complètement anesthésié (dans 1-2 min, pas de pincement pincée réflexe après stimulation)
  8. Appliquer les cheveux crème dépilatoire sur le côté gauche de la poitrine et de la région de la gorge. Après un laps de temps approprié (environ 2-5 min), essuyer les poils à un tissu mouillé d'eau.
  9. Placer la souris sur le panneau de chirurgie dans une position couchée sur le dos. À partir dele point de vue du chirurgien la position verticale, la queue basse-tête.
  10. Injecter la solution analgésique à 0,1-0,2 ng / g dilué dans une solution saline stérile (buprénorphine) dans le membre postérieur voie sous-cutanée et couvrir la zone rasée avec l'iode solution de povidone aseptique en utilisant un applicateur coton-tige.
  11. Focaliser le microscope (objectif 2.5X) sur la zone de la gorge.

3. Conditions chirurgicales

  1. Avec des ciseaux émoussés faire une incision de la peau ventrale médiane d'environ 0,5-1 cm de longueur légèrement en dessous du cartilage cricoïde. Séparer la peau des tissus conjonctifs de visualiser les glandes salivaires.
  2. Divisez les glandes salivaires sur leur division médiane naturel en tirant simultanément chaque partie latéral avec pince et magnétique poitrine enrouleur et exposer la trachée.
  3. Tirez la languette doucement sur le côté pour exposer le larynx. Faites glisser le tube d'intubation avec précaution dans la trachée. La pointe du tube est visible à travers la l affichéearynx et de la trachée. Il est important, si le tube est dans, mais pas clairement visible, il est dans l'œsophage. Retirez-le et changer la position de la pointe du tube.
  4. Connectez le tuyau à la machine de ventilation. Réglez le volume de la course à 200 pi et 150 AVC / min. Fixer le tube de ventilation sur le panneau de la chirurgie avec une bande.
  5. Avec des ciseaux et des pinces émoussés, faire une queue verticale à la tête de 1 - 1,5 cm de long incision de la peau sur la zone du thorax gauche.
  6. Desserrez la peau des couches de tissu / musculaires conjonctifs et les majeurs et mineurs muscles pectoraux sans incisions.
  7. Effectuer une thoracotomie entre les troisième et quatrième nervures comme suit:
    1. Perforer la couche musculaire intercostal par pincement et le grattage avec de petites pinces arrondis.
    2. Une fois que la couche musculaire intercostal est perforé, placer l'enrouleur de la poitrine d'ouvrir au maximum la cavité thoracique. Les parties supérieures et moyennes du ventricule gauche (VG) avec son pavillon de recouvrement (atrium) sontmaintenant visible.
  8. Préparer une seringue de précision avec des cellules. La seringue doit être en mesure de livrer une quantité de volume de 10 ul pour chaque injection. Jetez un aiguille 30 G à l'extrémité de la seringue.
  9. Fixer avec du ruban adhésif, une petite canule en plastique (à partir d'un Introcan-W 20 G) sur l'aiguille, laissant exposés seulement 1 mm dont l'extrémité ouverte de l'aiguille. Cela permettra d'éviter que l'aiguille de perforation de la paroi ventriculaire gauche et la totalité de l'injection des cellules dans la cavité du ventricule gauche.
  10. Avec l'aide d'un objectif 5X, de visualiser à ce grossissement du ventricule gauche et d'injecter les cellules dans la paroi ventriculaire gauche dans 5 endroits différents (chaque injection livrera 10 ul pour un total de 106 cellules injectées). Si l'injection est réussie, une zone blanche et l'absence de grand lavage des cellules seront visibles (si l'injection n'a pas réussi, l'animal serait exclu de l'analyse fonctionnelle).
  11. Retirez l'enrouleur. Fermez la paroi thoracique by joignant les deux nervures séparées avec deux points de suture de soie 6-0.
  12. Hydrater les muscles pectoraux et la peau avec un coton-tige trempé dans du PBS 1x et posez-les délicatement les muscles du dos dans la position initiale avec la pince.
  13. Fermer la peau avec 3-4 points de suture de soie 6-0. Suturer l'incision de la gorge avec 2-3 points de suture pour refermer la peau.
  14. Injecter atipamezole (1 mg / kg la concentration finale) pour revenir aux effets anesthésiants.
  15. Dès que la souris commence à respirer de manière autonome, prendre le tube de la trachée et de mettre la souris sur le côté droit. On prévoit que la souris pour récupérer en quelques minutes.
  16. Lorsque la souris se met à tourner et marcher, le placer dans la cage de récupération à chaud (petite cage IVC avec haut filtrée fermée) pendant une heure.
  17. Laissez les animaux la nuit dans une boîte chauffée contrôlée (37 ° C).
  18. Remplir un plat avec de l'eau et de la nourriture à granulés pour soutenir la reprise au cours des 2 premiers jours après la chirurgie.

Dix coeurs injectées avec des cellules et 10 coeurs contrôle pas injectés sont analysés histologiquement comme suit:

  1. Effectuer l'analyse des cellules greffées 1 semaine après l'injection (figures 1 et 3).
    1. Après euthanasie par une surdose d'isoflurane, perfuser les coeurs avec 20 ml de paraformaldéhyde 4% (PFA) pour fixer le tissu. Déshydrater le tissu fixé en pourcentage croissant de l'éthanol (à partir de 70-100%) et de l'intégrer dans des blocs de paraffine.
    2. Section des coeurs dans la paraffine avec un microtome à 5 um et tache avec de l'hématoxyline et de l'éosine pour l'analyse morphologique.
    3. Visualisez le tissu conjonctif à l'aide de colorant Trichrome de Masson.
    4. Analyser les images sous un microscope scanner de diapositives (figures 1A, 2A, 3A, 3B et 3C) et de visualiser l'ensemble du coeur en vue courte de l'axe à l'aide d'un microscope scanner de diapositives numériques (Figures 1B et 1C).
  2. Après les analyses ci-dessus, Déparaffiner les tissus cardiaques dans le xylène, réhydrater en immergeant les échantillons dans la diminution des pourcentages de l'éthanol (à partir de 100% d'eau) et le procédé de microscopie électronique à balayage (MEB) de la manière suivante:
    1. Incuber blocs déparaffinées avec de l'acide tannique à 1% dans 0,1 M de tampon phosphate pendant 1 h.
    2. Déshydrater les échantillons dans des pourcentages croissants d'éthanol (25-100%).
    3. Les échantillons secs avec HMDS (hexaméthyldisilazane).
    4. Montez les spécimens sur Stubbs avec Acheson Argent Dag et les enduire avec de l'or et de palladium.
    5. Voir les échantillons dans un microscope électronique à balayage analytique (Figure 2B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nous avons injecté des cellules HEK293, qui sont distinguables des cellules cardiaques par leur morphologie différente (figure 1), avec une forme de pavé par rapport aux cardiomyocytes allongés (Figure 1A). Cellules HEK293 ont été plus réactif à l'hématoxyline colorant (de couleur bleue) par rapport à des cardiomyocytes (de couleur rose), probablement en raison de leur contenu nucléaire augmenté (figure 1A). Pour distinguer en outre les cellules injectées à partir du tissu hôte, les cellules HEK293 ont été marqués avec DAPI 2 heures avant l'injection. -Les cellules marquées ont été visibles dans le tissu myocardique comme représenté sur la figure 1E. Souris opérés de manière fictive contrôle n'ont montré aucun dommage dans tout le cœur (figure 1C) et l'intégrité du tissu (figure 1D).

Dans l'ensemble en vue de l'axe court du cœur, des cellules injectées étaient visibles sous forme d'un groupe homogène dans la zone d'injection (figure 1B). Le c regroupésaunes étaient entourés d'une mince couche de tissu fibreux, qui est apparu comme une zone bleue dans la coloration trichrome (figure 2A). Les cellules n'ont pas été connectés avec le tissu du myocarde de l'hôte, comme montré par microscopie électronique à balayage (figure 2B), probablement en raison de leur fonction et non contractiles structure cellulaire différent.

En plus des observations ci-dessus, nous avons constaté de petites zones de dommages où l'aiguille a été injecté (figure 3A). Ces zones fonctionnent de la couche externe épicardique du coeur dans la paroi du myocarde (figure 3A). Cellules injectées (flèche verte, Figure 3B) sont présents à proximité de la zone lésée (flèches noires, figure 3B). Cellules DAPI-positifs étaient visibles le long du site de l'injection (figure 3C, flèches blanches). Une semaine après la blessure, le dosage Tunel n'a pas montré une augmentation des cellules apoptotiques au niveau du site de la blessure, ce qui suggère que la nécroseplutôt que de l'apoptose a eu lieu après l'injection de l'aiguille (figure 3D).

Figure 1
Figure 1. L'analyse histologique des cellules injectées. A) Une semaine après coeurs d'injection de cellules ont été inclus dans la paraffine et traitées à l'hématoxyline et à l'éosine. Cellules HEK293 injectées étaient présents dans la paroi du ventricule gauche. Les images ont été obtenues avec un microscope stéréo fluorescence. B) trichromes tissus colorés ont montré que les cellules ont été regroupées dans la même zone où ils ont reçu une injection (flèche). Panneaux en bas à droite montrent l'axe court voir avec le droit (VD) et les ventricules gauche (LV). Le rectangle rouge représente la zone où les cellules sont conservées (1.5X). Les images ont été enregistrées avec un microscope à balayage à glissière. C) trichrome stAining de coeurs opérés de manière fictive contrôle. Vue de tout coeur avec un objectif 5X. D) coloration au trichrome de souris opérés de manière fictive montrant l'intégrité du tissu myocardique. E) des cellules HEK293 ont été colorées avec du DAPI 2 heures avant l'injection. Une semaine après les coeurs d'injection ont été intégrés dans l'OCT et sectionnés dans un cryostat à 6 pm. Les cellules ont été visualisées sous UV dans un microscope à fluorescence. Ventricules gauche et droit sont présentés. Dans le ventricule droit, panneau de droite, la ligne blanche marque la couche épicardique. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. Formation d'une couche fibreuse entre les cellules injectées et les tissus de l'hôte. A) spectacle de coloration trichrometissu collagène formé entre des cellules HEK293 et ​​des tissus du myocarde murin (flèches). Les images ont été enregistrées avec un microscope à balayage numérique. B) coeurs ont été déparaffinées et traitées pour microscopie électronique à balayage. Les images ont été enregistrées avec un microscope électronique à balayage et montrent des fibres de collagène (flèches) entre les cellules HEK293 injectées (à gauche) et le myocarde hôte (côté droit). Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3
Figure 3. injection de cellules produit de petites zones de dégâts. A) trichrome coloration montre de petites zones de dommages où l'aiguille a été injecté (en bleu;. Flèches) B) sections de paraffine ont été colorées par trichrome staining et la zone où les cellules ont été injectées est indiqué par des flèches noires. Cellules injectées (flèche verte) étaient visibles à proximité de la zone lésée. C) des cellules HEK293, colorées avec du DAPI 2 heures avant l'injection, sont présents le long du site d'injection (flèche blanche). Le site d'injection est indiqué par une flèche verte et la ligne ouverte blanc marque la couche péricardique. D) Tunel test, effectué sur des coupes en paraffine, n'a pas montré de noyaux positifs fluorescentes pertinents. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dans ce manuscrit, nous avons montré comment effectuer l'injection intra-myocardique de cellules dans les coeurs de souris. Comme preuve de cette méthode, nous avons utilisé des cellules HEK293. Il est important de souligner que les cellules HEK293 sont pas utilisés dans une étude de thérapie cellulaire et donc les conclusions de ce manuscrit ne sont pas appropriés pour la traduction directe d'une approche thérapeutique. Cependant, le fait que les cellules HEK293 sont des cellules contractiles pas et ne transdifférencier pas dans d'autres types cellulaires attire l'attention sur les aspects techniques tels que les propriétés des cellules devant être prononcés et la voie d'administration.

Il a été rapporté qu'une voie intramyocardique a tendance à provoquer des amas de cellules intégrées dans le tissu cardiaque 24,26, tandis que la voie intracoronaire pourrait fournir une distribution plus homogène au niveau du site de lésion. Pour le remplacement des cardiomyocytes, la cellule donneuse idéale doit présenter l', properti structurelle et contractile électrophysiologiquees de cardiomyocytes et devraient être en mesure d'intégrer structurellement et fonctionnellement dans le tissu de l'hôte, ce qui suggère la nécessité d'un programme de différenciation des cellules d'être employé avant la transplantation.

Les points clés pour un succès de la chirurgie peuvent être résumées comme suit:

  1. Anesthésier les souris avec des composés injectables pour ralentir la fréquence cardiaque et de faciliter l'injection des cellules
  2. Effectuer une canule trachéale de souris pour favoriser la fonctionnalité des poumons.
  3. Effectuer thoracotomie éviter incision musculaire pour maintenir la fonctionnalité du muscle pectoral pour une respiration correcte.
  4. Après avoir exposé le cœur, observer le ventricule gauche sous un microscope pour visualiser si l'injection a eu lieu (visible comme une couleur pâle).
  5. Utilisation d'une aiguille fine et d'une seringue de précision pour éviter la perforation de l'étendue du tissu myocardique et pour injecter la quantité souhaitée de matériau, respectivement.
  6. Le fourreau de l'aiguille avec un système de tuyauterie plastique exposer oeul la partie de pointe. Cela permettrait l'introduction de l'aiguille à une profondeur spécifique dans le ventricule gauche (0,5 mm), ce qui évite l'injection dans la cavité ventriculaire.
  7. Fermez le coffre et l'espace entre les nervures soigneusement pour éviter l'exposition des poumons à la pression extérieure.

Cette technique a un niveau élevé de succès si les conditions de santé post-opératoires sont prioritaires. Les animaux doivent être suivies de près tous les jours jusqu'à une semaine pour des signes de détresse et de douleur. Injection de composés analgésiques pour contrôler la douleur doit être administré au besoin en post-opératoire. L'application topique de soulagement de la douleur, comme la lidocaïne, peut également être utilisé. La saignée doit être empêché par des techniques chirurgicales minutieuses. Cependant, si se produit, il peut être arrêté par la compression ou la ligature des vaisseaux. Nous avons constaté que les animaux se rétablissent mieux et plus vite si on les laisse dans une boîte de chauffage à 37 ° C pendant 12-20 heures après la chirurgie. Ce traitement permet de bloquer rapide diminution de la température corporelle, ninormalement survenant après intervention chirurgicale et l'administration de l'anesthésie. Infections post-chirurgicales peuvent se produire, mais doit être inférieure à 1%. Asepsie doivent être strictement suivies pour prévenir l'infection. Infection locale peut être traitée par l'application d'antibiotiques. Fait important, la déshydratation doit être contrôlée par injection sous-cutanée de solution saline.

Il est préférable d'administrer un anesthésique injectable sur inhalé, tel que l'isoflurane. En effet, nous avons observé que anesthésique injectable diminué rythme cardiaque, permettant l'injection plus facile et moins de saignements sans causer de l'inconfort des animaux.

Bien invasive, l'injection de petits volumes de cellules (25 à 50 pi) chez les souris est faisable et sûr. Nous avons eu une mortalité inférieure à 1% en injectant 50 pl de cellules HEK293 en 5 zones différentes de la paroi du ventricule gauche (10 pl / injection). Cette méthode assure la présence des cellules dans plusieurs zones de la paroi du myocarde, ce qui est important dansthérapie de cellules souches lorsque des zones étendues de lésions ischémiques doivent être atteint par les cellules livrés. Pour effectuer une chirurgie moins invasive, plusieurs protocoles ont récemment été publiés, bien que leur reproductibilité dans différents laboratoires doit encore être vérifiée. Par exemple, l'injection de cellules peut être réalisée par la technique de close-poitrine à l'aide de haute résolution échocardiographie 27. L'utilisation de ce système nécessite des compétences élevées de l'opérateur de visualiser clairement dans une image à deux dimensions de la paroi du ventricule gauche et de maintenir l'aiguille dans une position spécifique au cours de cycles de pression systolique / diastolique normale. L'avantage de cette technique est l'implantation des cellules dans le myocarde de souris à des emplacements désirés dans un laps de temps cliniquement pertinente après l'infarctus du myocarde induction. Cependant, cette approche n'est pas possible avec les procédures de chirurgie comme l'induction de l'infarctus du myocarde ou bandes transaortique en raison de la hausse de la mortalité des animaux subissant une deuxième opération 27. Fait intéressant, Hamdi et ses collègues ont comparé l'injection intra-myocardique directe contre la livraison de cellules dans un Gelfoam construire sur la zone épicardique 28. Ils ont observé que la superposition de la cellule construire sur l'épicarde abouti à une meilleure fonctionnalité du greffon par rapport à l'injection de cellules intramyocardique et indiqué que cette technique est reproductible, et moins traumatisante pour les animaux 28 convivial.

Une caractéristique importante des expériences d'injection de la cellule est le traçage des cellules et leur survie. Nous avons montré que les cellules HEK293 sont faciles à détecter en raison de leur morphologie distinguable par rapport à des cellules cardiaques. Ces cellules ont survécu à l'injection (données non présentées) et ont été maintenues dans le tissu, une semaine après la chirurgie. Pour tracer les cellules pour des études à long terme et d'analyser leur greffe dans le tissu de la livraison ainsi que dans d'autres tissus, plusieurs techniques sont utilisées, y compris le marquage fluorescent et un FISHnalyse des rapports sexuels non-concordance transplantation expériences 29. Surtout, l'imagerie in vivo jouera un rôle majeur vers analyses in vitro dans de futures études. En effet, un des avantages de l'imagerie in vivo par rapport aux méthodes histologiques est le suivi des cellules dans des études longitudinales chez les mêmes animaux, sans la nécessité de l'euthanasie 29. Dans cette méthode, les cellules peuvent être marquées avec des réactifs de bioluminescence, des particules de fer, et des gènes rapporteurs spécifiques à imager avec la tomographie par émission de positons (TEP) et la résonance magnétique (IRM).

Nos analyses ont montré que les cellules non contractiles telles que des cellules HEK293 préférentiellement regroupés dans la zone où ils ont reçu une injection entouré par un tissu collagénique mince. Bien que les mécanismes physiopathologiques conduisant à la formation du tissu fibreux dans une immunodéplétion souris ne sont pas connues, le tissu collagène visible autour des cellules transplantées peut être comparable à l'extrémité d'uneImplant compatible avec les tissus. Dans ce cas, le matériau exogène ne peut pas être éliminé par les cellules inflammatoires et devient encapsulé dans une couche dense de tissu conjonctif fibreux, qui l'isole des tissus environnants. De même pour les phases au stade terminal de la cicatrisation des plaies, ce tissu granulaire est très vascularisé et assure la survie du matériau implanté.

Techniquement, le procédé décrit ici a été un succès, bien que l'injection de l'aiguille intra-myocardique produit une petite zone de détérioration du tissu environnant. Bien que les mesures de la fonction cardiaque n'étaient pas le but de cet examen, les études futures devraient examiner si les dommages de tissu mineur peut perturber les analyses de thérapie cellulaire. En outre, il serait important d'analyser si la blessure produite dans la zone de l'injection est provoquée par l'aiguille, par la quantité de cellules injectées ou par une combinaison des deux.

A l'appui de nos constatations, il a été montré que transplantation des populations mixtes de cellules différenciées souches embryonnaires humaines (CSEh) contenant 20-25% des cardiomyocytes (CSEh-CM) dans le coeur en bonne santé de souris immunodéficientes (NOD-SCID) a donné lieu à la formation rapide de greffons dont les cardiomyocytes sont devenus organisés et mûri au fil du temps et de la population noncardiomyocyte a été perdu 23. Fait intéressant, les auteurs ont observé que les CSEh-CM ont été largement isolé du myocarde hôte par une couche de tissu fibreux qui a empêché la formation d'un syncytium électrophysiologique 22,23. Dans une autre étude, Kehat et al. Constaté que les CSEh-CM arpenté avec succès le ventricule chez les porcs avec un bloc cardiaque complet. Cette étude a montré que les cellules transplantées ont survécu, ont fonctionné, et intégrés avec les cellules hôtes, fournissant la preuve de leur capacité à fonctionner comme une alternative biologique au stimulateur électronique 30. Ces deux résultats discordants peuvent être conciliés par la différence dans la structure et la fonction des host et espèces de donateurs. En effet, il est possible que l'efficacité du couplage de cardiomyocytes transplantés peut dépendre de la fréquence de battement par rapport des cellules hôtes et des donneurs. Dans l'étude de Van Laake 23, la formation de jonctions fonctionnelles pourrait être compromise en raison de la différence de fréquence de battement des cardiomyocytes humains (60-100 bpm) par rapport cardiomyocytes de rongeurs (300-600 bpm). Ce ne serait pas le cas chez l'homme par rapport à des expériences de transplantation porcins, comme décrit dans l'analyse Kehat 30.

La durée d'observation est un autre facteur de confusion. CSEh-CM transplanté dans le coeur de rongeurs après un infarctus du myocarde induit la fonction cardiaque amélioration seulement pour les points de temps à court terme (4 semaines). Cependant, à 12 semaines, la fonction cardiaque n'a pas été davantage soutenue malgré la survie du greffon 23. Les auteurs ont observé que la taille du greffon (augmentation de la quantité de cellules) n'a pas été associée à une amélioration de surv cardiaque à long termeival et amélioration fonctionnelle 31, ce qui indique que des analyses à long terme par rapport aux analyses à court ou à moyen terme doit être effectuée dans les études futures sans exiger l'augmentation du nombre de cellules pour injection.

Dans la présente étude, plusieurs questions demeurent concernant le type de cellules à transplanter, la sélection des espèces hôte donateurs à tester et une évaluation détaillée du potentiel arythmique des cellules. Idéalement, les cellules souches implantées dans le myocarde pour le remplacement ou la fonction de stimulateur cardiaque doit fonctionnellement couple avec les myocytes restants. Dans un modèle de rat de l'infarctus du myocarde, Fernandes et al. 32 utilisé Stimulation électrique programmée (PSE) pour évaluer l'arythmie sensibilité, montrant une inductibilité accrue des arythmies ventriculaires dans les cœurs de myoblastes injectés par rapport aux témoins. Dans cette même étude, les injections de cellules autologues dérivées de la moelle osseuse n'ont pas abouti à une augmentation inducibillité des arythmies ventriculaires par rapport aux témoins, ce qui conduit les auteurs à conclure que les myoblastes exposés un risque arythmogène spécifique. Dans une autre étude, des cellules dérivées de la moelle osseuse (BMC) de manière efficace greffés en grappes dans la cicatrice de l'infarctus ou de la zone frontalière, mais n'a montré aucune électroniquement évoqué Ca transitoires 33. Fait intéressant, Wei et al. Ont montré que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) n'acquièrent pas les propriétés électrophysiologiques des cardiomyocytes matures au cours de la période de survie dans le cœur infarctus. Cependant, ils peuvent atténuer la vulnérabilité électrique et ne pas favoriser des arythmies ventriculaires 34.

L'efficacité et la survenue d'une arythmie thérapie de cellule souche dépend des cellules, ainsi que sur les routes de livraison. En effet, dans les cœurs de rat après MI 35, injections intramyocardiques BMC, bien que l'amélioration de la fonction cardiaque, a augmenté ventriculaires contractions prématurées consécutives et ventriculaire tachycardia pour les 14 premiers jours. Lorsque la voie intracoronaire a été utilisé, ventriculaire survenue d'arythmie a été nettement diminué. Dans les études cliniques, la fonction pro-arythmique de cellules injectées est difficile à évaluer car la plupart des patients reçoivent les agents bêta-bloquants comme indiqué pour les cardiopathies ischémiques. Le traitement par bêta-bloquants peut masquer un effet pro-arythmique potentiel des cellules transplantées. Les études animales sont donc crucial d'évaluer les bases de stimuli pro-arythmiques de la thérapie de cellules souches.

En résumé, nos données démontre la faisabilité de intramyocardique cellule-injection chez la souris, mais aussi met l'accent sur la nécessité d'une analyse détaillée sur les conditions de la greffe de cellule de sécurité. Chez l'homme, il a été montré que l'injection des cellules est associée à une pro-arythmie 36-38, la resténose 39, 40 l'athérosclérose accélérée, et l'obstruction coronaire 41. La recherche fondamentale sera important à l'avenir de l'application cliniquecations pour comprendre quelles cellules doivent être livrées, le mode de livraison, les mécanismes de réparation de l'infarctus fonction à médiation cellulaire, et la conception d'une allogreffe versus autogreffe de protocole de transplantation de cellules qui bénéficient à toute la population humaine. En raison des coûts élevés associés à d'importants essais cliniques, l'efficacité et la reproductibilité de l'efficacité des protocoles de transplantation doit être traitée dans des modèles pré-cliniques tels que ceux décrits ici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions le Yacoub Institut Magdi (IPR) pour appuyer les analyses de microscopie et les projets impliquant la réparation cardiaque, les techniciens et le directeur de notre animalerie. Ce travail a été soutenu par la British Heart Foundation (BHF), subvention de projet PG/10/019. MPS est soutenu par le IPR et BHF. TP est un Fellow excellence BHF-recherche. NR est un NH & MRC Australie Fellow.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolator Pfi systems Quotation needed
Heating Pad Vet Tech Solutions HE006 For small animals
Medetomidine National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Ketamine hydrochloride National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Atipamezole National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream commercial shops
Buprenorphine NVS Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope Leica Model S6E With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner Hamamatsu RS series
Scanning Electron Microscope Jeol JSM-6610
Blunt scissors FST 14084-09
Minivent Harvard Apparatus 73-0043 Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps FST 11052-10
Retraction system FST 18200-20 Kit for animals up to 200 g
30 G 12 mm; ½ inch BBraun A210 Fine yellow
Microliter syringe ESSLAB 81201 Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700
6-0 Silk suture Ethicon W1614T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
  2. Taylor, D. A., et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929-933 (1998).
  3. Suzuki, K., et al. Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation. 104, 207-212 (2001).
  4. Suzuki, K., et al. Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function. Circulation. 110, 225-230 (2004).
  5. Robinson, S. W., et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant. 5, 77-91 (1996).
  6. Muller-Ehmsen, J., et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 107-116 (2002).
  7. Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
  8. Dimmeler, S., Zeiher, A. M., Schneider, M. D. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J. Clin. Invest. 115, 572-583 (2005).
  9. Oettgen, P., Boyle, A. J., Schulman, S. P., Hare, J. M. Cardiac Stem Cell Therapy. Need for Optimization of Efficacy and Safety Monitoring. Circulation. 114, 353-358 (2006).
  10. Krause, K., et al. Percutaneous intramyocardial stem cell injection in patients with acute myocardial infarction: first-in-man study. Heart. 95, 1145-1152 (2009).
  11. Rodrigo, S. F., et al. Intramyocardial injection of bone marrow mononuclear cells in chronic myocardial ischemia patients after previous placebo injection improves myocardial perfusion and anginal symptoms: an intra-patient comparison. Am. Heart J. 164, 771-778 (2012).
  12. Smith, R. R., et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation. 115, 896-908 (2007).
  13. Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 2, 173-181 (2009).
  14. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
  15. Malliaras, K., et al. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Circulation. 125-1100 (2012).
  16. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, 763-776 (2003).
  17. Bearzi, C., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15885-15890 (2009).
  18. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, 2369-2379 (2012).
  19. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, 895-904 (2012).
  20. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, 1847-1857 (2011).
  21. Brunt, K. R., Weisel, R. D., Li, R. K. Stem cells and regenerative medicine - future perspectives. Can. J. Physiol. Pharmacol. 90, 327-335 (2012).
  22. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  23. van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem Cell Res. 1, 9-24 (2007).
  24. Leobon, B., et al. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7808-7811 (2003).
  25. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, 2419-2429 (2010).
  26. Reinecke, H., Poppa, V., Murry, C. E. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 241-249 (2002).
  27. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, 1307-1314 (2005).
  28. Hamdi, H., et al. Cell delivery: intramyocardial injections or epicardial deposition? A head-to-head comparison. Ann. Thorac. Surg. 87, 1196-1203 (2009).
  29. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marban, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circ. Res. 106, 479-494 (2008).
  30. Kehat, I., et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
  31. van Laake, L. W., et al. Improvement of mouse cardiac function by hESC-derived cardiomyocytes correlates with vascularity but not graft size. Stem Cell Res. 3, 106-112 (2009).
  32. Fernandes, S., et al. Autologous myoblast transplantation after myocardial infarction increases the inducibility of ventricular arrhythmias. Cardiovasc. Res. 69, 348-358 (2006).
  33. Scherschel, J. A., Soonpaa, M. H., Srour, E. F., Field, L. J., Rubart, M. Adult bone marrow-derived cells do not acquire functional attributes of cardiomyocytes when transplanted into peri-infarct myocardium. Mol. Ther. 16, 1129-1137 (2008).
  34. Wei, F., et al. Mesenchymal stem cells neither fully acquire the electrophysiological properties of mature cardiomyocytes nor promote ventricular arrhythmias in infarcted rats. Basic Res Cardiol. 107, 274 (2012).
  35. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  36. Bartunek, J., et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 112, 178-183 (2005).
  37. Britten, M. B., et al. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation. 108, 2212-2218 (2003).
  38. Smits, P. C., et al. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2063-2069 (2003).
  39. Kang, H. J., et al. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 363, 751-756 (2004).
  40. Fernandez-Aviles, F., et al. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res. 95, 742-748 (2004).
  41. Vulliet, P. R., Greeley, M., Halloran, S. M., MacDonald, K. A., Kittleson, M. D. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 363, 783-784 (2004).
Intramyocardique cellulaire livraison: Observations aux coeurs murins
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (83), e51064, doi:10.3791/51064 (2014).More

Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (83), e51064, doi:10.3791/51064 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter