Medicine

心筋内細胞送達：マウスハーツの観測

Published: January 24, 2014 doi: 10.3791/51064

Tommaso Poggioli^1,2, Padmini Sarathchandra^1,2, Nadia Rosenthal^2,3, Maria P. Santini^1,2

¹Magdi Yacoub Institute, Imperial College London, ²National Heart and Lung Institute, Imperial College London, ³Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

例えば、高血圧または心筋梗塞などの心血管疾患のマウスモデルにおける心筋細胞送達は、回生広く研究において、異なる細胞型の治療可能性を試験するために使用される。そのため、詳細な説明およびこの外科処置の明確な可視化は、小型げっ歯類の心血管細胞治療の分析の限界と利点を定義するのに役立ちます。

Abstract

以前の研究は、細胞送達は、サイトカインおよび心臓組織の血管再生および細胞生存を増加させる因子の放出によって心機能改善を促進することが示された。また、さらなる観察は、例えば、心臓幹細胞、間葉系幹細胞およびcardiospheresなどの特定の幹細胞は、心筋細胞、平滑筋細胞および内皮細胞に分化することによって周囲の心筋層内に統合する能力を有していることが明らかになった。

ここでは、確実に免疫枯渇マウスの左心室壁への非収縮細胞を送達するための材料および方法を提示する。この顕微手順の顕著なステップは、麻酔および鎮痛注射、気管内挿管、胸を開いて、無菌の30ゲージの針、精密マイクロリットル注射器で細胞の心と配信を露出させるために、切開を伴う。

心臓収穫、embeddiからなる組織処理NG、切片および組織学的染色は、心筋内細胞注入は、小さな心外地域の被害だけでなく、心室壁にを生成することを示した。非収縮細胞は、免疫不全マウスの心筋壁に保持され、心臓の圧力と機械的負荷から保護する可能性線維性組織の層に囲まれた。

Introduction

様々な細胞送達プロトコルは、ヒト患者におけるこの実験手順の効率を翻訳し、有効性及び安全性を目的とした心血管疾患のマウスおよびラットモデルにおいて試験されている。ラット心臓順行³と逆行⁴冠動脈内の細胞注入でも使用することができるのに対し、小型のげっ歯類の心の中で、心筋内細胞送達は、細胞送達^1,2の最も実現可能な方法である。どちらの方法も限界と利点を持っている。冠動脈内経路を介して細胞送達は、グローバルセル³普及^を促進する上で直接的な筋肉内注射の理論上の利点を有するが、それはまた、冠動脈塞栓^3,5を引き起こす危険性を有している。心筋内配達の制限事項は、機械的な損傷、急性炎症、および心筋障害^6,7に関連している。ヒトでは、心臓の修復のための細胞は、心内膜または外科心外膜を通して心筋内注射によって送達されるアプローチまたは冠動脈内動脈ルート⁸による。経血管経路による注射は、急性心筋梗塞および再灌流心筋症患者に適しているが、完全閉塞や影響領土⁹の血管内であまり流れの場合にはできないことがあります。経心または経心外膜注入による心室壁への直接注入は、患者の健康状態に応じて技術的に可能である。実際、経心外膜注射用開胸手術が必要であり、経心ための実行可能な虚血または心筋瘢痕⁹の部位を区別するために必要とされる各患者の電気生理学的マッピングに近づくが、この技術は^、10,11安全であることが示されている。

重要なのは、細胞治療の研究に移植するための最良のセルの選択は、調査中です。短期分析（4週間）は、心臓幹細胞の注入がcardiospheresとして定義することを示した13サイドポピュレーション細胞瘢痕の大きさおよび細胞死を減少させることによって、心筋梗塞のマウス¹⁴及び¹⁵のモデルラットにおける心機能回復を誘導した。免疫抑制なしのラットの心筋梗塞モデルにおけるcardiospheresの同種移植は、心臓の再生を促進し、安全であることが判明し、内因性の修復機構¹⁵の刺激により心機能を改善しました。心の中Lin-/c-kit +大人の前駆細胞は、in vitroおよびin vivoで自己再生、クローン原性、および多能であることが示され、虚血性ラットの心臓に注射した場合には、障害を受けた心筋壁¹⁶の大部分を再構成していたた導電性の中間サイズの冠状動脈^17を形成する能力。これらの有望なデータがフェーズを煽っIおよびヒトにおけるII臨床試験：自己および同種間葉系幹細胞^（MSC）18の注入は^、19を cardiospheresまたはc-Kitの陽性心臓幹細胞（CSC）虚血性心臓におけるヒト20それぞれは、長期試験において、心機能に有益な効果を示した。それにもかかわらず、大規模な長期追跡及び遡及的メタ分析は、幹細胞療法はなく、予測不可能な結果²¹の範囲内の他、一部の患者に有意な利益を提供することを実証した。それは、これらの制限は、各個人や各疾患のための細胞送達の特定のプロトコルの設計を必要とする可能性があります。

マウスおよびラットモデルにおいて、長期的な研究は、細胞注射は、さらに（12ヶ月）の心機能を改善しなかったことを明らかにした。実際に、ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞（hESCの-CM）の移植片は主として線維性組織^22,23の層によって宿主心筋から単離した。同様の結果は、梗塞マウス²⁴の中心部に骨格筋芽細胞の心筋内移植後に観察されている。 FurthermoRE、梗塞中心部に機能を維持するために、同種のMSCの長期的な能力は、分化²⁵の後に免疫特権の免疫原性状態への遷移によって制限されてきた。

考察上記で概説した課題と展望を考慮して、我々は、マウスの心筋内注射することによって細胞を送達する方法をここに表示されます。我々は心筋細胞収縮特性のない細胞を宿主の心筋に接続されており、薄い線維性バリアで凝集塊を形成していないことを確認します。いくつかのケースでは、この結果が有利であり得るが、以下の分析は、細胞移植は、同様に機能的に接続された心筋の構造を生成するために変調することができる方法を理解するのに有用であり得る。

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Protocol

すべての動物実験は、国際（欧州議会の指令2010/63/EU）と国家（英国内務省、アクト1986）規制に準拠して行った。本明細書に記載の手順は、英国のライセンス当局の下での作業の我々の計画の一部であり、記録の目的のために行われていない。

1。細胞の調製

このプロトコルは、デモ用の特定の細胞株（ヒト胎児腎臓HEK293細胞）の調製を記載する。細胞特異的なプロトコルは、成長して、最終的には、特定の細胞系統に分化多能性または成体幹細胞を区別するために使用されなければならない。

DMEM培地（高グルコース、4,500ミリグラム/ L）中の細胞を、1％ピルビン酸ナトリウム、2mMグルタミン、1％の抗生物質ペニシリン/ストレプトマイシン及び10％ウシ胎児血清（FBS）を含有する成長する。一つの10cmプレートは通常、午前1時03分で分割されるべきであり、メディアは2日ごとに新鮮な補足。
trypsで穏やかに細胞を処理1：01に記載されるようにDMEM培地で1×に再懸濁した。
血球計数器チャンバー内の細胞をカウントし、別のチューブに3×10 ^6個の細胞を収集します。
5分間100グラムで、スイングバケットローターで遠心分離する。
上澄み液を捨て、滅菌したリン酸緩衝液2倍で細胞ペレットを洗浄する。
免疫除去したマウスの左心室に注入するための10 50分の⁶ ULの濃度でPBS 1X中に再懸濁します。

2。手術前の条件

各手術前に、温度制御されたアイソレータ（表1 22℃）で、滅菌食物ペレットと水で免疫除去マウス（NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD）を維持する。
層流フードの下免疫除去したマウスの手術を行う。 70％エタノールで作業領域をきれいにし、手術器具（鉗子やハサミ）をオートクレーブ。
手術と回復のための加熱パッドをオンにします。加熱パッドは重要です中に発生した体温の低下および術後を遮断する。
リカバリー·加熱パッド上にきれいにし、オートクレーブケージを置きます。
無菌オートクレーブ処理袋に手術室にアイソレータから元のケージでマウスを輸送する。
マウスを秤量し、体重に従って注入皮下（sc）投与メデトミジンおよびマウスを麻酔するために0.9％滅菌生理食塩液で希釈した塩酸ケタミンを含有する溶液、ならびに（筋肉組織を緩和するメデトミジン1 mg / kgを、塩酸ケタミン75 mg / kgで）。
完全に麻酔をかけたときに（刺激した後、1〜2分以内にごつま先ピンチ反射を）ケージからマウスを削除しない
胸の左側にある脱毛クリームとスロート面積が適用されます。適切な時間（約2〜5分）した後、水に濡れたティッシュで緩い毛を乾いた布で拭き取ってください。
仰臥位での手術パネル上にマウスを置きます。から外科医の視点位置は、テールダウンヘッドアップ垂直である。
後肢皮下に無菌生理食塩水（ブプレノルフィン）で希釈した0.1〜0.2μgの/ gで鎮痛ソリューションを注入し、綿棒を使用して無菌性溶液のポビドンヨードで剃毛面積をカバーしています。
スロート面積に顕微鏡（2.5X目標を）集中する。

3。外科的条件

鈍ハサミで少し輪状軟骨の下に約0.5〜cm長さの正中線腹部皮膚切開を行います。唾液腺を視覚化するために結合組織から皮膚を分離する。
同時に鉗子と磁気胸のリトラクターで各パーツの方に引いて、自然の中線部門での唾液腺を分割し、気管を公開します。
喉頭を公開する側にゆっくりと舌を引っ張る。慎重に気管内に挿管チューブをスライドさせます。チューブの先端が表示されたLを通して見えるarynxと気管。チューブには、しかしはっきりと見えない場合に重要なことに、それは、食道内にある。それを削除して、管の先端の位置を変更してください。
通風機にチューブを接続します。 200μLおよび150ストローク/分で拍出量を設定します。テープで手術パネルの通気チューブを固定します。
鈍ハサミとピンセットで、ヘッド1に垂直尾翼を作る - 左胸部領域の上1.5センチ、長皮膚切開する。
切開を加えずに、結合組織/筋肉層から皮膚やメジャーとマイナーの胸の筋肉を緩めます。
以下のように第三及び第四肋骨の間開胸を行います。
1. つまんで小さくて丸みを帯びたピンセットで引っ掻いて肋間筋層を穿孔。
2. 肋間筋層が穿孔された後、最大限に胸腔を開くために胸のリトラクターを配置。その上層の耳介（心房）と左心室（LV）の上部及び中央部である今見える。
細胞を用いた高精度のシリンジを準備します。注射器は、それぞれの注射のために10のULの容積の量を送達することができるはずです。注射器の先端に30ゲージ針をキャスト。
針の開口先端を含む露出のみ1ミリメートルを残して、テープで針上（introcan-W 20 Gから）小さなプラスチック製のカニューレを固定します。これは全体の左心室壁を穿孔し、左心室腔に細胞を注入し、針を防ぐことができます。
5Xの目的の助けを借りて、この倍率で左心室を視覚化し、5つの異なる場所（各注入注入106個、合計10 ULをお届けします）での左心室壁に細胞を注入します。注入が成功した場合は、白い領域と、細胞の主要な逆流がないことは、（注入が成功しなかった場合、動物は、機能分析から除外されます）表示されます。
開創器を取り外します。胸壁Bを閉じます6-0絹縫合糸の2針を持つ2つの別々のリブを囲むY。
PBS 1Xでびっしょり綿棒で胸筋と皮膚に潤いと静かにピンセットで元の位置に筋肉を置く。
6-0絹縫合糸の縫い目3-4で皮膚を閉じます。肌を閉じるには、2〜3ステッチと喉の切開を縫合。
麻酔の効果を元に戻すアチパメゾール（1 mg / kgの最終濃度）を注入。
とすぐにマウスが自律的に呼吸を開始すると、気管からチューブを取り出して、その右側にマウスを置く。マウスを数分以内に回復すると予想されています。
マウスを回して歩いて、時間暖かい回復ケージ（クローズドフィルタートップと小さなIVCケージ）に入れて起動すると。
制御加熱箱（37℃）中で一晩、動物を残す。
手術後の最初の2日間は、回復を支援するために水とペレット食物と一緒にお皿を埋める。

次のように細胞と10コントロール注入されていない心を注入十心臓は組織学的に分析されています。

1週間の注入（ 図1、図3）の後に移植された細胞の分析を実行します。
1. イソフルランの過剰投与により安楽死させた後、組織を固定し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）20mlで心臓を灌流。（百分の70から100）のエタノールの割合を増加させるのに固定された組織を脱水し、パラフィンブロックに埋め込む。
2. 形態素解析のためにヘマトキシリンおよびエオシンで5ミクロンとシミにミクロトームでパラフィンセクションの心を。
3. マッソントリクローム染色を使用して結合組織を可視化する。
4. スライドスキャナ顕微鏡像（ 図1A、2A、3A、3B、および3C）を分析し、デジタルスライドスキャナ顕微鏡を用いて短軸像で心臓全体を視覚化する（ ふぃぎゅ解像度1Bおよび1C）。
以下の上記の分析の後、キシレン中に心臓組織を脱パラフィン、（100％の水）エタノールの割合を減少させるに試験片を浸漬することによって再水和すると、走査電子顕微鏡のための処理（SEM）として：
1. 1時間、0.1 Mリン酸緩衝液中の1％のタンニン酸で脱パラフィンブロックをインキュベートする。
2. （25から100まで%）エタノールの割合を増やすことで標本を脱水。
3. HMDS（ヘキサメチルジシラザン）で乾燥したサンプル。
4. アチソンシルバーダグと金 - パラジウムでコーティングしてとスタッブス上の標本をマウントします。
5. 分析走査型電子顕微鏡（ 図2B）のビューのサンプル。

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Representative Results

我々は、細長い心筋細胞（ 図1A）と比較して、玉石状に、それらの異なる形態（ 図1）により心臓の細胞から区別可能であるHEK293細胞を注射した。 HEK293細胞は、それらの増加、核コンテンツ（ 図1A）の可能性が高い心筋細胞（ピンク色）と比較して、ヘマトキシリン色素（青色）に、より反応性であった。さらに、宿主組織から注入された細胞を区別するために、HEK293細胞を、注射前にDAPIで2時間標識した。 図1Eに示すように、標識された細胞は、心筋組織に見られた。対照偽手術マウスは、心臓全体（ 図1C）、および組織（ 図1D）の整合性には損傷は認められなかった。

心の全体の短軸像では、注入された細胞は、注射の面積（ 図1B）において均一グループとして見ることができた。グループ化されたCのエルは、トリクローム染色（ 図2A）の青色の領域として現れた線維性組織の薄い層によって囲まれていた。走査型電子顕微鏡（ 図2B）、それらの非収縮機能やさまざまな細胞構造への可能性によって示されるように、細胞を宿主の心筋組織と接続されていませんでした。

上記の観察に加えて、我々は、針が（ 図3A）を注入した被害の小さな領域を指摘した。これらの領域は、心筋壁への心の外部心外膜層（ 図3A）から実行。注入した細胞（緑色の矢印、 図3B）は、損傷部位（黒矢印、 図3B）の近傍に存在している。 DAPI陽性細胞は注射部位（ 図3C、白矢印）に沿って見えた。一週間損傷後、TUNELアッセイは、壊死を示唆し、損傷部位で増加したアポトーシス細胞を示さなかったのではなく、アポトーシスは、針注射（ 図3D）の後に発生しました。

図1。注入された細胞の組織学的分析。細胞注射の心臓をパラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色のために処理したA）One週間後。注入されたHEK293細胞を、左心室の壁に存在した。ステレオ画像は、蛍光顕微鏡を用いて得た。B）トリクローム染色した組織細胞は、それらが注入された同一の領域（矢印）にグループ化されたことを示した。右下のパネルには、短軸が右（RV）および左心室（LV）を表示するには、show。赤い四角は、細胞が保持されている領域（1.5倍）を示している。画像は、スライド走査顕微鏡を用いて記録した。C）三色目対照偽手術心のaining。 5X目的で心臓全体を望む。D）は 、心筋組織の完全性を示す偽手術マウスのトリクローム染色、E）HEK293細胞を、注射前にDAPI 2時間で染色した。注入心臓を6μmと10月中に包埋し、クリオスタットで切断した一週間後。細胞は、蛍光顕微鏡でUV下で可視化した。左心室と右心室が示されている。右心室、右のパネルでは、白い線が心外膜層をマークします。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図2。注入された細胞と宿主組織との間に線維性層を形成。 A）トリクローム染色ショーHEK293細胞およびマウスの心筋組織（矢印）との間に形成されるコラーゲン組織。画像は、デジタル走査型顕微鏡を用いて記録した。B）ハーツを走査型電子顕微鏡のために脱パラフィン処理した。画像は走査型電子顕微鏡で記録され、注入されたHEK293細胞（左側）とホスト心筋（右側）との間にコラーゲン線維（矢印）を示した。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図3。細胞注射は、損傷の小さな領域を生成した。。B）パラフィン切片をトリクロームSTAによって染色された矢印）、A）トリクローム染色は、小さな針を注射した被害の区域（青色を示していますining、細胞を注入した領域は黒矢印で示されている。注入された細胞（緑の矢印）は、損傷領域の近傍に見えた。2時間前に注射DAPIで染色C）HEK293細胞を、注射部位（白矢印）に沿って存在した。注射部位は、緑の矢印で示され、白のオープンラインが心膜層をマークします。D）パラフィン切片上で行わトゥネルアッセイ、関連する蛍光陽性核を示さなかった。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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Discussion

本稿では、我々は、マウスの心の中の細胞の心筋内注入を実行する方法が示されている。この方法論の証明として、我々は、HEK293細胞を使用している。これは、HEK293細胞は任意の細胞治療研究では使用しないので、この原稿の知見は治療的アプローチへの直接変換のための適切ではないことを強調することが重要である。しかしながら、HEK293細胞は収縮性細胞ではなく、他の細胞型に分化転換しないという事実は、例えば、送達される細胞の性質および送達経路のような技術的側面に着目した。

これは、冠動脈内経路は、損傷部位でのより均一な分布を提供することができ、一方、心筋内経路は、心臓組織^24,26内に埋め込まれた細胞クラスターを引き起こす傾向があることが報告されている。心筋細胞の交換のために、理想的なドナー細胞は、電気生理学的、構造的、収縮propertiを示すべきである心筋細胞のエスとは、移植前に使用されるべき細胞分化プログラムの必要性を示唆し、宿主組織への構造的および機能的に統合することができるべきである。

次のように成功した手術のための重要なポイントに要約することができる。

心拍数を遅くし、細胞の注入を容易にするために、注射可能な化合物でマウスを麻酔
肺の機能を優先するようにしたマウスの気管内挿管を行う。
正しい呼吸胸筋の機能を維持するために筋肉の切開を避け開胸行う。
心を暴露した後、注射は（淡い色として見える）が発生したかどうかを可視化するために、顕微鏡下で左心室を観察します。
心筋組織の広範囲の穿孔を避けるために、細い針、精密シリンジを使用して、それぞれ所望の量の材料を注入すること。
Oさらすプラスチック管システムと針をシースを先端部をnly。これは、心室腔への注射を回避すること、左心室（0.5 mm）の中に特定の深さまで針の導入を可能にするであろう。
外圧に対する肺の露出を避けるために、慎重に肋骨の間の胸やスペースを閉じます。

術後の健康状態を優先している場合、この技術は、成功の高いレベルを有している。動物は、集中的に苦痛と痛みの兆候が週に毎日アップする監視されなければならない。手術後に必要に応じて、痛みを制御するために、鎮痛化合物の注射が投与されなければならない。リドカインなどの鎮痛、局所適用は、使用してもよい。出血は慎重に外科的技術によって防止されるべきである。しかし、発生する場合は、それが血管の圧縮またはライゲーションにより停止することができる。私たちは、動物が手術後12から20時間、37℃で加熱ボックスに残っている場合より良く、より速く回復していることを指摘している。この処理は、迅速な体温低下を阻止、またうマリーは、麻酔の外科手術手順および投与後に起こる。手術後の感染症が発生することがありますが、1％未満でなければなりません。無菌の手順は厳密に感染を防ぐために従わなければならない。局所感染は、抗生物質の適用により治療することができる。重要なのは、脱水は、生理食塩水を皮下注射することにより制御されるべきである。

それは、イソフルランなどの吸入麻酔薬の上の注射用投与することが好ましい。実際、我々は、注射麻酔が動物の不快感を引き起こすことなく、より簡単に注射し、少ない出血を可能にハートビートを減少させたことを観察した。

浸潤性が、マウスでは細胞の小容量（25〜50μL）の注入は実現可能で安全です。我々は、左心室壁（10μlの/注射）の5つの異なる領域にHEK293細胞を50μl注入することによって、1％未満の死亡率であった。この方法は、上で重要である心筋壁のいくつかの領域における細胞の存在を確保する虚血性障害の拡張領域が送達細胞によって到達する必要がある場合に幹細胞治療。異なる実験室での再現性がまだ確認されていませんが、低侵襲手術を行うためには、いくつかのプロトコルは、最近、発表されている。例えば、細胞注入は、高解像度の心エコー^27を用いて近接胸部技術によって行うことができる。このシステムを使用すると、2次元画像でははっきりと左心室の壁を視覚化するために、通常の収縮期/拡張期サイクルの間に特定の場所に針を維持するために高いオペレータのスキルが必要です。この技術の利点は、心筋梗塞誘導後の臨床的に関連する時間枠内で所望の位置にマウス心筋への細胞の移植である。しかし、このアプローチは、そのようなので、第2の操作^2を受けている動物の死亡率の増加の心筋梗塞誘導やtransaorticバンディングなどの手術の手順では不可能です7。興味深いことに、ハムディらはゲルフォーム心外膜領域²⁸上に構築中の細胞の送達に対する直接的な心筋内注入を比較した。彼らは、心筋内細胞注入と比較して、細胞が心外膜上に構築重ねることは、より良い移植片機能をもたらしたことを観察し、この技術は再現性があることを報告し、ユーザーフレンドリーな、と動物²⁸にはあまり外傷性。

細胞注入実験の重要な特徴は、細胞およびそれらの生存のトレースである。我々は、HEK293細胞が心臓細胞と比較して、それらの区別可能な形態に検出が容易であることが示されている。これらの細胞は、注射を生き延びた（データは示さず）、手術後1週間の組織内に保持した。長期試験のための細胞を追跡し、配信の組織中、ならびに他の組織におけるその生着を分析するために、いくつかの技術は、蛍光標識およびFISH aを含め、使用されているセックス不一致移植実験²⁹ nalysis。重要なのは、 生体内イメージングで今後の研究で分析して生体外に向けて重要な役割を果たします。実際に、組織学的方法を超えるin vivoイメージングの一つの利点は^、29安楽死を必要とせずに、同じ動物における長期的研究における細胞の追跡である。この方法では、細胞は、生物発光試薬、鉄粒子、及び陽電子放出断層撮影（PET）及び磁気共鳴（MRI）を用いて画像化されるべき特定のレポーター遺伝子でマークすることができる。

私たちの分析は、このようなHEK293細胞のような非収縮細胞が優先的に彼らが薄いコラーゲン組織に囲まれて注入した領域にグループ化されたことを示した。免疫枯渇マウスにおける線維性組織の形成につながる病態生理学的メカニズムは不明であるが、移植された細胞の周りに見えるコラーゲン組織は、エンドポイントに匹敵する可能性組織の互換性インプラント。この場合には、外因性物質は、炎症細胞によって除去することができず、周囲の組織から隔離する線維性結合組織の緻密層にカプセル化されてしまう。同様に、創傷治癒の最終段階のフェーズに、この粒状の組織が高度に血管で、注入された材料の生存を保証します。

心筋内針注射は、周囲組織への損傷の小さな領域を生成しているが、技術的にここで説明する方法は、成功した。心機能の測定は、このレビューの目的はなかったが、今後の研究では、軽微な組織の損傷が細胞治療分析を乱すことができるかどうか調査する必要があります。さらに、注入された領域において生成損傷が注入された細胞の量によって、または両方の組み合わせによって、針によって引き起こされるかどうかを分析することが重要であろう。

我々の調査結果を支持するものとして、それはそのtransplantatioが示されている免疫不全マウス（NOD-SCID）の健康な心臓に百分の20から25までの心筋細胞（ヒトES細胞-CM）を含む分化したヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）の混合集団のnが心筋細胞が組織され、成熟したとなっている移植片の急速な形成をもたらした時間とnoncardiomyocyte人口にわたり^23を失った。興味深いことに、著者らは、ヒトES細胞-CMは、主に電気生理学的合胞体^22,23の形成を妨げた線維性組織の層によってホスト心筋から単離されたことを観察した。別の研究では、Kehat らのhESC-CMが正常に完全心ブロックと豚に心室をペースことがわかった。この研究は、移植された細胞は、生存し機能し、宿主細胞と一体化され、電気的ペースメーカー³⁰に対する生物学的代替物として機能する能力の証拠を提供することを示した。これら2不一致の結果は、HOの構造と機能の違いにより和解することができますSTとドナー種。実際に、移植された心筋細胞の結合の効率は、宿主とドナー細胞の相対ビーティング周波数に依存する可能性がある。ヴァンLaakeの研究²³において、機能性接合の形成は、げっ歯類の心筋細胞（300〜600 BPM）対人間の心筋細胞（60〜100 BPM）の異なるうなり周波数に損なわれる可能性があります。 Kehat分析³⁰で説明したように、これは、ブタ移植実験に対する人間の場合ではありません。

観測時間の長さは、他の交絡因子である。心筋梗塞は、短期的な時点（4週）のために心臓機能の改善を誘導した後のhESC-CMは、げっ歯類の心臓に移植した。しかし、12週目に、心機能をさらに移植片の生存²³にもかかわらず、持続しなかった。著者らは、移植片の大きさ（セルの増加量）が改善された長期的な心臓survと関連していなかったことが観察されIVALおよび機能向上^31、長期的または短期的、中期的分析は、注射のための細胞の数の増加を必要とせずに、将来の研究で行うべきであることを示す対分析。

本研究では、いくつかの質問は、移植されるべき細胞の種類、試験されるべき宿主供与体種の選択、セルの不整脈電位の詳細な評価についてのままである。理想的には、残りの筋細胞と機能的に結合しなければならない交換またはペースメーカー機能のために、心筋に移植幹細胞。心筋梗塞のラットモデルでは、フェルナンデスら ^32は、対照と比較し筋芽細胞を注入した心臓における心室性不整脈の増加誘導性を示し、不整脈感受性を評価するようにプログラム電気刺激（PES）を使用しました。同じ研究において、骨髄由来の自己細胞の注射はinducibil増加をもたらさなかった心室性不整脈のITY、これにより筋芽細胞が特定の催不整脈のリスクを示したと結論する著者をリードする、コントロールと比較。別の研究では、骨髄由来細胞（BMC）を効率的に梗塞瘢痕やボーダーゾーン内のクラスタに移植されたが、それを電子的Caが^33を過渡誘発示さなかった。興味深いことに、Wei らは、間葉系幹細胞（MSC）は梗塞心における生存期間の間に成熟した心筋細胞の電気生理学的特性を取得しないことを示した。しかしながら、それらは、電気的な脆弱性を軽減することができ、心室性不整脈^34を促進しない。

幹細胞療法の有効性および不整脈の発生は、細胞上、ならびに送達経路に依存する。実際、ミシガン³⁵の後にラットの心臓で、心筋内のBMC注射は、心機能を改善したが、連続した心室尚早収縮と心室tachycardの増加最初の14日間、IA。冠動脈内経路を使用した場合、心室性不整脈の発生が顕著に減少した。臨床試験では、注入された細胞の催不整脈関数は、虚血性心疾患のために示されているように、ほとんどの患者は、β遮断剤を受け取るように評価することは困難である。 β遮断薬を用いた治療は、移植細胞の潜在的な催不整脈効果をマスクすることがあります。動物研究は、したがって、幹細胞治療における催不整脈刺激の拠点性を評価することが重要である。

要約すると、我々のデータは、マウスにおける心筋細胞注入の実現可能性を実証するだけでなく、細胞移植の安全条件に関する詳細な分析のための必要性を強調している。ヒトにおいては、再狭窄^39、細胞注射のプロ不整脈^36-38に関連していることが示されている、アテローム性動脈硬化症^40、および冠動脈閉塞^41を加速させた。基礎研究は、将来の臨床アプリケーションで重要となる配信先の細胞を理解するlications、送達様式、細胞媒介性の心筋機能修復のメカニズム、すべての人間の人口に利益を自家細胞移植プロトコルに対する同種のデザイン。なぜなら大規模臨床試験に関連する高コストのため、移植プロトコルの効率および有効性の再現性は、例えばここに記載のものなどの前臨床モデルで対処する必要がある。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

私たちは、顕微鏡分析および心臓修復、技術者や私たちの動物施設の管理に関連するプロジェクトを支援するためのMagdiヤコブ研究所（MYI）に感謝。この作品は、英国心臓財団（BHF）、プロジェクト無償PG/10/019によってサポートされています。 MPSは、MYIとBHFによってサポートされています。 TPはBHF-優良研究員である。 NRは、NH＆MRCオーストラリアフェローである。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolator	Pfi systems		Quotation needed
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	For small animals
Medetomidine	National Veterinary Service		Veterinary prescription is necessary
Ketamine hydrochloride	National Veterinary Service		Veterinary prescription is necessary
Atipamezole	National Veterinary Service		Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream	commercial shops
Buprenorphine	NVS		Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope	Leica	Model S6E	With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner	Hamamatsu	RS series
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt scissors	FST	14084-09
Minivent	Harvard Apparatus	73-0043	Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps	FST	11052-10
Retraction system	FST	18200-20	Kit for animals up to 200 g
30 G 12 mm; ½ inch	BBraun	A210	Fine yellow
Microliter syringe	ESSLAB	81201	Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700
6-0 Silk suture	Ethicon	W1614T