Summary
Intramyocardial cell leverans i musmodeller av hjärt-kärlsjukdomar, såsom högt blodtryck eller hjärtinfarkt, används ofta för att testa den terapeutiska potentialen av olika celltyper i regenerativ studier. Därför kommer en detaljerad beskrivning och en tydlig visualisering av detta kirurgiska ingrepp hjälpa till att definiera gränserna och fördelarna med hjärt cell terapeutiska analyser i små gnagare.
Abstract
Tidigare studier visade att cell leverans främjar hjärtfunktionen förbättring genom frisättning av cytokiner och faktorer som ökar hjärtvävnad revaskularisering och cellöverlevnad. Dessutom ytterligare observationer avslöjade att specifika stamceller, såsom hjärt-stamceller, mesenkymala stamceller och cardiospheres har förmåga att integrera i den omgivande hjärtmuskeln genom att differentiera in i kardiomyocyter, glatta muskelceller och endotelceller.
Här presenterar vi de material och metoder för att på ett tillförlitligt leverera noncontractile celler i vänster kammarvägg immunodepleted möss. De framträdande stegen i denna mikrokirurgisk procedur involverar anestesi och smärtlindring injektion, intratrakeal intubering, snitt för att öppna kistan och exponera hjärtat och leverans av celler med en steril 30-gauge kanyl och en precision mikroliter spruta.
Vävnadsbehandling bestående av hjärt skörd, embedding, snittning och histologisk färgning visade att intramyocardial cellinjektion producerade en liten skada i epicardial området, liksom i kammarväggen. Noncontractile celler behölls in i hjärtmuskelväggen av nedsatt immunförsvar möss och var omgiven av ett lager av fibrotisk vävnad, sannolikt för att skydda mot hjärt-tryck och mekanisk belastning.
Introduction
Olika cellleveransprotokoll har testats i murina och råttmodeller av hjärt-och kärlsjukdomar i syfte att översätta effektivitet, effekt och säkerhet för denna experimentella förfarande hos människor. I små gnagar hjärtan är intramyocardial celladministrering den lämpligaste metoden för celladministrering 1,2, medan det i råtthjärta antegrad 3 och retrograd 4 intrakoronar cell infusion kan även användas. Båda metoderna har begränsningar och fördelar. Cell leverans via intrakoronära vägen har teoretiska fördelar jämfört direkt intramuskulär injektion för att främja global cellspridning 3, men det har också risken för att orsaka kranskärls emboli 3,5. Begränsningar intramyocardial leverans är associerade med mekanisk skada, akut inflammation och myokardskada 6,7. Hos människa, celler för hjärt reparation levereras av intramyocardial injektion genom en endokardiell eller kirurgisk epikardiellanärma sig eller genom intrakoronar arteriell väg 8. Injektion av transvaskulär vägar lämpar sig för patienter med akut infarkt och reperfusion hjärtmuskeln, men kanske inte är möjligt i fråga om totala ocklusioner eller dåligt flöde i kärlen i verk territoriet 9. Direkt injektion i kammarväggen genom transendocardial eller transepicardial injektion är tekniskt möjligt beroende på patientens hälsotillstånd. I själva verket har det visat sig att denna teknik är säker 10,11, men för transepicardial injektion en öppen bröstkirurgi är nödvändigt och för transendocardial närmar sig en elektrofysiologisk mappning för varje patient krävs att differentiera områden av livsduglig ischemisk eller ärrad myokardium 9.
Viktigt i cellterapistudier valet av den bästa cellen som ska transplanteras är fortfarande under utredning. Kortfristiga analyser (4 veckor) har visat att injektion av hjärt stamceller definierade som cardiospheres
I mus-och råttmodeller, långsiktiga studier visade att cell injektion inte längre ville förbättra hjärtfunktionen (12 månader). Faktum transplantat av mänskliga embryonala stamcellsderiverade cardiomyocytes (hESC-CM) var i stort sett isolerade från värdhjärtmuskeln genom ett lager av fibrotisk vävnad 22,23. Liknande resultat har observerats efter intramyocardial transplantation av skelett myoblasts in i hjärtat av infarkt möss 24. Furthermore, den långsiktiga förmågan hos allogena MSCs för att bevara funktionen i infarkt hjärta har begränsats av övergång från en immunoprivileged till en immunogen tillstånd efter differentiering 25.
Med hänsyn till de utmaningar och framtidsutsikter som beskrivs ovan, visar vi här hur man levererar celler genom intramyocardial injektion i möss. Vi observerar att celler utan cardiomyocyte kontraktila egenskaper inte är anslutna med värdhjärtmuskeln och bildar en sammanhängande massa med en tunn fibrotisk barriär. Även i vissa fall detta resultat kan vara fördelaktigt, kan följande analys vara bra att förstå hur cellen engraftment kan anpassas för att skapa funktionellt anslutna hjärt strukturer också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samtliga djurstudier har utförts i enlighet med internationella (direktiv 2010/63/EU av Europaparlamentet) och nationella (brittiska Home Office, Act 1986) föreskrifter. De förfaranden som beskrivs här är en del av vår plan för arbetet under brittiska licensmyndigheter och som inte har genomförts i syfte att inspelningen.
1. Beredning av celler
Detta protokoll beskriver framställningen av en specifik cellinje (humana embryonala njur-, HEK293-celler) i demonstrationssyfte. Cellspecifika protokoll måste användas för att odla och slutligen differentiera pluripotenta eller vuxna stamceller till specifika cellinjer.
- Odla celler i DMEM-medium (hög glukos, 4500 mg / L), som innehöll 1% natrium-pyruvat, 2 mM glutamin, 1% antibiotiskt Pen / Strep och 10% fetalt bovint serum (FBS). En 10 cm tallrik bör normalt delas upp på 1:03 och medier kompletterade frisk varannan dag.
- Behandla celler milt med Trypsi 1x och återsuspendera i DMEM-medium såsom beskrivits i 01:01.
- Räkna celler i en hemocytometer kammaren och samla 3 x 10 6 celler i ett separat rör.
- Centrifugera i en svängrotor vid 100 g under 5 min.
- Avlägsna supernatanten och tvätta cellpelleten med steril fosfatbuffert 2x.
- Återsuspendera i PBS 1x vid en koncentration av 10 6/50 ul för injektion i den vänstra ventrikeln av immunodepleted möss.
2. Presurgical Förhållanden
- Bibehåll immunodepleted möss (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) med sterila matpellets och vatten i en temperaturstyrd isolator (22 ° C; Tabell 1) före varje operation.
- Utför operation av immunodepleted möss under ett laminärt flöde huva. Rengör arbetsområdet med 70% etanol och autoklaveras kirurgiska verktyg (pincett och sax).
- Slå på värmedynor för kirurgi och återkrav. Värmedynor är viktigaatt blockera minskning av kroppens temperatur som uppträder under och efter kirurgi.
- Placera en ren och autoklaveras bur på återhämtning-värmedyna.
- Transportera mössen i sina ursprungliga burar från isolatorn till operationen rum i en steril autoklaverad påse.
- Väg musen och enligt kroppsvikten injicera subkutant (se) en lösning innehållande medetomidin och ketamin-hydroklorid utspädd i 0,9% steril saltlösning för att söva musen, liksom att koppla muskulaturen (medetomidin 1 mg / kg, ketamin-hydroklorid 75 mg / kg).
- Ta bort musen från buren när den är helt bedövad (inom 1-2 minuter, ingen toe-nypa reflex efter stimulering)
- Applicera hårborttagningskräm på vänster sida av bröstkorgen och halsen. Efter en lämplig tid (ca 2-5 min), torka bort de lösa håren med vatten-våt vävnad.
- Placera musen på operationen panelen i ryggläge. Frånkirurgens synvinkel positionen är vertikal, svans ned-head up.
- Injicera smärtstillande lösning på 0,1-0,2 mikrogram / g utspädd i steril koksaltlösning (buprenorfin) i bakbenen subkutant och täcka det rakade området med aseptisk lösning povidonjod med hjälp av en bomullstopp.
- Fokusera mikroskop (2,5 X mål) på halsen.
3. Kirurgiska Förhållanden
- Med trubbiga saxen gör en mittlinjen ventrala hud snitt på ca 0,5-1 cm längd något under krikoidbrosket. Separera den hud från bindväv att visualisera spottkörtlar.
- Dela spottkörtlarna på deras naturliga mittlinjen division genom att samtidigt dra varje del i sidled med forcep och magnetisk bröst upprullningsdon och exponera luftstrupen.
- Dra tungan försiktigt åt sidan för att exponera struphuvudet. Skjut intubation röret försiktigt i luftstrupen. Röret tips är synlig genom den visade larynx och luftstrupe. Viktigt är, om röret är i, men inte klart synlig, är det i matstrupen. Ta bort den och ändra placeringen av röret spetsen.
- Anslut slangen till ventilationsmaskinen. Ställ in slagvolym på 200 l och 150 slag / min. Fäst ventilationsslangen på operation panel med ett band.
- Med trubbig sax och pincett, gör en vertikal svans till huvud 1 - till 1,5-cm-långa snitt i huden över den vänstra bröstkorgen området.
- Lossa huden från bindväv / muskelskikten och de större och mindre bröstmusklerna utan att göra snitt.
- Utför torakotomi mellan de tredje och fjärde ribbor som följer:
- Perforera intercostal muskellagret genom att nypa och skrapa med små, rundade pincett.
- När intercostal muskellagret är perforerat, placera bröst upprullningsdonet maximalt öppna brösthålan. De övre och mellersta delarna av vänster kammare (LV) med sitt överliggande hjärtörat (atrium) ärnu synliga.
- Förbered en precisionsspruta med celler. Sprutan ska kunna leverera en mängd volym på 10 ul för varje injektion. Kasta en 30 G-nål vid spetsen av sprutan.
- Fäst med tejp en liten plastkanyl (från ett introcan-W 20 G) på nålen, vilket lämnar exponerad endast 1 mm, inklusive den öppna nålspetsen. Detta kommer att förhindra att nålen perforerar hela vänsterkammarvägg och injicera cellerna i vänster kammare hålrum.
- Med hjälp av ett 5X objektiv, visualisera vid denna förstoring den vänstra ventrikeln och injicera celler in i den vänstra ventrikulära väggen i 5 olika platser (varje injektion kommer att leverera 10 ul för totalt 106 celler injicerades). Om injektionen är framgångsrik, kommer en vit yta och avsaknaden av stora svallvågor av cellerna vara synlig (om injektionen var inte lyckad, skulle djuret uteslutas från funktionsanalys).
- Ta upprullningsdonet. Stäng bröstväggen by som omsluter de två separerade revben med två stygn i 6-0 silke sutur.
- Återfukta bröstmusklerna och huden med en bomullsspets dränkt i PBS 1x och försiktigt sätta musklerna tillbaka till det ursprungliga läget med pincett.
- Stäng huden med 3-4 stygn av 6-0 silkesutur. Sutur svalg snitt med 2-3 stygn för att stänga huden.
- Spruta atipamezol (1 mg / kg slutlig koncentration) för att återställa de bedövande effekt.
- Så fort musen börjar andas självständigt, ta ut slangen från luftstrupen och sätta musen på dess högra sida. Musen förväntas återhämta sig inom några minuter.
- När musen börjar vända och gå, placera den i den varma återhämtning bur (liten IVC bur med stängd filtrerad topp) i en timme.
- Lämna djuren över natten i en kontrollerad uppvärmd ruta (37 ° C).
- Fyll en skål med vatten och pellets mat för att stödja återhämtningen under de första två dagarna efter operationen.
Tio hjärtan injicerats med celler och 10 kontroll inte injicerade hjärtan analyseras histologiskt enligt följande:
- Utför analys av de ympade cellerna en vecka efter injektion (fig 1 och 3).
- Efter dödshjälp genom överdos av isofluran, BEGJUTA hjärtan med 20 ml 4% paraformaldehyd (PFA) för att fixa vävnaden. Torka den fasta vävnaden i ökande procentsatser av etanol (70-100%) och bädda in i paraffinblock.
- § hjärtan i paraffin med en mikrotom på 5 um och fläcken med hematoxylin och eosin för morfologisk analys.
- Visualisera bindväv med hjälp Massons Trichrome stain.
- Analysera bilder under en bild scanner mikroskop (fig. 1A, 2A, 3A, 3B och 3C) och visualisera hela hjärtat i kort axel vy med hjälp av en digital bild scanner mikroskop (Figures 1B och 1C).
- Efter ovanstående analyser, Avparaffinera hjärtats vävnader i xylen, rehydrera genom att sänka ned exemplaren i minskande procentsatser av etanol (från 100% till vatten) och ett förfarande för svepelektronmikroskopi (SEM) som följer:
- Inkubera avparaffinerade block med 1% garvsyra i 0,1 M fosfatbuffert under 1 timme.
- Torka exemplar i ökande procentsatser av etanol (25-100%).
- Torra prover med HMDS (hexametyldisilazan).
- Montera proverna på Stubbs med Acheson Silver Dag och päls dem med guld-palladium.
- Visa prov på ett analytiskt svepelektronmikroskop (Figur 2B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi injicerade HEK293-celler, som kan skiljas från de hjärtceller efter deras olika morfologi (Figur 1), med en gatsten form jämfört med de avlånga hjärtmuskelceller (Figur 1A). HEK293-celler var mer reaktiva för hematoxylin färgämne (blå färg) jämfört med hjärtmuskelceller (rosa färg), sannolikt på grund av deras ökade kärninnehåll (Figur 1A). För att ytterligare särskilja de injicerade celler från värdvävnaden, var HEK293-celler märktes med DAPI 2 timmar före injektion. Märkta-celler var synliga i hjärtmuskelvävnaden, såsom visas i figur 1E. Kontrollskenopererade möss visade inga skador i hela hjärtat (figur 1C) och integritet vävnaden (figur 1D).
I en hel kortaxel vy av hjärtat, injicerade celler var synliga som en homogen grupp inom området för injektionen (Figur 1B). Den grupperade calnar var omgivna av ett tunt skikt av fibrös vävnad, som verkade som en blå området i trikromfläckning (Figur 2A). Celler som inte är ansluten till den mottagande myokardial vävnad, såsom visas med svepelektronmikroskopi (figur 2B), sannolikt på grund av deras noncontractile funktion och annan cellulär struktur.
Förutom de ovanstående observationerna noterade vi små områden av skador där nålen injicerades (figur 3A). Dessa områden löpa från den yttre epikardiell lagret av hjärtat in i hjärtmuskelväggen (Figur 3A). Injicerade celler (grön pil, Fig. 3B) är närvarande i närheten av det skadade området (svarta pilar, figur 3B). DAPI-positiva celler var synliga längs injektionsstället (figur 3C, vita pilar). En vecka efter skada, gjorde Tunel analys inte visar ökad apoptotiska celler vid platsen för skadan, vilket tyder på att nekrossnarare än apoptos har inträffat efter nål injektion (Figur 3D).
Figur 1. Histologisk analys av injicerade celler. A) En vecka efter cellinjektion hjärtan inbäddades i paraffin och bearbetades för hematoxylin och eosin-färgning. Injicerade HEK293 celler var närvarande i väggen i vänster kammare. Bilder erhölls med en stereofluorescensmikroskop. B) Trikrom färgade vävnader visade att cellerna var grupperade i samma område där de injicerades (pil). Höger bottenpanelerna visar de korta axel visa med höger (RV) och vänster kammare (LV). Den röda rektangeln visar det område där cellerna bevaras (1,5 X). Bilderna registrerades med en bild scanning mikroskop. C) Trichrome staining av styrskenopererade hjärtan. Hela hjärta vy med en 5x mål. D) Trikrom färgning av skenopererade möss visar myokardvävnaden integritet. E) HEK293 celler färgades med DAPI 2 timmar före injektionen. En vecka efter injektion hjärtan inbäddades i OCT och snittades i en kryostat vid 6 um. Celler visualiserades under UV i ett fluorescensmikroskop. Vänster och höger kammare visas. I höger kammare, höger panel, den vita linjen markerar epicardial lagret. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Bildning av en fibrotisk skikt mellan injicerade cellerna och värdvävnaden. A) trikromfläckning showkollagenartad vävnad som bildas mellan HEK293-celler och murina myokardial vävnad (pilar). Bilderna registrerades med en digital avsökningsmikroskop. B) Hjärtan avparaffinerades och bearbetades för svepelektronmikroskopi. Bilder registrerades med ett svepelektronmikroskop och visar kollagenfibrer (pilar) mellan de injicerade HEK293-celler (vänster sida) och värdhjärtmuskeln (höger sida). Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Cell injektion producerade små områden av skador. A) trikromfläckning visar små områden av skador där nål injicerades (blå färg,. Pilar) B) Paraffinsnitt färgades av Trichrome staining och det område där de celler injicerades indikeras med svarta pilar. Injicerade celler (grön pil) var synliga i närheten av det skadade området. C) HEK293-celler, färgades med DAPI 2 h före injektion, var närvarande längs injektionsstället (vit pil). Injektionsstället indikeras med en grön pil och vita öppen linje markerar perikardiell lagret. D) Tunel analys, utförd på paraffin, visade inte relevanta fluorescerande positiva kärnor. Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript har vi visat hur man utför intramyocardial injektion av celler i murina hjärtan. Som ett bevis på denna metod har vi använt HEK293 celler. Det är viktigt att betona att HEK293-celler som inte används i någon cellterapi studien och därför resultaten av detta manuskript är inte lämpliga för direkt översättning till ett terapeutiskt förhållningssätt. Men det faktum att HEK293 celler inte kontraktila celler och inte transdifferentiera i andra celltyper fokuserar uppmärksamheten på tekniska aspekter såsom egenskaperna hos de celler som skall levereras och vägen för leveransen.
Det har rapporterats att en intramyocardial väg tenderar att orsaka cellkluster inbäddade i hjärtvävnaden 24,26, medan den intrakoronära vägen skulle kunna ge mer homogen fördelning vid platsen för skadan. För cardiomyocyte ersättning, bör den ideala donatorcellen uppvisar elektrofysiologiska, strukturella och sammandragande properties av kardiomyocyter och bör kunna integrera strukturellt och funktionellt i värdvävnaden, vilket tyder på att det är nödvändigt för ett celldifferentieringsprogram som skall användas före transplantation.
Nyckelpunkterna för en lyckad operation kan sammanfattas enligt följande:
- Bedöva möss med injicerbara föreningar minskar hjärtfrekvensen och underlätta cellinjektion
- Utför intratrakeal kanylering av möss för att gynna lungor funktionalitet.
- Utför toraktomi undvika muskel snitt för att hålla bröstmuskeln funktionalitet för en korrekt andning.
- Efter exponering av hjärtat, observera den vänstra ventrikeln under ett mikroskop för att visualisera huruvida injektion har skett (synlig som en blek färg).
- Använd en tunn nål och en precisionsspruta för att undvika omfattande perforering av hjärtmuskelvävnaden och för att injicera den önskade mängden av material respektive.
- FÖRHYDA nålen med ett plaströr systemet utsätta only spetsdelen. Detta skulle medge införande av nålen till ett visst djup in i den vänstra ventrikeln (0,5 mm), för att undvika injektion i den ventrikulära håligheten.
- Stäng bröstet och utrymmet mellan de noggrant ribbor för att undvika exponering av lungorna till yttre tryck.
Denna teknik har en hög nivå av framgång om postoperativ hälsotillstånd prioriteras. Djur skall övervakas noga varje dag upp till en vecka efter tecken på stress och smärta. Injektion av analgetiska föreningar för att kontrollera smärta måste administreras som behövs postoperativt. Lokal applicering av smärtlindring, såsom lidokain, kan användas också. Blödning bör förebyggas genom noggranna kirurgiska tekniker. Men om förekommande, det kan stoppas genom komprimering eller ligering av kärl. Vi har noterat att djuren återhämta sig bättre och snabbare om de lämnas i ett värmeskåp i 37 ° C i 12-20 timmar efter operationen. Denna behandling kommer att blockera snabb sänkning av kroppstemperatur, och inte hellernormalt inträffar efter kirurgiska ingrepp och administration av anestesi. Postsurgical infektioner kan förekomma, men bör vara lägre än 1%. Aseptiska rutiner måste följas strikt för att förhindra infektion. Lokal infektion kan behandlas med tillämpning av antibiotika. Viktigt bör dehydratisering styras genom subkutan injektion av koksaltlösning.
Det är föredraget att administrera injicerbara över inhalerad bedövningsmedel, såsom isofluran. Ja, konstaterade vi att injicerbara bedövningsmedel minskade hjärtslag, vilket gör att enklare injektion och mindre blödning utan att orsaka djuret obehag.
Även invasiv, är injektion av små volymer av celler (25-50 il) i möss genomförbar och säker. Vi hade mindre än 1% dödlighet genom insprutning av 50 ul av HEK293-celler i 5 olika områden av den vänstra kammarväggen (10 | il / injektion). Denna metodik säkerställas närvaron av celler i flera områden av hjärtmuskelväggen, vilket är viktigt istamcellsterapi vid utökade områden av ischemisk skada behöver nås av de levererade cellerna. För att utföra mindre invasiv kirurgi har flera protokoll nyligen publicerats, även om deras reproducerbarhet vid olika laboratorier har ännu inte verifierats. Till exempel kan cellinjektion utföras av nära-bröst teknik med hjälp av hög upplösning ekokardiografi 27. Användningen av detta system kräver höga operatörs färdigheter för att visualisera klart i en tvådimensionell bild på väggen i vänster kammare och för att bibehålla nålen på en viss plats under normal systoliskt / diastoliskt cykler. Fördelen med denna teknik är implantation av cellerna i musen myokardiet till önskade platser i en kliniskt relevant tidsram efter hjärtinfarkt induktion. Dock är denna metod inte är möjligt med ingrepp såsom hjärtinfarkt induktion eller transaortic banding på grund av den ökade dödligheten av djur som genomgår en andra operation 27. Intressant, Hamdi och kollegor jämförde direkt intramyocardial injektion kontra leverans av celler i ett Gelfoam bygga på epicardial området 28. De observerade att överliggande cellen bygga på epikardiet resulterat i bättre funktionalitet graft jämfört med intramyocardial cellinjektion och rapporterade att denna teknik är reproducerbar, användarvänlig och mindre traumatisk för djuren 28.
Ett viktigt särdrag hos cellinjektion experiment är spårningen av cellerna och deras överlevnad. Vi har visat att HEK293-celler är lätta att detektera på grund av sin urskiljbara morfologi jämfört med hjärtceller. Dessa celler överlevde injektionen (data ej visade) och behölls i vävnaden en vecka efter operationen. För att spåra celler för långtidsstudier och analysera deras inympning i vävnaden för leverans samt i andra vävnader, flera tekniker är i bruk, inklusive fluorescerande märkning och FISH aNALYS av sex-mismatch transplantationsförsök 29. Huvudsakligen kommer in vivo imaging spelar en viktig roll för att in vitro-analyser i framtida studier. I själva verket är en fördel med in vivo imaging över histologiska metoder för spårning av cellerna i longitudinella studier i samma djur utan behovet av dödshjälp 29. I denna metod kan celler märkas med bioluminescence reagenser, järnpartiklar och specifika reportergener som skall avbildas med positronemissionstomografi (PET) och magnetisk resonanstomografi (MRT).
Våra analyser visar att noncontractile celler såsom HEK293 celler företrädesvis grupperade i det område där de injicerades omgivna av en tunn kollagen vävnad. Fastän de patofysiologiska mekanismer som leder till bildandet av fibrotisk vävnad i en immunodepleted mus är okända, kan kollagen vävnad synliga runt de transplanterade cellerna att bli jämförbar med slutpunkten på envävnadskompatibla implantat. I detta fall kan det exogena materialet inte kan avlägsnas med de inflammatoriska cellerna och blir inkapslade i ett tätt skikt av fibrotisk bindväv, som isolerar den från de omgivande vävnaderna. I likhet med de slutstadiet faser av sårläkning, är detta granulat vävnad mycket vaskulariserad och säkerställer överlevnad implanterade materialet.
Tekniskt den här beskrivna metoden var framgångsrik, fastän intramyocardial nålinjektion produceras ett litet område av skador på den omgivande vävnaden. Även hjärtfunktionsmått var inte syftet med denna översyn, bör framtida studier undersöka om mindre vävnadsskada kan störa cellterapi analyser. Vidare skulle det vara viktigt att analysera huruvida den skada som producerats i det injicerade området är orsakad av nålen, med den mängd av celler injiceras eller genom en kombination av båda.
Till stöd för våra resultat har det visats att transplantation av blandade populationer av differentierade humana embryonala stamceller (hESC) som innehåller 20-25% cardiomyocytes (hESC-CM) i den friska hjärtat av nedsatt immunförsvar möss (NOD-SCID) resulterade i en snabb bildning av transplantat där hjärtmuskelceller blev organiserat och mognat över tiden och noncardiomyocyte befolkningen var förlorat 23. Interestingly observerade författarna att hESC-CM till stor del isolerades från värd myokardiet av ett skikt av fibrotisk vävnad som förhindrade bildningen av en elektrofysiologisk syncytium 22,23. I en annan studie, Kehat et al. Fann att hESC-CM framgångsrikt tempo ventrikeln i svin med komplett hjärtblock. Denna studie visade att de transplanterade cellerna överlevde, fungerade, och integreras med värdceller, ger belägg för deras förmåga att fungera som ett biologiskt alternativ till den elektroniska pacemakern 30. Dessa två disharmoniska utfall kan förenas med skillnaden i struktur och funktion av host och donatorarter. I själva verket är det möjligt att verkningsgraden för koppling av transplanterade cardiomyocytes kan bero på den relativa stryk frekvensen hos värd-och givarceller. I Van Laake studie 23, kan bildandet av funktionella korsningar försämras på grund av den annorlunda misshandeln frekvensen av mänskliga hjärtmuskelceller (60-100 bpm) mot gnagare cardiomyocytes (300-600 bpm). Detta skulle inte vara fallet i mänsklig kontra svin transplantationsexperiment, enligt beskrivningen i Kehat analys 30.
Längden för observationstiden är en annan påverkande faktor. hESC-CM transplanteras in i gnagare hjärtat efter hjärtinfarkt inducerad hjärtfunktion förbättring bara för kortsiktiga tidpunkter (4 veckor). Men vid 12 veckor, hjärtfunktion inte längre upprätthållas trots graftöverlevnad 23. Författarna observerade att transplantat storlek (ökad mängd celler) inte var associerad med förbättrad långsiktiga hjärt överlevandeiVal och funktionell förbättring 31, vilket tyder på att den långsiktiga analyser kontra kort eller medellång sikt analyser bör utföras i framtida studier utan att kräva ett ökat antal celler för injektion.
I den aktuella studien, flera frågor kvarstår angående den typ av celler som skall transplanteras, valet av värd-donatorarter som ska testas och en detaljerad utvärdering av arytmier potentialen av cellerna. Helst stamceller implanteras i hjärtmuskeln för utbyte eller pacemakerfunktionen funktionellt par med de återstående myocyterna. I en råttmodell av hjärtinfarkt, Fernandes et al. 32 används Programmerad elektrisk stimulering (PES) för att utvärdera arytmi känslighet, visar en ökad inducerbarhet av ventrikulära arytmier i myoblast-injicerade hjärtan jämfört med kontroller. I samma studie fick injektioner av härledd från benmärg autologa celler inte leda till en ökad inducibilhet av ventrikulära arytmier jämfört med kontroller, vilket leder författarna till slutsatsen att myoblasts uppvisade en specifik arytmogen risk. I en annan studie, härledd från benmärg celler (BMC) effektivt inympade i kluster inom infarkt ärr eller gränszonen, men visade framkallade ingen elektroniskt Ca transienter 33. Intressant, Wei et al. Visade att mesenkymala stamceller (MSC) inte förvärva elektrofysiologiska egenskaperna hos mogna hjärtmuskelceller under överlevnadsperioden i infarkt hjärtan. Men de kan lindra den elektriska sårbarhet och inte främjar ventrikulära arytmier 34.
Effekten och arytmi förekomst av stamcellsbehandling beror på cellerna samt på de leveransrutter. I själva verket, i råtthjärtan efter MI 35, intramyocardial BMC injektioner, trots förbättrad hjärtfunktion, ökad varandra följande ventrikulära prematura kontraktioner och ventrikulär tachycardbl.a. för de första 14 dagarna. När intrakoronär vägen användes, var ventrikulär arytmi förekomsten markant minskat. I kliniska studier är svåra att bedöma eftersom de flesta av de patienter som får beta-blockerare medel som anges för ischemisk hjärtsjukdom den proarytmisk funktion injicerade cellerna. Behandling med betablockerare kan maskera en potentiell proarytmisk effekten av de transplanterade cellerna. Djurstudier är därför avgörande för att bedöma grunderna för proarytmiska stimuli inom stamcellsterapi.
Sammanfattningsvis visar våra data möjligheten att intramyocardial cell-injektion i möss utan också betonar behovet av en detaljerad analys av villkoren för cell ympning säkerhet. Hos människa har det visat sig att cellinjektion är associerad med pro-arytmier 36-38, restenos 39, accelererad ateroskleros 40 och koronarobstruktion 41. Grundforskningen kommer att vara viktigt i framtiden klinisk applikationlications att förstå vilka celler som ska levereras, leveranssätt, mekanismerna för cellmedierad hjärtfunktion reparation och konstruktion av en allogen versus autolog celltransplantation protokoll som gynnar hela den mänskliga befolkningen. På grund av de höga kostnader som är förknippade med stora kliniska studier, måste behandlas i prekliniska modeller som de som beskrivs här reproducerbarhet av effektivitet och effekt av transplantationsprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Magdi Yacoub Institute (MYI) för att stödja mikroskopi analys och de projekt som omfattar hjärt reparation, de tekniker och chef för vår djuranläggning. Detta arbete har fått stöd av den brittiska Heart Foundation (BHF), projektbidrag PG/10/019. MPS stöds av MYI och BHF. TP är en BHF-ForskningUtmärkthet Fellow. NR är en NH & MRC Australien Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolator | Pfi systems | Quotation needed | |
| Heating Pad | Vet Tech Solutions | HE006 | For small animals |
| Medetomidine | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Ketamine hydrochloride | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Atipamezole | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Hair removal cream | commercial shops | ||
| Buprenorphine | NVS | Veterinary prescription is necessary | |
| Leica MZFLIII microscope | Leica | Model S6E | With swing arm stand TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner | Hamamatsu | RS series | |
| Scanning Electron Microscope | Jeol | JSM-6610 | |
| Blunt scissors | FST | 14084-09 | |
| Minivent | Harvard Apparatus | 73-0043 | Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844) |
| Forceps | FST | 11052-10 | |
| Retraction system | FST | 18200-20 | Kit for animals up to 200 g |
| 30 G 12 mm; ½ inch | BBraun | A210 | Fine yellow |
| Microliter syringe | ESSLAB | 81201 | Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700 |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | W1614T |
References
- Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
- Taylor, D. A., et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929-933 (1998).
- Suzuki, K., et al. Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation. 104, 207-212 (2001).
- Suzuki, K., et al. Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function. Circulation. 110, 225-230 (2004).
- Robinson, S. W., et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant. 5, 77-91 (1996).
- Muller-Ehmsen, J., et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 107-116 (2002).
- Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M., Schneider, M. D. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J. Clin. Invest. 115, 572-583 (2005).
- Oettgen, P., Boyle, A. J., Schulman, S. P., Hare, J. M. Cardiac Stem Cell Therapy. Need for Optimization of Efficacy and Safety Monitoring. Circulation. 114, 353-358 (2006).
- Krause, K., et al. Percutaneous intramyocardial stem cell injection in patients with acute myocardial infarction: first-in-man study. Heart. 95, 1145-1152 (2009).
- Rodrigo, S. F., et al. Intramyocardial injection of bone marrow mononuclear cells in chronic myocardial ischemia patients after previous placebo injection improves myocardial perfusion and anginal symptoms: an intra-patient comparison. Am. Heart J. 164, 771-778 (2012).
- Smith, R. R., et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation. 115, 896-908 (2007).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 2, 173-181 (2009).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Malliaras, K., et al. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Circulation. , 125-1100 (2012).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, 763-776 (2003).
- Bearzi, C., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15885-15890 (2009).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, 2369-2379 (2012).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, 895-904 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, 1847-1857 (2011).
- Brunt, K. R., Weisel, R. D., Li, R. K. Stem cells and regenerative medicine - future perspectives. Can. J. Physiol. Pharmacol. 90, 327-335 (2012).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem Cell Res. 1, 9-24 (2007).
- Leobon, B., et al. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7808-7811 (2003).
- Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, 2419-2429 (2010).
- Reinecke, H., Poppa, V., Murry, C. E. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 241-249 (2002).
- Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, 1307-1314 (2005).
- Hamdi, H., et al. Cell delivery: intramyocardial injections or epicardial deposition? A head-to-head comparison. Ann. Thorac. Surg. 87, 1196-1203 (2009).
- Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marban, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circ. Res. 106, 479-494 (2008).
- Kehat, I., et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
- van Laake, L. W., et al. Improvement of mouse cardiac function by hESC-derived cardiomyocytes correlates with vascularity but not graft size. Stem Cell Res. 3, 106-112 (2009).
- Fernandes, S., et al. Autologous myoblast transplantation after myocardial infarction increases the inducibility of ventricular arrhythmias. Cardiovasc. Res. 69, 348-358 (2006).
- Scherschel, J. A., Soonpaa, M. H., Srour, E. F., Field, L. J., Rubart, M. Adult bone marrow-derived cells do not acquire functional attributes of cardiomyocytes when transplanted into peri-infarct myocardium. Mol. Ther. 16, 1129-1137 (2008).
- Wei, F., et al. Mesenchymal stem cells neither fully acquire the electrophysiological properties of mature cardiomyocytes nor promote ventricular arrhythmias in infarcted rats. Basic Res Cardiol. 107, 274 (2012).
- Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
- Bartunek, J., et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 112, 178-183 (2005).
- Britten, M. B., et al. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation. 108, 2212-2218 (2003).
- Smits, P. C., et al. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2063-2069 (2003).
- Kang, H. J., et al. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 363, 751-756 (2004).
- Fernandez-Aviles, F., et al. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res. 95, 742-748 (2004).
- Vulliet, P. R., Greeley, M., Halloran, S. M., MacDonald, K. A., Kittleson, M. D. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 363, 783-784 (2004).
