Summary
Hipertansiyon ya da miyokart enfarktüsü gibi kalp-damar hastalıkları, kemirgen modellerinde intramiyokardiyal hücre dağıtım yaygın rejeneratif çalışmalarda farklı hücre tiplerinin terapötik potansiyelini test etmek için kullanılır. Bu nedenle, ayrıntılı bir açıklama ve bu cerrahi işlemin açık bir görselleştirme küçük kemirgenler kardiyovasküler hücre tedavi analizlerin sınırlarını ve avantajlarını tanımlamak için yardımcı olacaktır.
Abstract
Önceki çalışmalar, hücre teslim sitokinler ve kardiyak doku revaskülarizasyon ve hücre sağ kalımı arttırmak faktörlerin salınımı ile kardiyak fonksiyon düzelmesini teşvik ettiğini gösterdi. Buna ek olarak, bundan başka gözlemler kardiyak kök hücreler, mezenkimal kök hücreleri ve cardiospheres gibi belirli kök hücreler, kardiyomiyositler, yumuşak kas hücreleri ve endotel hücrelerine diferansiyel çevredeki miyokard içinde entegre yeteneğine sahip olduğunu ortaya koydu.
Burada, güvenli bir immüno-farelerin sol ventrikül duvar içine kontraktil olmayan hücreler sağlamak için malzeme ve yöntemler sunar. Bu mikrocerrahi prosedürün belirgin adımlar anestezi ve analjezi enjeksiyon, entübasyon, göğüs açık ve steril 30-gauge iğne ve hassas bir mikrolitre şırınga ile hücrelerin kalp ve teslim maruz kesi içerir.
Kalp hasat, embeddi oluşan doku işlemeng, kesit ve histolojik boyama intramiyokardiyal hücre enjeksiyonu küçük bir epikardiyal alanında hasar, hem de ventrikül duvarında ürettiğini göstermiştir. Kontraktil olmayan immün hücreler, farelerin miyokard duvarına muhafaza edildi ve kalp basıncı ve mekanik yükten koruma muhtemel fibrotik doku tabakasıyla çevrili edilmiştir.
Introduction
Çeşitli hücre dağıtım protokoller, insan hastalarda, bu deneysel prosedürün verimliliği, etkinlik ve güvenlik çeviri amacıyla kalp ve damar hastalıkları, murin ve sıçan modellerinde test edilmiştir. Sıçan kalbi 3 antegrad ve retrograd 4 intrakoroner hücre infüzyonu olarak da kullanılabilir ise küçük bir kemirgen kalplerde, intrakardiyak, hücre dağıtım, hücre teslim 1,2 en uygun yöntemdir. Her iki yöntem sınırları ve avantajları var. İntrakoroner yolla hücre teslim küresel cep yayılmasını 3 teşvik doğrudan kas içine enjeksiyon üzerinde teorik avantajları vardır, ama aynı zamanda koroner emboli, 3,5 neden riski vardır. Intramiyokardiyal teslim Sınırlamalar mekanik yaralanma, akut inflamasyon, ve miyokard hasarı 6,7 ile ilişkilidir. İnsanlarda, kalp onarım için hücreler, endokardiyal veya cerrahi epikardiyal yoluyla intrakardiyak enjeksiyonu ile teslim ediliryaklaşım ya da İntrakoroner arter yol 8 ile. Transvasküler yollardan enjeksiyon akut enfarktüs ve reperfüzyon miyokardiyumda hastalarda uygundur, ancak toplam örtme ya etkilenen topraklarının 9 damarlar içinde yoksul akış durumunda mümkün olmayabilir. Transendocardial veya transepicardial enjeksiyon ile ventriküler duvarın içine direkt enjeksiyon, hastanın sağlık durumu ile ilgili olarak teknik olarak mümkün değildir. Gerçekten de, bu transepicardial enjeksiyon için bir açık göğüs cerrahi gereklidir ve transendocardial için uygun bir işemik ya da yaralı miyokard 9 siteleri ayırt etmek için gerekli olan her bir hasta için bir elektrofizyolojik eşleme yaklaşımlar her ne kadar bu teknik, 10,11 güvenli olduğu gösterilmiştir.
Önemlisi, hücre tedavisi çalışmalarında nakledilen iyi hücrenin seçimi halen araştırılmaktadır. Kısa vadeli analizleri (4 hafta) gösterdi ki cardiospheres olarak tanımlanan kardiyak kök hücre enjeksiyonu
Fare ve sıçan modellerinde, uzun vadeli çalışmalar hücre enjeksiyonu ayrıca kalp fonksiyonunu (12 ay) düzelmedi ortaya koymuştur. Gerçekten de, insan embriyonik kök hücre türetilmiş kardiyomiyositler (HESC-CM) greft ölçüde fibrotik doku 22,23 tabakasıyla ana miyokardiyumundan izole edilmiştir. Benzer sonuçlar Enfarktüslü farelerin 24 kalbine iskelet miyoblastların intramiyokardiyal naklinden sonra gözlenmiştir. Furthermo, yeniden enfarktüslü kalp fonksiyonunu korumak için allojeneik MSC nin uzun vadeli yeteneği farklılaşması 25 sonra bir imünojenik durumuna bir immunoprivileged geçiş ile sınırlı kalmıştır.
Dikkate yukarıda özetlenen sorunlar ve beklentileri dikkate alarak, biz farelerde intramiyokardiyal enjeksiyon yoluyla hücreleri sunmak için burada nasıl göstereceğim. Biz kardiyomyosit kasılma özelliğinin olmadan hücrelerin konak miyokardın ile bağlı ve ince fibrotik bariyer ile kaynaşmış bir kütle oluşturmak olmadığını gözlemlemek. Bazı durumlarda bu sonuç avantajlı olabilir, aşağıdaki analiz hücre nakli de işlevsel olarak bağlantılı miyokard yapıları oluşturmak için modüle edilebilir anlamak için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları, uluslararası (Avrupa Parlamentosu Direktifi 2010/63/EU Sayılı) ve ulusal (UK Home Office, Act 1986) düzenlemelerine uygun olarak yapılmıştır. Burada açıklanan prosedürler İngiltere lisans otoriteleri altında çalışma planımızın bir parçası olan ve kayıt amacıyla alınan olmamıştır.
1.. Hücreler hazırlanması
Bu protokol, gösterim amacıyla, belirli bir hücre çizgisi (insan embriyonik böbrek HEK293 hücreleri) hazırlanmasını tarif etmektedir. Hücre-özel protokoller büyüyen ve sonunda belirli bir hücre soyları içine pluripotent veya yetişkin kök hücreleri farklılaştırarak için istihdam edilmelidir.
- DMEM ortamı,% 1 sodyum piruvat, 2 mM glutamin,% 1 antibiyotik Pen / Strep ve% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ihtiva eden (yüksek glukoz, 4500 mg / L) içinde hücreler büyür. Bir 10 cm plaka normalde 01:03 de bölünmüş olmalıdır ve medya her iki günde bir, taze desteklenmiştir.
- Tryps ile hafif hücre tedavisi01:01 tarif edildiği gibi DMEM ortamı içinde tekrar süspansiyon ve 1x.
- Bir hemositometre odasında hücreleri saymak ve ayrı bir tüpe 3 x 10 6 hücre toplamak.
- 5 dakika boyunca 100 g bir sallanan kepçeli rotor içinde santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın ve steril fosfat tamponu 2x ile hücre pelet yıkayın.
- Immüno-farelerin sol ventrikül içine enjeksiyon için 10 6/50 ul bir konsantrasyonda PBS 1x süspanse edin.
2. Cerrahi öncesi Koşullar
- Her ameliyat öncesi, sıcaklık kontrollü bir izolatör steril gıda pelet ve su (Tablo 1, 22 ° C) ile immüno-fareler (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) koruyun.
- Laminer akış kaputu altında immüno farelerin ameliyat. % 70 Etanol ile çalışma alanı temizleyin ve cerrahi aletleri (forseps ve makas) otoklav.
- Cerrahi ve kurtarma için ısıtma pedleri açın. Isıtma yastıkları önemlidirsırasında meydana gelen vücut sıcaklığının azalma ve post-cerrahi engellemek için.
- Kurtarma ısıtma yastığı temiz ve Otoklavlanmış kafes yerleştirin.
- Izolatör steril bir otoklava torbaya ameliyat odasına orijinal kafeslerde fareler taşıyın.
- Fare tartılır ve vücut ağırlığına göre enjekte deri altından (sc) ve medetomidin fare anestezi için% 0.9 steril tuzlu su çözeltisi içinde seyreltilmiş ketamin hidroklorür ihtiva eden bir çözelti, hem de (kas dinlenmek medetomidin 1 mg / kg ketamin hidroklorid 75 mg / kg).
- Tam anestezi ne zaman (1-2 dakika içinde uyarıldıktan sonra hiçbir ayak tutam refleks) kafesinden fareyi çıkarın
- Göğsünün sol tarafında epilasyon kremi ve boğaz alanı uygulayın. Zaman (yaklaşık 2-5 dakika) uygun bir miktar sonra, bir su-ıslak doku ile gevşek tüyleri silin.
- Bir yatar pozisyonda ameliyat panelde fare yerleştirin. Itibarencerrahın bakış açısı konumu, dikey kuyruk aşağı kafa kadardır.
- Arka bacak, deri altından içine steril tuzlu su çözeltisi (buprenorfin) seyreltilmiş 0.1-0.2 ug / g analjezik enjekte çözüm ve bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak aseptik çözüm povidon iyot ile traş alanı kapsamaktadır.
- Boğaz alanında mikroskobu (2.5X nesnel) odaklanın.
3. Cerrahi Koşullar
- Künt makas biraz krikoid kıkırdak altında yaklaşık 0.5-1 cm uzunluğunda bir orta hat ventral cilt kesi yapmak ile. Tükürük bezleri görselleştirmek için bağ dokusu cilt ayırmak.
- Aynı anda forcep ve manyetik göğüs ekartör ile her bir parçası hafifçe yana çekerek doğal orta hat bölünmesi tükürük bezleri bölmek ve trakea maruz.
- Gırtlak maruz tarafına hafifçe dil çekin. Dikkatlice trakea içine entübasyon tüpü kaydırın. Tüp ucu görüntülenen l yoluyla görülebilirarynx ve nefes borusu. Tüp içinde, ancak açıkça görünür değilse önemlisi, bu yemek borusu bulunmaktadır. Çıkarın ve tüp ucunun konumunu değiştirmek.
- Havalandırma makineye hortumunu. 200 ul ve 150 vuruş / dak inme ses seviyesini ayarlayın. Bir bant ile ameliyat panelde havalandırma hortumu sabitleyin.
- Sol göğüs alana 1.5 cm uzunluğunda cilt kesi - künt makas ve forseps, 1 baş dikey kuyruk yapmak.
- Kesiler yapmadan bağ doku / kas tabakaları ve majör ve minör göğüs kaslarının cildi gevşetin.
- Aşağıdaki gibi, üçüncü ve dördüncü kaburgalar arasındaki torakotomi yapın:
- Kısma ve küçük, yuvarlak forseps ile kazıyarak interkostal kas tabakası delebilir.
- Interkostal kas tabakası delikli sonra, maksimum göğüs boşluğu açmak için göğüs retraktör yerleştirin. Onun üstündeki kulak kepçesi (atrium) ile sol ventrikül (LV) üst ve orta parçalarışimdi görünür.
- Hücreleri ile hassas bir şırınga hazırlayın. Şırınga her bir enjeksiyon için 10 ul hacim içinde bir miktar vermek için gerekir. Şırınganın ucunda bir 30 G iğne Dökme.
- Maruz iğnenin açık ucu dahil olmak üzere, sadece 1 mm bırakarak iğne bant (bir introcan-W 20 G), küçük plastik bir kanül ile tespit edin. Bu, tüm sol ventrikül duvarı delme ve sol karıncık boşluğuna hücreleri enjekte gelen iğne engelleyecektir.
- (Her enjeksiyon enjekte edilen 106 hücre toplam 10 ul sunacak) 5X amaç yardımıyla, bu büyütme sol karıncık da görselleştirmek ve 5 farklı yerlerde, sol ventrikül duvar hücreleri enjekte edilir. Enjeksiyon başarılı olursa, beyaz bir alan ve hücrelerin büyük geri iletim yokluğu (enjeksiyon başarılı değilse, hayvan fonksiyonel analiz dışında olacaktır) görünür olacaktır.
- Ekartörünü çıkarın. Göğüs duvarı b kapatıny 6-0 ipek sütür iki dikiş ile iki ayrılmış kaburga iliştirilen.
- Göğüs kasları ve PBS 1x içinde boğulmuş bir ucu pamuklu cildi nemlendirmek ve yavaşça geri forseps ile orijinal konumuna kas koymak.
- 6-0 ipek sütür 3-4 dikiş ile cilt kapatın. Cilt kapatmak için 2-3 dikiş ile boğaz kesi dikin.
- Anestetik etkileri dönmek için atipamezol (1 mg / kg nihai konsantrasyon) enjekte edilir.
- Fare özerk solunum başladığında kısa sürede, trakea tüpü çıkarmak ve sağ tarafı üzerine fare koymak. Fare dakika içinde kurtarmak bekleniyor.
- Fare açmak ve yürümek, bir saat için sıcak kurtarma kafesi (kapalı süzülür üstüne küçük IVC kafes) yerleştirmek için başlar.
- Kontrollü ısıtmalı kutu (37 ° C), gece boyunca hayvanlar bırakın.
- Ameliyat sonrası ilk 2 gün boyunca toparlanmayı desteklemek için su ve pelet gıda ile bir çanak doldurun.
Aşağıdaki gibi hücreleri ve 10 kontrol enjekte değil kalpleri ile enjekte On kalpleri histolojik analiz edilmektedir:
- 1 hafta enjeksiyonu (Şekil 1 ve 3) 'den sonra aşılanmış hücre analizi yapın.
- Izofluran doz aşımı ile ötenazi sonra, doku düzeltmek için% 4 paraformaldehid (PFA) 20 ml ile kalpleri serpmek. (% 70-100 den) etanol yüzdeleri artan ve parafin bloklar gömmek de sabit doku dehydrate.
- Bölüm morfolojik analizler için hematoksilin ve eosin ile 5 um ve leke bir mikrotom ile parafine kalpler.
- Masson Trichrom leke kullanarak bağ dokusu gözünüzde canlandırın.
- Bir slayt tarayıcı mikroskop (Şekil 1A, 2A, 3A, 3B, 3C ve) altında görüntüleri analiz ve dijital slayt tarayıcı mikroskobu (Figu kullanarak kısa eksen görünümde tüm kalp görselleştirmekres 1B ve 1C).
- Yukarıdaki analizler, ksilen içinde kalp dokuları deparaffinize sonra, etanol içinde yüzde azaltmada örnekler daldırarak (% 100 su için) ve Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) için proses aşağıdaki gibi göre rehidrate:
- 1 saat boyunca 0.1 M fosfat tamponu içinde% 1 tannik asit ile deparafinize blokları inkübe edin.
- (25-100% 'dan itibaren) etanol yüzdesi artan örnekleri kurutmak.
- HMDS (heksametildisilazan) ile Kuru örnekleri.
- Acheson Gümüş dağı ve altın-paladyum ile kaplamak onlara ile Stubbs üzerinde örnekleri monte edin.
- Analitik bir taramalı elektron mikroskobu (Şekil 2B) View örnekler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz, ince uzun kardiyomiyositlerde (Şekil 1A) ile karşılaştırıldığında bir parke taşı şekli ile (Şekil 1) en farklı morfoloji ile kalp hücrelerden ayırt edilebilir HEK293 hücreleri, enjekte edildi. HEK293 hücreleri nedeniyle artan nükleer içeriği (Şekil 1A) muhtemel kardiyomiyositlerin (pembe renkli), karşılaştırıldığında hematoksilen boya (mavi renk) daha reaktif edildi. Bundan başka, ana doku enjekte hücreleri ayırt etmek için, HEK293 hücreleri, enjeksiyondan önce, 2 saat DAPI ile etiketlenmiştir. Şekil 1E 'de gösterildiği gibi-etiketli hücreler miyokardiyal dokuda görünür. Kontrol numaradan ameliyat farenin bütün kalp (Şekil 1C) ve doku (Şekil 1D) bütünlük içinde herhangi bir hasar gösterdi.
Kalp bütün bir kısa eksen görünümünde, enjekte edilen hücreler enjeksiyon alanında (Şekil 1B) ve homojen bir grup olarak görünür. Gruplandırılmış carşın trichrome boyama (Şekil 2A), mavi bir alan olarak ortaya fibrotik doku ince bir tabaka ile çevrilidir edilmiştir. Taramalı Elektron Mikroskobu (Şekil 2B), dolayı kontraktil fonksiyon ve farklı hücre yapısı olasılığı ile gösterildiği gibi, hücreler, konakçı miyokardiyal doku ile bağlı değildi.
Yukarıdaki gözlemlere ek olarak, iğne (Şekil 3A) enjekte edilmiştir hasar küçük alanlara kaydetti. Bu alanlar miyokardiyal duvar kalbin dış epikardiyal tabakası (Şekil 3A) çalıştırın. Enjekte edilen hücreler (yeşil ok, Şekil 3B), yaralı alan (siyah oklar, Şekil 3B) yakınında yer almaktadır. DAPI-pozitif hücreler, enjeksiyon yerinde (Şekil 3C, beyaz oklar) boyunca görünür. Bir hafta yaralanma sonrası, Tünel tahlil nekroz düşündüren, yaralanma yerinde artan apoptotik hücrelerin göstermemiştiryerine apoptoz daha iğne enjeksiyonu (Şekil 3D) sonra meydana gelmiştir.
Şekil 1. Enjekte edilen hücrelerin histolojik analizi. Hücre enjeksiyon kalpler parafın içine gömülmüş ve hematoksilin ve eozin boyama için işlenmiştir A) bir hafta sonra. Enjekte HEK293 hücreleri, sol ventrikül duvar mevcuttu. Görüntüler) bir stereo floresan mikroskobu. B ile elde edilmiştir, Trichrome ile boyanmış dokular ve (ok) enjekte edilmiştir burada, hücreler aynı bölgede gruplandırılır olduğunu gösterdi. Sağ alt paneller kısa eksen sağa (RV) ve sol ventriküller (LV) ile görüntüleyebilirsiniz göstermektedir. Kırmızı dikdörtgen hücreler (1.5x) korunur alanını gösterir. Görsel bir slayt tarama mikroskobu ile kaydedilmiştir. C) Trichrome stkontrol sham kalplerin Aining. 5X objektif. D) miyokard doku bütünlüğünün. E gösteren sham farelerin trikrom) ile bütün kalp görünümü HEK293 hücreleri enjeksiyon öncesi DAPI 2 saat ile boyandı. Enjeksiyon kalpler 6 mikron at Ekim gömülü ve bir cryostat kesitli bir hafta sonra. Hücreler, floresan mikroskobunda UV altında görselleştirilmiştir. Sol ve sağ karıncıklar gösterilir. Sağ ventrikül, sağ panel, beyaz çizgi epikardiyal tabaka işaretler. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Enjekte edilen hücrelerin ve ana doku arasında bir fibrotik tabakasının oluşumu. A) trikrom gösterisiHEK293 hücreleri ve murin miyokardiyal doku (oklar) arasında oluşan kollajen doku. Görüntüler, bir dijital tarayıcı mikroskop ile kaydedilmiştir. B) Kalpler Taramalı Elektron Mikroskobu için deparafinize ve işlenmiştir. Görüntüler bir taramalı elektron mikroskobu ile kaydedilen ve enjekte HEK293 hücreleri (sol taraf) ve konak miyokardın (sağ tarafı) arasında kollajen lifleri (oklar) göstermektedir edildi. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Hücre enjeksiyonu hasar küçük alanlarda üretti. A) trikrom iğne (mavi renk enjekte edildi hasar küçük alanları gösterir;.) Okları B) Parafin kesitleri Trichrom sta tarafından boyandıining ve hücreler enjekte edilmiştir alan siyah oklarla gösterilir. Enjekte edilen hücreler (yeşil ok) DAPI 2 saat önce enjeksiyon ile boyanmış HEK293 hücreleri, enjeksiyon yerinde (beyaz ok) boyunca mevcut olan) yaralandı alan. C yakınlık görünür. Enjeksiyon sitesi yeşil bir ok ile gösterilen ve açık beyaz çizgi parafin bölümlerinde gerçekleştirilen, perikard tabakası. D) Tunel Deneyi işaretler, ilgili floresan pozitif çekirdekler gelmedi edilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, kemirgen kalbimizde hücrelerin intramiyokardiyal enjeksiyon gerçekleştirmek için nasıl göstermiştir. Bu metodolojinin bir kanıtı olarak, biz HEK293 hücreleri kullanılmıştır. Bu HEK293 hücreleri herhangi bir hücre tedavisi çalışmada kullanılan ve bu nedenle bu yazının bulguları bir tedavi yaklaşımı doğrudan çeviri için uygun değillerdir olduğunu vurgulamak önemlidir. Bununla birlikte, HEK293 hücreleri kasılma hücreleri değildir ve diğer hücre tiplerinde transdifferentiate yok olması, bu teslim edilecek hücrelerin özellikleri ve teslimat yolu olarak teknik açıdan dikkat odaklanmaktadır.
Bu intrakoroner yol yaralanma yerinde daha homojen bir dağılım sağlamak oysa bir intramiyokardiyal yol, kardiyak doku 24,26 gömülü hücre kümeleri neden eğiliminde olduğu bildirilmiştir. Kardiyomyosit değiştirilmesi için, ideal bir donör hücre elektrofizyolojik, yapısal ve kasılma properti sergilemelidirkardiyomiyositlerin es ve transplantasyon öncesi istihdam edilecek bir hücre farklılaşması program için gerekliliğini düşündüren, konak dokuya yapısal ve fonksiyonel entegre gerekir.
Aşağıdaki gibi başarılı bir cerrahi için önemli noktalar şöyle özetlenebilir:
- Kalp atış hızı yavaş ve hücre enjeksiyon kolaylaştırmak için enjekte edilebilir bileşikler ile fareler anestezi
- Akciğerler işlevselliği lehine farelerin intratrakeal kanülasyon gerçekleştirin.
- Doğru nefes almak için göğüs kas işlevlerini korumak için kas kesi kaçınarak torakotomi gerçekleştirin.
- Kalbi açığa sonra, enjeksiyon (soluk renk olarak görünür) oluşup oluşmadığını görselleştirmek için bir mikroskop altında sol ventrikül gözlemlemek.
- Miyokardiyal doku geniş bir delik açılmasını önlemek için ince bir iğne ve hassas bir şırınga kullanın ve sırasıyla malzemenin istenilen miktarda enjekte edilmesiyle gerçekleştirilebilmektedir.
- O açığa plastik bir boru sistemi ile iğne kınınauç kısmını nly. Bu, ventriküler boşluk içine enjeksiyon kaçınarak, sol ventrikül (0.5 mm) içine, belirli bir derinliğe kadar iğne giriş izin verecektir.
- Dış basınç akciğerlerin maruz kalmasını önlemek için dikkatli bir kaburga arasında göğüs ve uzay kapatın.
Bu teknik, ameliyat sonrası sağlık koşulları öncelik ise yüksek bir başarı seviyesine sahiptir. Hayvanlar yoğun sıkıntı ve ağrı belirtileri için bir hafta için her gün kontrol edilmelidir. Operasyon sonrası gerektiği gibi ağrıyı kontrol etmek için bir analjezik bileşimlerinin enjeksiyonu yapılmalıdır. Örneğin lidokain gibi ağrı kesici, topikal uygulama da kullanılabilmektedir. Kanama dikkatli cerrahi teknikler ile önlenmelidir. Meydana Ancak, bu damarların sıkıştırma veya ligasyonu ile durdurulabilir. Bu hayvanlar cerrahi sonrası 12-20 saat boyunca 37 ° C'de bir ısıtma kutu içinde kalan daha iyi ve daha hızlı geri kaydetti var. Bu tedavi, bu hızlı sıcaklık düşüşü engellemek, ne doyurmayaderecede anestezi cerrahi prosedürü ve uygulandıktan sonra meydana gelen. Cerrahi sonrası enfeksiyonlar ortaya çıkabilir ancak% 1'den daha az olması gerekir. Aseptik işlemler kesinlikle enfeksiyonu önlemek için takip edilmelidir. Lokal enfeksiyon antibiyotik uygulaması ile tedavi edilebilir. Önemli olarak, dehidrasyon salin deri altına enjeksiyon ile kontrol edilmelidir.
Bu tür izofluran gibi, inhale anestezi üzerine enjekte edilebilir tatbik edilmesi tercih edilir. Nitekim, biz enjektabl anestezik hayvan rahatsızlığa neden olmadan daha kolay enjeksiyon ve daha az kanama sağlayan, kalp azaldığı görülmüştür.
Invaziv rağmen, farelerde hücreler (25-50 ul), küçük hacimli enjeksiyon yapılabilir ve güvenlidir. Bu, sol ventrikül duvarı (10 ul / enjeksiyon) 5 farklı alanlarda HEK293 hücreleri 50 ul enjekte edilerek% 1'den daha az mortalite vardı. Bu metodoloji, önemli olan miyokard duvar, çeşitli alanlarda hücrelerin varlığını sağlamıştıriskemik hasar genişletilmiş alanları teslim hücreler tarafından ulaşılabilir gerektiğinde kök hücre tedavisi. Farklı laboratuvarlarda kendi uyarlık doğrulanması için henüz rağmen daha az invazif cerrahi gerçekleştirmek için, çeşitli protokoller son zamanlarda yayınlanmıştır. Örneğin, hücre enjeksiyon yüksek çözünürlüklü ekokardiyografi 27 çok yakın olarak göğüs tekniği ile gerçekleştirilebilir. Bu sistemin kullanımı, iki boyutlu bir görüntü olarak açık bir şekilde, sol ventrikül duvarı görselleştirmek ve normal sistolik / diastolik döngüsü boyunca belirli bir konumda tutmak için bir iğne operatör deneyimi gerektirir. Bu tekniğin avantajı, miyokard enfarktüsü, indüksiyondan sonra klinik olarak anlamlı bir zaman dilimi içinde istenilen yerlere fare miyokard içine hücrelerin implantasyonu. Ancak, bu yaklaşım, çünkü ikinci bir ameliyat geçiren 2 hayvanların artmış mortalite, miyokard enfarktüs indüksiyon veya transaortik bantlama gibi cerrahi işlemler ile mümkün değildir7. İlginçtir, Hamdi ve arkadaşları bir Gelfoam epikardiyal bölgede 28 üzerine inşa hücrelerin doğuma karşılık doğrudan intramiyokardiyal enjeksiyon karşılaştırıldı. Bunlar intramiyokardiyal hücre enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında hücre epikardiyum üzerine inşa kaplayan daha iyi aşı işlevsellik neden olduğu görülmektedir ve bu teknik tekrarlanabilir olduğunu bildirdi, kullanıcı dostu ve hayvanlar 28 için daha az travmatik.
Hücre enjeksiyon deneylerinde önemli bir özelliği hücrelerin izleme ve onların hayatta kalabilmek. Biz, HEK293 hücreleri, kalp hücreleri ile karşılaştırıldığında nedeniyle ayırt morfolojisine tespit etmek kolay olduğunu göstermiştir. Bu hücreler, enjeksiyon (veriler gösterilmemiştir) hayatta kalmış ve cerrahi bir hafta sonra doku içinde muhafaza edilmiştir. Uzun süreli çalışmaları için hücreler iz ve teslimat doku hem de diğer dokulardaki kendi naklini analiz etmek için, çeşitli teknikler floresan etiketlemesi ve balık da dahil olmak üzere kullanımda olansex-uyumsuzluğu transplantasyon deneylerinde 29 nalysis. In vitro gelecek çalışmalarda analizleri doğru önemlisi, in vivo görüntüleme önemli bir rol oynayacaktır. Gerçekten de, histolojik yöntemlere göre in vivo görüntüleme bir avantajı, ötenazi 29 gerek kalmadan aynı hayvanlarda uzunlamasına çalışmalarda hücrelerin takibi. Bu yöntemde, hücreler, pozitron emisyon tomografisi (PET) ve manyetik rezonans (MR) ile görüntülenebilir için biyoışıldama reaktifler, demir parçacıkları ve spesifik raportör genleri ile işaretlenebilir.
Bizim analizler göstermiştir ki bu tercihen bir kollajen ince bir doku ile çevrili olarak enjekte edilmiştir bölgede gruplandırılır HEK293 hücreleri gibi kontraktil olmayan hücreler. Bir immüno-fare fibrotik doku oluşumuna yol açan patofizyolojik mekanizması bilinmemektedir, ancak, nakledilen hücrelerin göründüğü kollajenli doku, en uç noktasına benzer olabilir,Doku uyumlu implant. Bu durumda, egzojen malzeme iltihaplı hücreler tarafından çıkarılamaz ve çevre dokulardan izole fibrotik bağ dokusu, yoğun bir tabaka içinde kapatılmış hale gelir. Benzer şekilde yara iyileşmesinin son aşama fazlara, bu zerre şekilli ve çok vaskülarize doku ve implante edilmiş malzemeden hayatta sağlar.
Intramiyokardiyal iğne enjeksiyon çevreleyen dokuya zarar küçük bir alanı üretti, ancak teknik olarak, burada açıklanan yöntem, başarılı oldu. Kardiyak fonksiyon ölçümleri bu incelemenin amacı olmasa da, gelecekte yapılacak çalışmalar minör doku hasarı hücre tedavisi analizler perturb olup olmadığını araştırmak gerekir. Ayrıca, enjekte bölgede üretilen yaralanma enjekte edilen hücrelerin miktarı ile ya da her ikisinin bir kombinasyonu ile, iğne neden olup olmadığını analiz etmek için önemli olacaktır.
Bizim bulgular destek olarak, bu Transplantasyonu gösterilmiştirbağışıklığı baskılanmış farelerin sağlıklı kalp (NOD-SCID) içine% 20-25 kardiyomiyositlerin (HESC-CM) içeren farklılaştırılmış insan embriyonik kök hücreleri (hESC) karışık nüfus n kardiyomiyositler organize ve olgunlaştı haline geldiği greft hızlı oluşumu ile sonuçlandı zaman ve noncardiomyocyte nüfusun üzerinde 23 kaybetti. İlginç bir şekilde, yazarlar HESC-CM büyük ölçüde elektrofizyolojik sinsityum 22,23 oluşumunu engelledi fibrotik doku tabakasıyla ana miyokardiyumundan izole edilmiştir olduğu görülmektedir. Farklı bir çalışmada, Kehat vd. HESC-CM başarıyla tam kalp bloğu ile domuz ventrikül tempolu bulundu. Bu çalışma, nakledilen hücrelerin hayatta görev ve konakçı hücreler ile entegre elektronik kalp pili 30 için biyolojik bir alternatif olarak işlev görme yetenekleri için kanıt temin eder gösterdi. Bu iki uyumsuz sonuçlar ho yapısı ve fonksiyonundaki fark ile mutabakatıst ve donör türler. Gerçekten de, nakledilen kardiyomiyositlerin bağlama etkinliği ev sahibi ve donör hücrelerin göreceli dayak frekansına bağlı olabilir mümkündür. Van Laake çalışmasında 23, işlevsel kavşak oluşumu nedeniyle insan kardiyomiyositlerin farklı dayak frekansa kemirgen kardiyomiyositlerin karşı (60-100 bpm) (300-600 bpm) için bozulmuş olabilir. Kehat analiz 30'da tarif edildiği gibi bu, domuz nakil deneylerinde karşı insanda böyle olmaz.
Gözlem süresinin uzunluğu başka bir karıştırıcı faktördür. miyokard infarktüsü, yalnızca kısa süreli zaman noktalarında (4 hafta) kalp fonksiyonu ameliororasyonunu sağlandıktan sonra HESC-CM kemirgen kalp naklediliyor. Ancak, 12 hafta, kalp fonksiyonu daha greft sağkalım 23 rağmen devam değildi. Yazarlar greft boyutu (hücrelerin artmış miktarda) geliştirilmiş uzun süreli kardiyak SURV ile ilişkili olmadığı görülmektedirUzun vadeli, kısa veya orta vadeli analizlere karşı analizleri belirten IVAL ve fonksiyonel düzelme 31, enjeksiyon için hücrelerin sayılarının artmasını gerektirmeden gelecekteki çalışmalarda yapılmalıdır.
Bu çalışmada, birkaç soru transplante edilecek hücre tipine, test edilecek konakçı verici türlerinin seçimi ve hücrelerin aritmik potansiyelinin değerlendirilmesi ile ilgili ayrıntılı kalır. İdeal olarak, değiştirme veya kalp pili fonksiyon için miyokard içine implante kök hücreleri gerektiği kalan miyositler ile işlevsel çift. Miyokard infarktüsü sıçan modelinde, Fernandes ve ark. 32. kontrollerle karşılaştırıldığında myoblast enjekte yüreklerinde ventriküler aritmi artan bir uyanlabilirlığmı gösteren, aritmi yatkınlığı değerlendirmek Programlı Elektrik Stimülasyon (PES) kullanılır. Aynı çalışmada, kemik iliğinden elde edilen otolog hücrelerinin enjeksiyonu artan bir inducibil ile sonuçlanmamıştırventriküler aritmi Sığ böylece miyoblastlardır belirli aritmojen risk gösterdikleri sonucuna yazarları lider, kontrollere kıyasla. Etkili bir enfarktüs yara ya da sınır bölgesi içinde kümeler halinde aşılanmış fakat farklı bir çalışma göstermiştir, kemik iliğinden türetilmiş hücreler (BMC) hiçbir elektronik Ca 33 geçici dalgalanmalara uyandırdı. İlginçtir, Wei ve ark. Mezenkimal kök hücreler (MSC) enfarktüse kalplerinde hayatta kalma döneminde olgun kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik özellikleri kazanmak olmadığını gösterdi. Ancak, elektrik açığını hafifletmek ve ventriküler aritmi 34 teşvik yok.
Kök hücre terapisinin etkinliği ve aritmi oluşumu hücrelerde hem de dağıtım yolları bağlıdır. Kalp fonksiyonunu iyileştirmeye rağmen Nitekim, sıçan kalplerinde Mİ 35 sonra, intramiyokardiyal BMC enjeksiyonlar, ardışık ventriküler erken kasılmalar ve ventriküler taşikardisi arttıİlk 14 gün boyunca ia. İntrakoroner rota kullanıldığında, ventriküler aritmi oluşumu belirgin azalmıştır. Klinik çalışmalarda, enjekte edilen hücrelerin pro-aritmik fonksiyonu iskemik kalp hastalığı için belirtildiği gibi hastaların çoğunda beta-bloke edici maddeler olarak değerlendirilmesi almak zordur. Beta-blokerleri ile tedavi nakledilen hücrelerin potansiyel pro-aritmik bir etki maske olabilir. Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar, bu nedenle kök hücre tedavisi pro-aritmik uyaranların bazlar değerlendirmek için çok önemlidir.
Özetle, bizim veri farelerde intramiyokardiyal hücre enjeksiyonu yapılabilirliğini gösterir ama aynı zamanda hücre aşılama güvenliği koşulları ile ilgili ayrıntılı bir analiz için gereğini vurguluyor. İnsanlarda, bu hücre enjeksiyon pro-aritmi 36-38 ile ilişkili olduğu gösterilmiştir 39 restenoz, ateroskleroz 40 ve 41 koroner tıkanıklığı hızlandırılmıştır. Temel araştırma, gelecekteki klinik uygulamasında önemli olacaktırHücreler teslim edilmelidir ki anlamak Atıf, teslimat şekli, hücre aracılı miyokardiyal fonksiyon onarım mekanizmaları ve tüm insan nüfusu yarar otolog hücre transplantasyonu protokole karşı bir alogeneik tasarım. Çünkü büyük klinik çalışmalar ile ilgili yüksek maliyetler, verimlilik ve transplantasyon protokollerin etkinliği tekrarlanabilirliği gibi burada anlatılanlar gibi klinik öncesi modellerde ele alınması gerekmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz mikroskopi analizi ve kardiyak onarım, Teknisyenlerin ve hayvan tesis Yöneticisi ilgili projelerinin desteklenmesi için Magdi Yacoub Enstitüsü (Myi) teşekkür ederim. Bu çalışma İngiliz Kalp Vakfı (BHF), Proje hibe PG/10/019 tarafından desteklenmiştir. MPS myi ve BHF tarafından desteklenmektedir. TP Bir BHF-Araştırma Mükemmellik üyesidir. NR bir NH & MRC Avustralya üyesidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolator | Pfi systems | Quotation needed | |
| Heating Pad | Vet Tech Solutions | HE006 | For small animals |
| Medetomidine | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Ketamine hydrochloride | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Atipamezole | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Hair removal cream | commercial shops | ||
| Buprenorphine | NVS | Veterinary prescription is necessary | |
| Leica MZFLIII microscope | Leica | Model S6E | With swing arm stand TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner | Hamamatsu | RS series | |
| Scanning Electron Microscope | Jeol | JSM-6610 | |
| Blunt scissors | FST | 14084-09 | |
| Minivent | Harvard Apparatus | 73-0043 | Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844) |
| Forceps | FST | 11052-10 | |
| Retraction system | FST | 18200-20 | Kit for animals up to 200 g |
| 30 G 12 mm; ½ inch | BBraun | A210 | Fine yellow |
| Microliter syringe | ESSLAB | 81201 | Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700 |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | W1614T |
References
- Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
- Taylor, D. A., et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929-933 (1998).
- Suzuki, K., et al. Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation. 104, 207-212 (2001).
- Suzuki, K., et al. Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function. Circulation. 110, 225-230 (2004).
- Robinson, S. W., et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant. 5, 77-91 (1996).
- Muller-Ehmsen, J., et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 107-116 (2002).
- Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M., Schneider, M. D. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J. Clin. Invest. 115, 572-583 (2005).
- Oettgen, P., Boyle, A. J., Schulman, S. P., Hare, J. M. Cardiac Stem Cell Therapy. Need for Optimization of Efficacy and Safety Monitoring. Circulation. 114, 353-358 (2006).
- Krause, K., et al. Percutaneous intramyocardial stem cell injection in patients with acute myocardial infarction: first-in-man study. Heart. 95, 1145-1152 (2009).
- Rodrigo, S. F., et al. Intramyocardial injection of bone marrow mononuclear cells in chronic myocardial ischemia patients after previous placebo injection improves myocardial perfusion and anginal symptoms: an intra-patient comparison. Am. Heart J. 164, 771-778 (2012).
- Smith, R. R., et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation. 115, 896-908 (2007).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 2, 173-181 (2009).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Malliaras, K., et al. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Circulation. , 125-1100 (2012).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, 763-776 (2003).
- Bearzi, C., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15885-15890 (2009).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, 2369-2379 (2012).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, 895-904 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, 1847-1857 (2011).
- Brunt, K. R., Weisel, R. D., Li, R. K. Stem cells and regenerative medicine - future perspectives. Can. J. Physiol. Pharmacol. 90, 327-335 (2012).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem Cell Res. 1, 9-24 (2007).
- Leobon, B., et al. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7808-7811 (2003).
- Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, 2419-2429 (2010).
- Reinecke, H., Poppa, V., Murry, C. E. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 241-249 (2002).
- Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, 1307-1314 (2005).
- Hamdi, H., et al. Cell delivery: intramyocardial injections or epicardial deposition? A head-to-head comparison. Ann. Thorac. Surg. 87, 1196-1203 (2009).
- Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marban, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circ. Res. 106, 479-494 (2008).
- Kehat, I., et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
- van Laake, L. W., et al. Improvement of mouse cardiac function by hESC-derived cardiomyocytes correlates with vascularity but not graft size. Stem Cell Res. 3, 106-112 (2009).
- Fernandes, S., et al. Autologous myoblast transplantation after myocardial infarction increases the inducibility of ventricular arrhythmias. Cardiovasc. Res. 69, 348-358 (2006).
- Scherschel, J. A., Soonpaa, M. H., Srour, E. F., Field, L. J., Rubart, M. Adult bone marrow-derived cells do not acquire functional attributes of cardiomyocytes when transplanted into peri-infarct myocardium. Mol. Ther. 16, 1129-1137 (2008).
- Wei, F., et al. Mesenchymal stem cells neither fully acquire the electrophysiological properties of mature cardiomyocytes nor promote ventricular arrhythmias in infarcted rats. Basic Res Cardiol. 107, 274 (2012).
- Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
- Bartunek, J., et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 112, 178-183 (2005).
- Britten, M. B., et al. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation. 108, 2212-2218 (2003).
- Smits, P. C., et al. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2063-2069 (2003).
- Kang, H. J., et al. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 363, 751-756 (2004).
- Fernandez-Aviles, F., et al. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res. 95, 742-748 (2004).
- Vulliet, P. R., Greeley, M., Halloran, S. M., MacDonald, K. A., Kittleson, M. D. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 363, 783-784 (2004).
