Summary
מאמר זה מתאר כיצד יכול להיות משותק דג הזברה מבוגר, מחוברת לצינורות, ומשמש לניסויי in vivo אלקטרו לאפשר הקלטות ומניפולציה של פעילות עצבית בבעלי חיים בשלמותה.
Abstract
בעבר, מחקרי אלקטרו בדג זברה מבוגר היו מוגבלים לחתוך תכשירים או להכנות כוס העין והקלטות electrorentinogram. מאמר זה מתאר כיצד יכול להיות משותק דג הזברה מבוגר, מחוברת לצינורות, ומשמש לניסויי in vivo אלקטרו, המאפשר הקלטה של פעילות עצבית. חוסר תנועה של המבוגר דורש מנגנון כדי לספק חמצן מומס לזימים במקום תנועת buccal וopercular. בעזרת הטכניקה שלנו, בעלי חיים הם משותקים וperfused עם מים בסביבה כדי למלא דרישה זו. פתיחת גולגולת מתבצעת תחת methanesulfonate tricaine (MS-222; tricaine) הרדמה כדי לספק גישה למוח. האלקטרודה הראשית אז ממוקמת בתוך חלון פתיחת הגולגולת כדי להקליט את פעילות מוח תאית. באמצעות השימוש במערכת זלוף multitube, מגוון רחב של תרכובות תרופתיים יכול להינתן לדגים בוגרים וכל שינויים בפעילות העצביתניתן לצפות. המתודולוגיה לא רק מאפשרת לתצפיות שנעשו לגבי שינויים בפעילות נוירולוגית, אבל זה גם מאפשר להשוואות שנעשו בין הזחל ודג זברה מבוגר. זה נותן לחוקרים את היכולת לזהות השינויים בפעילות עצבית עקב כניסתה של תרכובות שונות בשלבי חיים שונים.
Introduction
במאמר זה, פרוטוקול מתואר לקבלת בהקלטות vivo של פעילות עצבית בדג זברה מבוגר. שיטות הקלטה תאית משמשות, מתן מדידות מתח של פעילות חשמלית בתוך אזור קטן של רקמה עצבית. שיטה זו של חקירה כרוכה במעקב אחר מספר גדול של תאים בבעלי חיים מתנהגים 1. בעבר, הקלטות פרוסה כבר בוצעו בשני מבוגרים וזחלים, כמו שיש לי הכנות כוס העין והקלטות electroretinogram. ניסויים אלה במידה רבה כבר בוצעו לפרטים תגובות פיסיולוגיות של מערכות חושיות שונות 2-5. עד לאחרונה, הכנות מוח שלמות היו זמינות לביצוע אלקטרופיזיולוגיה עם 3,6,7 זחל דג הזברה, בהם פיזור נשימה וחמצן יכול להתרחש דרך העור בלבד. ההכנה שלנו מאפשרת פעילות נוירולוגית יליד דג הזברה מבוגר כדי להימדד בעוד החיה נשארה בהכרה מלאה ומודעת oו סביבתו.
דג הזברה (Danio rerio) לשחק כרגע תפקיד בסיסי כמודל למחקרים גנטיים, טוקסיקולוגי, תרופתיים, וphysiopathological 3. דג הזברה זכה לנראות בתחום של מדעי המוח, כי הם חולקים הומולוגיה נרחבת עם יונקים ברמות גנטיות, העצבית והמערכת האנדוקרינית 8. במהלך העשור האחרון, טכניקות neuroanatomic וimmunohistochemical סטנדרטיות היו בשימוש כדי לקבוע את הארגון האופייני מפורט של מערכת עצבים דג הזברה 9-12 ושל ההפצה של נוירוטרנסמיטרים שונים 3,8,13. לאחרונה, חוקרים העבירו את המיקוד שלהם ללימודים תפקודיים 14,15, שרבים מהם במרכז על תהליכים התנהגותיים 16-19 ומאפיינים של מערכות אלקטרו חושיות 2,13,20. מספר קטן של מחקרים אלה התמקדו בפעילות החשמלית של אזורים הספציפיים של adult מוח דג הזברה 21-23, אך לא בוצעו באמצעות vivo בגישה.
פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ללימודי אלקטרו של שתי פעילות הספונטנית ועוררה בתוך מערכת עצבים דג הזברה כדי לתאר את דפוסי פעילות באזורי מוח מסוימים. השימוש בטכניקה זו מאפשר השוואות שיש להבחין בין פעילות הנוירולוגית של שלבי זחל צעירים ומבוגרים. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו מאפשר השוואה בין שינויים גנטיים או תרופתיים. יחד עם גישות אחרות, כגון הנדסה גנטית או בדיקות פרמקולוגיות, שיטה זו מציעה אפשרות חדשה לניתוח הפונקציונלי של תקשורת העצבית ופלסטיות בבעלי החיים הבוגרים בשלמותה, כמו גם ליישומים אפשריים, כגון לומד אפילפסיה התחלה מאוחרת או תהליכי ניוון עצבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי הניסוי נערכו בהתאם קפדן עם המכון הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואחרי # A2011 פרוטוקול 09-003, שנסקר, שאושר, ותחת פיקוח של אוניברסיטת ג'ורג'יה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.
1. התקנת ציוד
- מערכת זלוף לפתיחת גולגולת
חוסר תנועה של המבוגרים מחייבת מערכת אינטובציה כדי לספק חמצן מומס לדגים. מגוון רחב של מערכות יכול להיות מנוצל, אבל מערכת הכבידה פשוטה מורכבת מזרק 60 מיליליטר משמשת. לרומם את הראש בלחץ לגובה באופן עקבי תשואות קצב זרימה של ~ 1 מיליליטר / דקה. מזרק זה יכול להיות ממוקם בסדרה עם המזרקים המשמשים לאחר מכן למערכת זלוף אלקטרו.- השג צינור יחיד 60 מיליליטר Luer נעילת מזרק ולהסיר את הבוכנה.
- להשעות את המזרק כ 8 ב&# 160; מעל הבסיס של טבעת דוכן באמצעות מהדק.
- חבר ברזלים בכיוון אחד לסוף של המזרק. לקצה השני של ברזלים, להתחבר לצינור, 2 מ"מ קוטר, שהוא מספיק זמן כדי להאריך לבסיס אינטובציה.
- מערכת זלוף לאלקטרופיזיולוגיה
לניסויים אלקטרו, הוא לעתים קרובות יש צורך להציג מגוון רחב של תרכובות במהלך ניסוי. מגוון רחב של מערכות זמינים, אך מערכת הכבידה בהיקף של 60 מיליליטר מזרקים בסדרה ניתן להשתמש. התקנה זו מאפשרת להקדמה פשוטה, סידורי של פתרונות להתבצע על ידי פתיחת השסתום המתאים.- השג שתיים או יותר 60 מיליליטר מזרקים נעילת Luer ולהסיר את הבוכנות מכל אחד. מזרק אחד נדרש לניהול מים בסביבה לדגים בזמן כל צינור שלאחר מכן ניתן להשתמש כדי לנהל מגוון רחב של תרכובות תרופתי לדגים.
- חבר מזרק אחד ל3 -דרך ברזלים עם חיבור Luer.
- השתמש ⅛ בקוטר חיצוני צינור (OD) כדי לחבר את המזרקים בסדרה עם מנעול Luer זכר בקצה אחד.
- לאבטח את המכשיר כזה שראש הלחץ גבוה לגובה של 27 במעל הבסיס, או שגובה באופן עקבי תשואות קצב זרימה של ~ 1 מיליליטר / דקה.
- צינורית אינטובציה
צינורית אינטובציה מאפשרת הכניסה של נוזל לדגים. התקנה זו מספקת הן גמישות ומוצקות לעמדה הטובה ביותר את הצינורית בתוך הפה של החיה.- באמצעות כל זוג כללי של מספריים (לדוגמא. Fiskars) או סכין גילוח, להסיר סעיף 1.5 סנטימטר מהקצה הרחב של קצה פיפטה P-200.
- הכנס חתיכת מ"מ 6 סנטימטר x 1 של צינורות לשסתום הפחתה עם כובע נשי Luer מנעול וכפת מתכת סיליקון, כלומר מתאם טוהי Borst, והכנס את צינורית זה לקצה פיפטה שונה. החזק את קצה פיפטה בעמדה עם l Luerock באמצעות חלק קצר של ⅛ בצינורות בקוטר.
איור 1
- בסיס אינטובציה
מנה זו משמשת להחזיק בעלי החיים משותקים בעמדה יציבה, זקופה וכדי להקל על ההסרה של נוזל הזנת בעלי החיים באמצעות אינטובציה. אם זה לא הוקם בצורה נכונה, וריכוז יכול להתרחש, מה שמוביל לאותות רטט פולשניות בהקלטת אלקטרו.- השג את צלחת הבסיס של צלחת פטרי פלסטיק x 15 מ"מ 100 מ"מ.
- שימוש בכלי הלחמה, להמס חור, 6 מ"מ קוטר ו7.5 מ"מ מתחת לשפה לשפה, לצד השני של הצלחת. באמצעות אותו הכלי, להמס חור, 10 מ"מ קוטר ו11 מ"מ מתחת לשפה של המנה ~ 74 ° נגד כיוון השעון מ חור קטן יותר. חור זה ישמש כחור הניקוז.
- הכנס צינור, 1 סנטימטר קוטר, לתוך החור עם הסוף הרים כזה שסופו של הדבר לא יכול להיות חסום. ואז להוסיף טיפ P-200 pipetteman לתוך החור הקטן, זה ישמש כצינורית דמה.
- , עם צלחת פטרי מוגבהת מעט בצד של החור הגדול יותר לשפוך שעוות שימורים נמסה לתוך הצלחת כך שהחור הצינורית הוא פשוט מכוסה. האזור ישמש כתחנה, ומאפשר את הצינורית להיות מוכנסת ~ 3 מ"מ לתוך הפה של הדג. להגדיר את זה צריך להיות מותר לחזק.
- שימוש בקצה מתכת מחומם להבה, לסלול ערוץ להחזיק את הדגים, כך שהערוץ מתחיל מקצה הצינורית ומשתרע כ 1-2 פנימה
- זהירות יש לנקוט כדי להבטיח שזווית ירידה רצופה מאזור הצינורית ליציאת הניקוז נוצר."Width =" 065fig2.jpg "/> 400px
איור 2
- זהירות יש לנקוט כדי להבטיח שזווית ירידה רצופה מאזור הצינורית ליציאת הניקוז נוצר."Width =" 065fig2.jpg "/> 400px
- התקנת זלוף
- לפני שיתחיל, לשטוף להגדיר קופצים זלוף עם מים בסביבה, כדי להבטיח שכל בועות האוויר יוסרו.
- הוספת פתרון tricaine ~ 30 מיליליטר של 0.016% (630 מיקרומטר) להתקנת זלוף פתיחת הגולגולת ולאפשר ~ 2 מיליליטר לרוץ דרך צינורות כדי להבטיח tricaine שתימסר לבעלי החיים על ייזום זלוף. ראה שלב 2.2 לדילול.
- להתקנת זלוף העיקרית, להוסיף ~ 50 מיליליטר של מים בסביבה לצינור הראשון. הוסף כל תרכובות ניסיוניות רצויים לכל אחד מהצינורות שנותרו.
- הנח את התקנת הצינורית לתוך החור הקטן של בסיס אינטובציה.
- לסובב 1 ברצועה רחבה של 42 Kimwipe סנטימטר לתוך ספירלה הדוקה ולהכניס אותו לתוך צינור הניקוז כך שKimwipe משתרע על שני קצותיו. רקמה זו תשמש כפתיל כדי להסיר את נוזל perfused וכדי למנוע הצטברות נוזלים בתוך tהוא אינטובציה בסיס, אשר יכול להפריע להקלטת אלקטרו.
- הכנס קצה אחד של הצינור לתוך החור הגדול של צלחת פטרי, המאפשר לקצה התחתון כדי להאריך לתוך צלחת אינרטי כי הוא גדול מספיק כדי לאסוף את כל פסולת זלוף. מנה זו תשמש כמאגר יצוא להתקנה. מקם את הרקמה, כך שקצה אחד ישקר ליד אזור הבטן של החיה והסיומת התחתונה יכולה לטפטף לתוך הצלחת.
- מניחים בסיס אינטובציה הושלם זה ליד מיקרוסקופ לנתח. חבר את מנעול Luer של הצינורית לצינורות טפטוף tricaine.
- מחט נימים ואלקטרודות
- השג אלקטרודה ראשונית בהיקף של 2.5 בשל 0.010 בחוטי כסף ואלקטרודה משנית שאמור להיות מורכב מ15 מאותו החוט כדי להאריק את ההתקנה. לאלקטרודה המשנית, השתמש 15 בסעיף של 0.010 בחוטי כסף עם קצה מולחם, המאפשר לה להתאיםבחלק האחורי של ראש בשלב.
- Electroplate הטיפים של שני חוטי כסף הראשוניים ומשניים עם יוני כלוריד.
- באמצעות חולץ micropipette, למשוך את מחט דקה דופן, ורוסיליקט נימים עם התנגדות של <15 mΩ.
- מלא את מחט הנימים עם 2-3 μl של 2 כלוריד M אשלגן, או מספיק כדי לכסות את הקצה מצופה כלוריד של חוט הכסף באופן חלקי.
- הכנס את האלקטרודה העיקרית לראש הנימים ולהרכיב אותה במחזיק האלקטרודה.
- הר את הראש בשלב לתוך micromanipulator ולאחר מכן לטעון את האלקטרודה המשנית לmicromanipulator שני. עם ההתקנה, המיקום הראשון כל אלקטרודה ולאחר מכן להתאים את הקצה מולחם של האלקטרודה המשנית לחלק האחורי של הראש בשלב.
- השג אלקטרודה ראשונית בהיקף של 2.5 בשל 0.010 בחוטי כסף ואלקטרודה משנית שאמור להיות מורכב מ15 מאותו החוט כדי להאריק את ההתקנה. לאלקטרודה המשנית, השתמש 15 בסעיף של 0.010 בחוטי כסף עם קצה מולחם, המאפשר לה להתאיםבחלק האחורי של ראש בשלב.
2. הכנה של פתרונות, מערכת טפטוף, ואלקטרו ציוד הקלטה
- השג 1 ליטר של מים בסביבהמאקווריום של דגים.
- T 0.016%] methanesulfonate tricaine (tricaine) (50 מיליליטר של 630 מיקרומטר) 24.
- הפשירו aliquot של .0.4% tricaine נאגרה טריס, pH 7.2.
- הוספת 2.1 מיליליטר של .0.4% tricaine נאגרה טריס ל47.9 מיליליטר של מים בסביבה ומערבבים.
- להפשיר ריכוז מניות של תרכובת מסיס במים רצויים ניסיונית (למשל 300 pentylenetetrazol מ"מ, chemoconvulsant משותף).
- להפשיר aliquot של רומיד pancuronium מיקרוגרם / μl 1 בפתרון של רינגר.
- מלא את שני מערכות אינטובציה ניסיוני עם מים בסביבת ההרדמה ולנקז לפחות מספיק כדי להסיר את כל הבועות מצינורות. זה חייב להיעשות כי בועות לחסום זרימת נוזל, מה שמוביל לחנק של בעלי החיים.
- לחלוטין לנקז את צינורות זלוף כי יקיימו תרופות מבלי לאפשר אוויר לתוך הצינור המקשר.
- מלא את צינור ההרדמה עם פתרון tricaine 0.016% (630 מיקרומטר) ולמקם את כל experמתחם imental (ים) בצינור נוסף (ים) על מערכת זלוף ניסיונית.
- הצינור הראשון של זלוף הניסיוני צריך להכיל מים בסביבה בלבד.
- להרטיב את הספוג הנקבובית הקטן עם מים בסביבה ומקום בx 15 מ"מ צלחת פטרי 60 מ"מ ריק. מנה זו תשמש כדי להחזיק את הדגים בזמן ההרדמה מוזרקת.
3. פתיחת גולגולת
- הוסף מספיק מפתרון tricaine 630 מיקרומטר לצלחת פטרי 15 x 60 מ"מ כדי למלא אותו כשלושה רבעי הדרך. לשקול את הצלחת מלאה. זה ישמש כדי לשתק את החיה, כך שתהיה ניתן להזריק הרדמה נוספת intraperitoneally.
- לטבול את בעל החיים לתוך tricaine המנה מכילה ולשקול את הצלחת שוב.
- הפחת את ההבדל בין המשקולות משלבי 1 ו -2 כדי להשיג את המשקל של הדגים.
- לאפשר לבעלי החיים כדי להישאר בפתרון tricaine עד רגוע ורוב התנועה חדלה.
- בעזרת זוג מלקחיים רחבים, להעביר את הדגים לספוג premoistened ומצב אותו מן הצד. העברת הדגים בזנבו עובדת היטב עבור תהליך זה.
- מניחים את הספוג ודגים מתחת למיקרוסקופ לנתח.
- עם מזרק Nanofil המכיל מחט G 34, למדוד את מספיק רומיד pancuronium כזה שיש 1 מיקרוגרם / גרם של משקל דג.
- באמצעות מקל ארטיק בצד הגב של הדג כדי לייצבו, לנהל את רומיד pancuronium intraperitoneally באמצעות מזרק Nanofil.
- שימוש במלקחיים בסדר, לתפוס את הדגים על ידי הלסת התחתונה ובמהירות להעביר את בעלי החיים לבסיס אינטובציה.
- מקם את החיה, כך שהוא הגבי-up בטופס השעווה וכזה שצינורית 1 מ"מ יכולה להיות מוכנסת לתוך הפה. השתמש במלקחיים בסדר לתמרן את הדג ולפתוח את הפה סביב הצינורית. בשל הרכבה של מגש אינטובציה, תחנה תוכננה לתוך הבסיס, המאפשרתצינורית להיות מוכנסת 3 מ"מ לתוך הפה של הדג.
- פעם אחת בעמדה, להפעיל את צינור זלוף הכבידה-fed מכיל tricaine.
- לחתוך 3 סנטימטר 2 סעיף של רקמת Kimqipe ולהרטיב אותו במים בסביבה.
- מניחים את הרקמה על החיה כדי למנוע התייבשות. סעיף Kimwipe יכול גם להיות ממוקם כדי לסייע בהחזקת הגב-up של בעלי החיים.
- תחת המיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש במספריים באביב vanna להסיר ~ 2 מ"מ 2 סעיף של הגולגולת המכסה את tectum האופטי. אזור זה נראה כמו צלחת כהה, גרמית שיושבת מאחורי העין.
איור 3- הכנס להב אחת של המספריים vanna בשולי הצלחת ולדחוף עם מספיק כוח כדי penetrate העצם, ללא פירסינג המוח. סגור את המספריים כדי לגזור את העצם.
- הסר את פיסת העצם.
- אם כל דם קיים, הסר את השימוש בקצה Kimwipe. דימום בדרך כלל מפסיק זמן קצר לאחר ביצוע פתיחת הגולגולת.
4. אלקטרופיזיולוגיה
- כבה את stop-זין אינטובציה ומהר לנתק את מנעול Luer חיבור בסיס אינטובציה לטפטוף tricaine.
- הזז את התקנת אינטובציה השלמה למיקרוסקופ אלקטרופיזיולוגיה ולהתחבר למערכת זלוף.
- הדלק את המים בסביבה ותנקב בשיעור של 1 מיליליטר / דקה במשך ~ 1 שעות, כדי לשטוף את tricaine.
- באמצעות micromanipulator תחת שליטה חזותית, מקם את האלקטרודה המשנית, כך שהקצה האלקטרודה יכול להיות מוכנס לתוך הנחיר של בעלי החיים או לתוך השקע שמאחורי הלסת העליונה.
- הכנס את מחט אלקטרודה הראשונית לתוך הפתח פתיחת הגולגולת. הכנס אתמחט לרקמה, כך שהקצה ממוקם שטחי למדי בתוך tectum האופטי.
- אם האלקטרודה הוא עמוק מדי, האות החשמלי עשוי להיות קטן.
- לאסוף ולנתח את הבדל החשמל נרשם בין האלקטרודות התייחסות ראשוניות ומשנית. תהליך זה יאפשר להקלטות תאיים כדי להתקבל.
- לאסוף את הנתונים במצב ללא פער בקצב דגימה 5 kHz, עם מסנן תמסורת נמוך של 0.1 קילוהרץ ולעבור סינון גבוה של 1 הרץ.
- אל תתחיל להקליט פעילות אלקטרו עד מים בסביבה יש perfused למינימום של 45 דקות.
- הקלט את בסיס פעילות מקומית לפחות 15 דקות לפני התוספת של תרופות ניסיוניות. בגין זלוף עם תרופות ניסיוניות של בחירה ושיא לכמות הרצויה של זמן. בהכנות בריאים, אפשר להקליט את פעילות הנוירולוגית ל2-3 שעות.
5. לנקות את
- להרדים את בעלי החיים על ידי מנת יתר של סמים באמצעות tricaine בהתאם לנהלים המקובלים, כפי שתואר על ידי האגודה האמריקנית לרפואת וטרינרית (AVMA) הנחיות להמתת החסד של בעלי חיים (2013).
- דג הזברה כדי להיות מורדמים צריכה להיות ממוקם בפתרון tricaine ב200-500 מ"ג / ל ' דגים הם להישאר בפתרון למינימום של 10 דקות לאחר הפסקת פעילות opercular קצבית, שלאחריו הם חשופים לאמצעים פיזיים של המתת חסד (חיתוך רוחב צוואר הרחם), כדי להבטיח את המוות.
- הפעל מים די דרך כל הצינורות ולאסוף לרשות מתאימה, אם מסוכן.
- השאר את הברזים לכל צינור במצב הפתוח כדי להקל על ייבוש אוויר.
- משרים את האלקטרודות ב70% אתנול ולאפשר לאוויר יבש.
- יש לנקות את כל חתיכה עם 70% אתנול ולאפשר לאוויר יבש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי למדוד את הפעילות העצבית של דג הזברה מבוגר in vivo. קלטות אלקטרו אלה מתקבלות באופן עקבי וreproducibly. איור 5 מראה דוגמא מייצגת של שינויי ילידים מושרה ושל הפעילות העצבית של דג הזברה מבוגר כאשר pentylenetetrazol (PTZ), chemoconvulsant נפוץ 6,7,25,26, הוא הציג באינטובציה התקנה.
פעילות נוירולוגית יליד דג הזברה המבוגר הייתה פיקוח על כל ניסוי (איור 5 א). זה היה ציין באופן עקבי כי פעילות זו היא ספונטנית וקטנה במשרעת במהלך תקופת ההקלטה. בעקבות כניסתה של 15 מ"מ PTZ למערכת, פריקות כמו epileptiform ספונטניים החלו להתפתח כ -5 דקות. לאחר הקדמה. פעילות זו הייתה בתחילה משרעת קצר, קטנה והתרחשה בתדירות גבוהה, בדומה למה שנצפה בתוך z זחלebrafish 6,7. עם חשיפה המשיכה PTZ, דפוס של פריקות משרעת גדולות פיתחו שהיו במעקב על ידי התפרצויות קטנות יותר, תכופות יותר של פעילות ותקופה שלאחר שקטה (איור 5) עקבי.
טכניקה זו שמשה בהצלחה להציג את chemoconvulsants האחר דרך מערכת אינטובציה. עם תרכובות אלו, שינויים בפעילות עצבית מקומית היו גם עוררו ביעילות. Pentylenetetrazol שימש כאן כיכולתו בשל דוגמא לשנות חסונת הפעילות העצבית יליד דג הזברה באופן סטריאוטיפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי למדוד את הפעילות העצבית של דג הזברה מבוגר in vivo. בעזרת תרגול, פעילות עצבית יכולה להיות שנצפתה באופן עקבי, אם כי המאפיינים (אמפליטודה וצורה של אירועים) של הפעילות שנרשמה יכולים להשתנות בין דגים בודדים. ניצול של טכניקת ההקלטה תאית יכול להסביר תצפית זו. השיטה מספקת ניטור סימולטני של מספר רב של תאים בתוך אזור 1, כך ששינויים במיצוב של האלקטרודה הראשית יכולים לשחק תפקיד בפעילות הנצפית. עומק של האלקטרודה העיקרית גם משנה את האזור הנמדד. אם הקצה של האלקטרודה ממוקם עמוק מדי בתוך אזור, האות שנצפתה תהיה קטנה יותר מהצפוי ושינויים בפעילות יהיו קשים יותר לצפות, אם זה קורה, פשוט למשוך בחזרה את האלקטרודה העיקרית, כך שהקצה יושב יותר שטחי . שים לב שזה אופייני לtectum האופטי ולא להיותen הסתכל לעומק באזורים אחרים של המוח. עם זאת, הליך זה יכול להתבצע בתוך אזור של המוח שונה. אם הפעילות העצבית שנצפתה יורדת לרמות בסיס במהלך הניסוי ולא ברור אם הדגים הוא עדיין בחיים, להסיר את האלקטרודות מהגולגולת ולבדוק אם יש עדיין זרימת דם בכל בעלי החיים. זה ניתן לבדוק על ידי התבוננות בכלי הגדול באזור האף של דג השפתיים או. זרימת דם ניתן לראות בקלות באזורים אלו. אם אלקטרודות יוסרו כדי לבדוק את זרימת דם באמצע הקלטה, כאשר למקם מחדש את האלקטרודות, הם יהיו במיקום מעט שונה ממה שהיו בתחילה, מבטל את היכולת להשוות ישירות חלק זה של ההקלטה לבסיס המקורי .
לפני שיתחילו בהליך זה, יש להבטיח שצינורות אינטובציה, כמו גם את צינורות טפטוף לשניהם פתיחת הגולגולת והגדרות אלקטרופיזיולוגיה הםללא כל בועות. אם בועות אוספים, הם יכולים להיות נגמרים של המערכת על ידי פתיחת השסתום ומאפשר לחלק מהמים בסביבה לרוץ דרך. אם זה לא לחסל את הבעיה, מזרק קטן יכול להיות מחובר לקצה של הצינור, שבו הצינורית תהיה להציב, ויניקת אור מיושמת כדי להסיר כל אוויר שנותר במערכת. לבועות עקשניות, ניתן לכפות מים בסביבה דרך צינורות. כמו כן, לוודא כי צינורות טפטוף דרוכים ונוטף לפני intubating הדגים. אם קצב זרימה של ml 1 ~ / דקות ולא התקבלו, בגובה של ראש הלחץ ניתן לשנות כדי להשיג זאת. זה יבטיח כי יש לו את הדגים גישה לזרימת מים מספקים. כאשר התקנת זלוף אלקטרופיזיולוגיה היא התקנה עם מספר רב של צינורות בסדרה, בו נקבע כי זה לקח בערך ~ 1 דקות לפתרון החדש שהוצג לבעלי החיים, אם כי שינויים וכתוצאה מכך הפעילות העצבית שנרשמה היו תלויים ביין המתחםגרם הציג. מומלץ כי קצב זרימה זה להימדד לפני ביצוע כל ניסויים. העבודות קודמות הראו כי tricaine יכולה להחליש פעילות עצבית, המחייבת אותה להסיר מהמערכת על מנת להשיג הקלטות מדויקות 27,28. דרך העבודה קודמת, נקבע כי תקופה של 45-60 דקות של אינטובציה עם מים בסביבה נדרשה לשטוף את tricaine ולפעילות עצבית להגיע לרמות ילידים. בדומה לכך, כישלון של pentylenetetrazole כן בוצע, ונקבע כי תקופת 20 דקות נדרשה לחזור פעילות עצבית לרמות בסיס. לכן, הנסיינים צריכים לסיים את הניסויים כדי לקבוע זמני כישלון עבור כל מתחם של עניין שהוצגו למערכת.
טכניקה זו דורשת קצת תרגול. בעת ביצוע פתיחת הגולגולת, יש לנקוט בטיפול נוסף כדי להבטיח שאזור קטן של הצלחת הגרמית המכסה את הראש יכול להיות ניקב ולהסיר מבלי לפגועהמוח. ניתן לעשות זאת על ידי החדרת המספריים vanna בזווית חדה ביחס לראש. באזור הגרמי המכסה את tectum אופטי התכה בסמוך למרכז, כי הם חלשים ולשרת נקודות כניסה טובות למספריים. ברגע שהפסקה קטנה נעשתה בתוך הצלחת, להשתמש במספריים לקצץ אזור קטן של העצם, ולהסיר בעזרת זוג מלקחיים בסדר. דגים צעירים לעתים קרובות יש גולגולות רכות יותר, גמישים יותר, ולכן דגים שהם 1 גיל שנה או פחות הם הציעו לשימוש בזמן למידת טכניקה זו. לפעמים, דם יתחיל לאסוף סביב האזור של craniotomy, אבל זה יכול להיות הוסר על ידי מספיג Kimwipe עדינות סביב האזור. עם הליך זה, פתיחת הגולגולת היא קטנה מאוד, להיות על 2 מ"מ 2 באזור. בשל גודלו קטן זה, התייבשות של אזור הגולגולת לא קרתה. עם זאת, אם craniotomy היא גדולה יותר בגודלם, ניתן להחיל אגר או חומר אחר כדי למנוע אובדן לחות מהמוח אם זה להיות מקצועןblem.
נקודת העניין היא השימוש במתיל בpancuronium. כימי זה מאוחסן בaliquots של 10 μl כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות. הנפח הציע לשמש בניסוי, להיות μl 1 לגרם של משקל, בדרך כלל מספיק כדי לשתק את הדגים בוגרים. בהזדמנות, לעומת זאת, נפח זה לא הולם. כאשר זה קורה ושיתוק ולא התקבל יותר ברומיד pancuronium יכול להינתן intraperitoneally לדגים, כל עוד הקלטה לא החלה. בעת ביצוע ההזרקה, לא מנסה להזריק דרך צד הקשקשים הקשה; להזריק את הדגים באזור הבטן הרך, בסמוך לפורקן. אם הדגים מתחילים לנוע פעם אחת האלקטרודה העיקרית כבר מוצבת, יש סיכוי טוב שהמחט כבר נשברה בפתיחת הגולגולת, ואת ההליך יש לחזור על שימוש בבעלי חיים חדשים. דרך עבודה זו, זה כבר נקבע, כי ברומיד pancuronium יכול להפחית עצבי נרשםפעילות בדג זברת זחל (≤ 50% מהמשרעת בסיסית), ויש להניח שהדבר נכון גם עבור מבוגרים. עם זאת, בניסיון האחרון, הפעילות העצבית במבוגר היא חזקה מספיק, כי כל תופעות ריסון המיוחסות לרומיד pancuronium אינן מופיעות כדי להשפיע על היכולת לאסוף ולנתח נתונים לרעה. לעומת זאת, מקעקעים הקשורים בתנועה יכולה להיות משמעותי. להליך זה, את היתרונות של חוסר תנועה של החיה שלמה הוא בעל ערך מעבר למגבלה זו והשינויים העצביים שהם הציגו הם חזקים מספיק כדי להתמיד מעבר לכל השפעות ריסון. כמו כן, כל תנועה מבעלי החיים יכולה לעקור את האלקטרודה, שנרשמה על ידי ציוד הקלטת אלקטרופיזיולוגיה ואולי לסכן את בעלי החיים.
המגבלות של טכניקה זו לשקר בעיקר בעובדה שהקלטה תאית היא הדרך היחידה האפשרית של הקלטת פעילות עצבית בדג הזברה המבוגר ללא פגע. בעת מיקום הפרימה האלקטרודה ר"י, המחט חייבת להיות מוכנסת לתוך פתיחת הגולגולת, מניעה אחד מלראות בדיוק איפה את האלקטרודה שיוצבו. אמנם, עם תרגול, ניתן למקם את האלקטרודה בתוך אותו האזור ובו בעומק באופן עקבי.
באלקטרופיזיולוגיה vivo יש בעיקר מוגבל לזחלי דג הזברה. זאת בשל היכולת לשתק את הדגים הקטנים, והעובדה שהם אינם דורשים אינטובציה בקלות. לכן, מחקרי אלקטרו התמקדו בשלבי הזחל וקטנים שנעשה בנוגע לפעילות אלקטרו במוח הבוגר. זה מנע כל השוואות בין הנוער ופעילות נוירולוגית מבוגרים להתבצע. השימוש במערכת מאפשר לאינטובציה multitube הקדמה קלה של מגוון רחב של תרכובות לדגים. זה גם מאפשר להשפעות של כימיקלים או תרופות כדי להיחקר בתוך שתי מערכות זחל ומבוגרים שונים.
NT "עבור: together.within-לשמור על עמודים =" תמיד ">
איור 1. אינטובציה צינורית. הסרת סעיף 1.5 סנטימטר מהקצה הרחב של קצה P-200 pipetteman צהוב (). הכנס חתיכת 6 סנטימטר x 1 מ"מ של צינורות (חץ) לנעילת Luer הפחתת מחבר (ב ') והכנס את צינורית זה לקצה פיפטה שונה. החזק את קצה פיפטה בעמדה עם נעילת Luer באמצעות חלק קצר של ⅛ בצינור (C).
איור 2. סיים התקנת בסיס אינטובציה. ברגע ששעוות המפרץ מתקרר, הנח את התקנת הצינורית לתוך החור הקטן יותר של intבסיס ubation (א '). לסובב 1 ברצועה רחבה של 42 Kimwipe סנטימטר לתוך ספירלה הדוקה ולהכניס אותו לתוך צינור הניקוז כך שKimwipe משתרע על שני קצותיו. הכנס קצה אחד של צינור הניקוז לתוך החור הגדול של צלחת פטרי (B), המאפשר את הקצה התחתון כדי להאריך למ"מ 30 מ"מ x 100 מתגבש מנה (לא בתצוגה). מקם את הרקמה, כך שקצה אחד ישקר בסמוך לאזור של החיה קיבה (המסומן בקו מקווקו שחור) והסיומת התחתונה יכולה לטפטף לתוך הצלחת.
איור 3. פתיחת גולגולת. תחת המיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש במספריים באביב vanna להסיר ~ 2 מ"מ 2 סעיף של הגולגולת המכסה את tectum האופטי. אזור זה נראה כמו צלחת כהה, טרפז גרמי כי זה שלה מאחורי העין. המעגל המקווקו מתחם בי פתיחת הגולגולת היא מיקומו. ראש החץ מראה שיש את המחט של האלקטרודה העיקרית ממוקמת בתוך החור של פתיחת הגולגולת. האלקטרודה העיקרית מורכבת מ2.5 בסעיף של 0.010 בחוטי כסף שכבר electroplated עם יוני כלוריד ונוסף למחט נימי ורוסיליקט. מחט הנימים מלאה עם 2-3 μl של 2 כלוריד M אשלגן, או מספיק כדי לכסות את הקצה מצופה כלוריד של חוט הכסף באופן חלקי. האלקטרודה המשנית מורכבת מ15 בסעיף של אותו החוט משמש האלקטרודה העיקרית אלא שעצה היא מולחם בקצה אחד, שמאפשרת לו להיות מוכנסים לתוך החלק האחורי של הראש בשלב. קצה החוט משני שהוא להיות ממוקמים נוגעים בדגים חייב להיות גם electroplated עם יוני כלוריד. החץ מראה היכן האלקטרודה המשנית כבר ממוקמת בתוך הנחיר הימני של הדגים הבוגרים.
together.within-page = "תמיד"> 
איור 4. התקנה לאוסף של פעילות אלקטרו. התקנת אינטובציה השלמה מועברת למיקרוסקופ אלקטרופיזיולוגיה והצינורית מחוברת למערכת זלוף (א '). המים המערכת חייבים להיות מופעלים, ומאפשרים זלוף להתחיל באופן מיידי. שימוש micromanipulator, מקם את האלקטרודה משני (ב '), כך שקצה האלקטרודה מוחדר לתוך הנחיר של בעלי החיים או לתוך השקע שמאחורי הלסת העליונה (חץ). הכנס את מחט אלקטרודה העיקרית (C) לתוך הפתח פתיחת הגולגולת. הכנס את המחט כך שהוא נמצא בעמדה שטחית למדי בתוך tectum האופטי. צינור הניקוז הגדול (D) משתרע מצלחת אינטובציה, מתוך שדה הראייה, ואת הקצה השני מתרוקן לתוך tהוא המנה אוסף.
איור 5. קלטות אלקטרו בתוך tectum האופטי. () הוא נצפה באופן עקבי כי פעילות היליד בתוך tectum האופטי של דג הזברה המבוגר היא סטריאוטיפי ספונטנית, מראה משרעת קטנה פעילות (2-10 mV) בכל משך הזמן של ההקלטה. (ב) בעקבות כניסתה של 15 מ"מ PTZ למערכת, פריקות כמו epileptiform ספונטניים החלו להתפתח כ -5 דקות לאחר הקדמה. פעילות זו הייתה בתחילה משרעת קצר, קטנה. עם חשיפה מתמשכת לPTZ, דפוס של משרעת גדולה עולה בקנה אחד (עד 15 mV) פריקות המפותחות שהיו במעקב על ידי התפרצויות קטנות יותר, תכופות יותר של פעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NINDS גרנט R01NS070159 (לTMD, הליגה להגנה יהודית וATS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , Springer. New York. (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P. Fish Physiology: Zebrafish. Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
