Summary
Este artigo descreve como um peixe-zebra adulto podem ser imobilizados, entubado, e usado para experimentos in vivo eletrofisiológicos para permitir gravações e manipulação da atividade neural em um animal intacto.
Abstract
Anteriormente, estudos eletrofisiológicos em peixe-zebra adulto têm sido limitados a fatia preparações ou para preparativos da Copa do olho e gravações electrorentinogram. Este artigo descreve como um peixe-zebra adulto podem ser imobilizados, entubado, e usado para experimentos in vivo eletrofisiológicos, permitindo a gravação da atividade neural. A imobilização do adulto requer um mecanismo para fornecer oxigênio dissolvido para as brânquias em vez de movimento bucal e opercular. Com a nossa técnica, os animais são imobilizados e perfundidos com água habitat para cumprir este requisito. Uma craniotomia é realizada sob tricaina metanossulfonato (MS-222; tricaina) anestesia para fornecer acesso ao cérebro. O eletrodo primário é então posicionado dentro da janela de craniotomia para gravar a atividade cerebral extracelular. Através da utilização de um sistema de perfusão multitubular, uma variedade de compostos farmacológicos podem ser administrados para os peixes adultos e quaisquer alterações na actividade neuronalpode ser observada. A metodologia permite não só para as observações a serem feitas em relação a mudanças na atividade neurológica, mas também permite que sejam feitas comparações entre larva e adulto zebrafish. Isto dá os investigadores a capacidade para identificar as alterações na actividade neurológica devido à introdução de vários compostos em diferentes etapas da vida.
Introduction
Neste artigo, é descrito um protocolo para a obtenção de gravações in vivo de atividade neural no peixe-zebra adulto. Métodos de gravação extracelulares são utilizados, proporcionando as medições de tensão de actividade eléctrica dentro de uma pequena região de tecido neural. Este método de investigação envolve monitorizar um grande número de células de um animal comportando 1. Anteriormente, as gravações fatia foram realizados em adultos e larvas, assim como os preparativos da Copa do olho e gravações eletrorretinograma. Estas experiências foram realizadas em grande parte ao pormenor as respostas fisiológicas de vários sistemas sensoriais 2-5. Até recentemente, as preparações cerebrais intactas foram apenas disponível para a realização de eletrofisiologia com 3,6,7 larva peixe-zebra, onde a respiração e oxigênio difusão pode ocorrer através da pele. Nossa preparação permite que a atividade neurológica nativo de um peixe-zebra adulto a ser medido, enquanto o animal permanece totalmente consciente e ciente of seus arredores.
Zebrafish (Danio rerio) desempenham actualmente um papel fundamental como um modelo para estudos genéticos, toxicológicos, farmacológicos e fisiopatológicos 3. Zebrafish ganharam visibilidade no campo da neurociência porque eles compartilham uma extensa homologia com os mamíferos nos genético, neural e endócrino níveis 8. Ao longo da última década, técnicas de imuno-histoquímica e neuroanatomic padrão foram utilizados para determinar a organização detalhada característica do sistema nervoso zebrafish 9-12 e da distribuição dos diferentes neurotransmissores 3,8,13. Mais recentemente, os pesquisadores mudaram seu foco de estudos funcionais 14,15, muitos dos quais se concentram em processos comportamentais 16-19 e características eletrofisiológicas de sistemas sensoriais 2,13,20. Um pequeno número desses estudos têm se concentrado na atividade elétrica de áreas específicas do adult cérebro zebrafish 21-23, mas não foram realizados utilizando uma abordagem em vivo.
Este protocolo pode ser adaptado para estudos eletrofisiológicos de ambos atividade espontânea e evocada no sistema nervoso do peixe-zebra para descrever os padrões de atividade em regiões específicas do cérebro. A utilização desta técnica permite que sejam feitas comparações entre a actividade neurológica dos jovens larvas e adultos. Além disso, o nosso protocolo permite comparações entre as alterações genéticas ou farmacológicas. Juntamente com outras abordagens, tais como engenharia genética, ou ensaios farmacológicos, este método oferece uma nova possibilidade para a análise funcional de comunicação e plasticidade neuronal no animal adulto intactos, bem como para aplicações potenciais, como o estudo da epilepsia de início tardio ou processos neurodegenerativos.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e seguiu o protocolo n º A2011 09-003, que foi revista, aprovados e supervisionados pela Universidade da Geórgia Animal Care Institucional e Uso Comitê.
1. Configuração do equipamento
- Sistema de perfusão para craniotomia
A imobilização do adulto exige um sistema de intubação para fornecer oxigénio dissolvido ao peixe. Uma variedade de sistemas podem ser utilizados, mas um sistema de gravidade simples, que consiste de uma seringa de 60 ml. Elevar a pressão da cabeça a uma altura que produz consistentemente uma taxa de fluxo de ~ 1 ml / min. Esta seringa pode ser colocado em série com as seringas que são então utilizados para o sistema de perfusão electrofisiológico.- Obter um único de 60 ml de bloqueio Luer tubo de seringa e remover o êmbolo.
- Suspender a seringa aproximadamente 8 in &# 160; acima da base de um anel de pé, com uma braçadeira.
- Conectar um Ida torneira para a extremidade da seringa. Para o lado oposto da torneira, ligar um pedaço de tubo, de 2 mm de diâmetro, o que é tempo suficiente para estender-se à base de intubação.
- Sistema de perfusão por eletrofisiologia
Para as experiências electrofisiológicas, é frequentemente necessário introduzir uma variedade de compostos durante o decurso de uma experiência. Uma variedade de sistemas estão disponíveis, mas um sistema de gravidade, constituída por 60 ml de seringas em série pode ser utilizado. Esta configuração permite a introdução simples, em série de soluções a serem realizadas, abrindo a torneira correspondente.- Obter duas ou mais 60 ml seringas Luer bloqueio e remover os êmbolos de cada um. Uma seringa é necessário para administrar a água do habitat para os peixes quando cada tubo subsequente pode ser utilizado para administrar uma variedade de compostos farmacêuticos para o peixe.
- Ligar cada uma seringa a uma 3 -maneira torneira com uma conexão Luer.
- Use ⅛ de diâmetro externo (OD) de tubo para ligar as seringas em série com um bloqueio Luer macho numa extremidade.
- Fixar o dispositivo de tal modo que a cabeça de pressão é elevada a uma altura de 27 em cima da base, ou uma altura que produz consistentemente uma taxa de fluxo de ~ 1 ml / min.
- Intubação cânula
A cânula de intubação facilita a introdução de fluido para o peixe. Esta configuração oferece flexibilidade e firmeza à melhor posição da cânula dentro da boca do animal.- O uso de qualquer par de tesouras em geral (por exemplo,. Fiskars) ou uma lâmina de barbear, remover uma seção 1,5 cm do grande final de uma ponteira P-200.
- Insira um mm pedaço de tubo de 6 centímetros x 1 em uma válvula redutora com uma tampa fêmea Luer bloqueio e ponteira de silicone, ou seja, um adaptador Tuohy Borst, e inserir esta cânula na ponta da pipeta modificado. Segure a ponta da pipeta na posição com o Luer lock usando uma pequena porção de ⅛ em tubulação de diâmetro.
Figura 1
- Base de intubação
Esta placa é utilizada para segurar o animal imobilizado numa posição estável, na posição vertical e para facilitar a remoção do fluido que entra o animal através de intubação. Se isso não for estabelecida corretamente, pooling pode ocorrer, levando a sinais vibratórios intrusivas na gravação eletrofisiológico.- Obter o prato de base de 100 milímetros x 15 mm de plástico placa de Petri.
- Usando uma ferramenta para soldadura, derreter um buraco de 6 mm de diâmetro e 7,5 mm abaixo do rebordo do aro, para o lado do prato. Usando a mesma ferramenta, derreter um buraco de 10 mm de diâmetro e 11 mm abaixo da borda do prato ~ 74 ° no sentido horário a partir da buraco menor. Este buraco servirá como o buraco de drenagem.
- Insira uma sonda, com 1 cm de diâmetro, para o furo com a extremidade levantada de tal modo que no final, não pode ser bloqueado. Em seguida, insira uma ponta P-200 pipetteman no pequeno orifício, o que servirá como uma cânula manequim.
- Com a placa de Petri ligeiramente elevada no lado do orifício maior, deitar cera derretida de conservas para o prato de modo a que o furo da cânula for apenas coberto. A região irá servir como um batente, que permite a cânula para ser inserida a 3 mm para o interior da boca do peixe. Esta configuração deve ser autorizado a solidificar.
- Utilizando uma ponta aquecida à chama de metal, esculpir um canal para reter o peixe de modo que o canal começa a partir da ponta da cânula e estende-se aproximadamente 1-2 polegadas
- Deve ser tomado cuidado para assegurar que um ângulo descendente contínua da área de uma cânula, à porta de drenagem é formado."Width =" 065fig2.jpg 400px "/>
Figura 2
- Deve ser tomado cuidado para assegurar que um ângulo descendente contínua da área de uma cânula, à porta de drenagem é formado."Width =" 065fig2.jpg 400px "/>
- Instalação de Perfusão
- Antes de começar, lave-os de perfusão set-ups com água habitat, garantindo que todas as bolhas de ar são removidas.
- Adicionar ~ 30 mL de 0,016% (630 ^ M) tricaina solução para a instalação e permitir a craniotomia perfusão ~ 2 ml de correr através de tubos para assegurar que tricaina será entregue ao animal após o início da perfusão. Veja o passo 2.2 para diluição.
- Para a configuração de perfusão principal, adicione ~ 50 ml de água habitat para o primeiro tubo. Adicionar quaisquer compostos experimentais desejados para cada um dos restantes tubos.
- Coloque a configuração cânula no pequeno orifício da base de intubação.
- Torça a 1 em larga faixa de 42 centímetros Kimwipe em uma espiral apertada e inseri-lo no tubo de drenagem de modo que o Kimwipe estende em ambas as extremidades. Este tecido irá servir como uma mecha para remover o líquido de perfusão e para evitar a acumulação de fluido dentro de tele intubação base, o que poderia interferir com a gravação eletrofisiológico.
- Insira uma extremidade do tubo no orifício grande da placa de Petri, permitindo que a extremidade inferior de estender em um prato inerte que é grande o suficiente para coletar todos os resíduos de perfusão. Este prato vai servir como reservatório de saída para a configuração. Colocar o tecido de modo que uma extremidade se encontram perto da região do abdómen dos animais e a extensão inferior pode escorrer para o prato.
- Coloque esta base de intubação terminada perto do microscópio de dissecação. Ligue o fecho Luer da cânula para a tubagem tricaina perfusão.
- Agulha capilar e eletrodos
- Obter um eletrodo primário consistindo de 2,5 em de 0.010 em fio de prata e um eletrodo secundário que deve ser feito de 15 em do mesmo fio para aterrar a configuração. Para o eléctrodo secundário, usar a 15 na secção de 0,010 em fio de prata com uma ponta soldada, que lhe permite encaixarem volta de um palco cabeça.
- Galvaniza as pontas de ambos os fios de prata primárias e secundárias com íons cloreto.
- Utilizando um extrator micropipeta, puxar um, borosilicato capilar agulha de parede fina com uma resistência de <15 mohms.
- Encher a agulha capilar com 2-3 mL de 2 M de cloreto de potássio, ou o suficiente para cobrir parcialmente a ponta revestida de cloreto de o arame de prata.
- Insira o eletrodo primário na cabeça capilar e montá-lo no porta-eletrodo.
- Monte o estágio cabeça em um micromanipulador e depois montar o eletrodo secundário em um segundo micromanipulador. Com a instalação, a primeira posição cada eletrodo e, em seguida, encaixar a ponta soldada do eletrodo secundário na parte de trás do palco cabeça.
- Obter um eletrodo primário consistindo de 2,5 em de 0.010 em fio de prata e um eletrodo secundário que deve ser feito de 15 em do mesmo fio para aterrar a configuração. Para o eléctrodo secundário, usar a 15 na secção de 0,010 em fio de prata com uma ponta soldada, que lhe permite encaixarem volta de um palco cabeça.
2. Preparação de Soluções, Perfusão Sistema e eletrofisiológica Equipamento de gravação
- Obter 1 L de água habitatdo aquário de peixes.
- 0,016% T] metanossulfonato tricaína (tricaina) (50 ml de 630 mM) 24.
- Descongelar uma alíquota de 0,4% tricaina com Tris, pH 7,2.
- Adicionar 2,1 ml de 0,4% tricaina Tris para 47,9 ml de água habitat e misturar.
- Descongele concentração estoque de composto experimental solúvel em água desejada (por exemplo mM pentilenotetrazol 300, um chemoconvulsant comum).
- Descongelar uma aliquota de 1 mg / mL de brometo de pancurónio em solução de Ringer.
- Preencha tanto anestesiante e sistemas de intubação experimentais com água habitat e drenar pelo menos o suficiente para remover todas as bolhas de tubos. Isto deve ser feito porque bolhas de obstruir o fluxo de fluido, levando a asfixia do animal.
- Completamente drenar os tubos de perfusão que irá realizar as drogas, sem permitir que o ar para dentro do tubo de ligação.
- Encha o tubo de anestesia com 0,016% (630 M) solução tricaina e colocar qualquer experimental composto (s) de tubo (s) adicional no sistema de perfusão experimental.
- O primeiro tubo de perfusão experimental deve conter apenas água habitat.
- Umedeça a pequena esponja de poros com água habitat e colocar em um vazio 60 mm x 15 milímetros placa de Petri. Este prato vai ser utilizado para manter o peixe, enquanto que o anestésico é injectado.
3. Craniotomia
- Adicione o suficiente da solução tricaina 630 mM a um 15 x 60 mm placa de Petri para preenchê-lo cerca de três quartos do caminho. Pesa-se o prato cheio. Isto irá ser utilizado para imobilizar o animal de forma que mais anestesia pode ser injectado por via intraperitoneal.
- Mergulhe o animal no prato contendo tricaina e pesar o prato novamente.
- Subtrair a diferença entre os pesos dos passos 1 e 2 para obter o peso do peixe.
- Permitir que o animal permaneça na solução tricaina até calma e mais movimento cessou.
- Usando um par de fórceps gerais, transferir o peixe para a esponja pré-humedecida e posicioná-la lateralmente. Transferir o peixe pela cauda funciona bem para este processo.
- Coloque a esponja e peixe sob o microscópio de dissecação.
- Com uma seringa Nanofil contendo uma agulha G 34, para medir o brometo de pancurónio suficiente de tal forma que existe uma ug / g de peso do peixe.
- Usando um palito de picolé ao lado dorsal do peixe para mantê-lo estável, administrar o brometo de pancurônio intraperitoneal utilizando a seringa Nanofil.
- Usando a pinça fina, pegue o peixe pela mandíbula e rapidamente transferir o animal para a base de intubação.
- Posicionar o animal de modo que é dorsal-se sobre a forma de cera e de tal modo que a cula 1 mm, podem ser inseridos na boca. Use a pinça fina para manobrar o peixe e abra a boca em torno da cânula. Devido à composição da bandeja de intubação, uma paragem foi projetada para dentro da base, permitindo acânula para ser inserida 3 milímetros para dentro da boca do peixe.
- Uma vez em posição, ligue o tubo de perfusão gravidade alimentada contendo tricaina.
- Corte uma secção 3 cm 2 de tecido Kimqipe e molhe-o com água habitat.
- Colocar o tecido sobre o animal para evitar a dessecação. A secção Kimwipe também podem ser posicionadas para ajudar a segurar a animais dorsal-se.
- Sob o microscópio de dissecação, use uma tesoura primavera vanna para remover ~ 2 milímetros 2 seção do crânio que cobre o tecto óptico. Esta área se parece com uma placa escura, ósseo que fica por trás do olho.
Figura 3- Insira uma lâmina da tesoura vanna na borda da placa e empurrar com a força suficiente para penetraçãote ao osso, sem perfurar o cérebro. Feche a tesoura para cortar o osso.
- Remover o pedaço de osso.
- Se houver sangue, retire usando a borda de uma Kimwipe. Sangramento geralmente pára logo após a realização da craniotomia.
4. Eletrofisiologia
- Desligue a intubação stop-pau e rapidamente desconectar o bloqueio Luer conectar a base de intubação para o gotejamento tricaina.
- Mova a configuração intubação intacto ao microscópio eletrofisiologia e conectar-se ao sistema de perfusão.
- Ligue a água habitat e aspergir com um caudal de 1 ml / min durante ~ 1 hora, a fim de lavar o tricaina.
- Utilizando um micromanipulador sob controle visual, posicionar o eléctrodo secundário, de modo que a ponta do eléctrodo pode ser inserido na narina do animal ou para o mergulho por trás da maxila superior.
- Insira a agulha eletrodo principal na abertura craniotomia. Insira oagulha para dentro do tecido, de tal modo que a ponta está posicionada bastante superficial dentro do tecto óptico.
- Se o eletrodo é muito profundo, o sinal elétrico pode ser pequena.
- Coletar e analisar a diferença elétrica registrada entre os eletrodos de referência primários e secundários. Este processo vai permitir a gravação extracelulares ser obtidos.
- Coletar os dados em modo free-Gap em uma taxa de amostragem de 5 kHz, com um filtro passa-baixa de 0,1 kHz e um filtro passa alta de 1 Hz.
- Não começar a gravar a atividade eletrofisiológica até que a água habitat tem perfusão para um mínimo de 45 min.
- Gravar uma linha de base da actividade nativa em, pelo menos, 15 min antes da adição de drogas experimentais. Comece a perfusão com drogas experimentais de escolha e recorde para o período de tempo desejado. Em preparações saudáveis, é possível registrar a atividade neurológica para 2-3 horas.
5. Clean Up
- Eutanásia do animal por overdose de drogas usando tricaina de acordo com as práticas aceitas, conforme descrito pela American Veterinary Medical Association (AVMA) Diretrizes para a eutanásia de animais (2013).
- Peixe-zebra que ser sacrificados deve ser colocado numa solução tricaina a 200-500 mg / L. Os peixes são para ser deixadas na solução durante um mínimo de 10 minutos após a cessação da actividade do opérculo rítmico, após o que são submetidos a um meio físico de eutanásia (transecção do colo do útero) para garantir a morte.
- Correr água DI por todos os tubos e recolher para o descarte adequado, se perigosa.
- Deixar as torneiras para cada tubo na posição aberta a fim de facilitar a secagem ao ar.
- Mergulhe os eletrodos em etanol 70% e deixar secar ao ar.
- Limpe cada peça com álcool 70% e deixar secar ao ar.
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Representative Results
Este protocolo foi utilizado para medir a actividade neuronal do peixe-zebra adulto in vivo. Estes registros eletrofisiológicos são consistentemente e reproduzível obtida. Figura 5 mostra um exemplo representativo de alterações nativas e induzidos da atividade neural de um peixe-zebra adulto quando pentilenotetrazol (PTZ), um chemoconvulsant comum 6,7,25,26, é introduzido no intubação setup.
A actividade neurológica nativa do peixe-zebra adultos foi monitorizada para cada experiência (Figura 5A). Foi consistentemente observado que esta actividade é espontânea e pequena em amplitude durante o tempo da gravação. Na sequência da introdução de PTZ 15 mM para o sistema, descargas epilépticas do tipo espontâneas começou a desenvolver cerca de 5 min. após a introdução. Esta atividade foi inicialmente breve, pequena amplitude e ocorrido com freqüência, similar ao que foi observado no interior z larvalebrafish 6,7. Com a exposição continuada ao PTZ, um padrão consistente de grandes descargas de amplitude desenvolvidos que foram seguidos por explosões menores, mais freqüentes de atividade e um período de silêncio subseqüente (Figura 5B).
Esta técnica tem sido usada com sucesso para introduzir outros chemoconvulsants através do sistema de intubação. Com estes compostos, as mudanças na atividade neurológica nativa também foram efetivamente evocado. Pentilenotetrazol foi usado aqui como exemplo devido a capacidade de alterar de forma robusta a atividade neural nativa do peixe-zebra de uma maneira estereotipada.
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Discussion
Este protocolo foi utilizado para medir a actividade neuronal do peixe-zebra adulto in vivo. Com a prática, a atividade neural pode ser observado de forma consistente, embora as características (amplitude e forma de eventos) da atividade registrada pode variar entre indivíduos. Utilização da técnica de gravação extracelular pode explicar esta observação. O método proporciona a monitorização simultânea de um grande número de células dentro de uma região de 1, assim variações no posicionamento do eléctrodo primário pode desempenhar um papel na actividade observada. Profundidade do eletrodo primário também muda a região que está sendo medida. Se a ponta do eletrodo é posicionado muito profundo dentro de uma região, o sinal observado será menor do que o esperado e alterações na atividade será mais difícil de observar, se isso ocorrer, basta puxar para trás o eletrodo primário para que a ponta está sentado mais superficialmente . Tome nota de que essa é uma característica do tecto óptico e não seren analisado em profundidade em outras regiões do cérebro. No entanto, este procedimento pode ser realizado dentro de uma região diferente do cérebro. Se a atividade neural observada diminui aos níveis basais durante o experimento e é incerto se o peixe ainda está vivo, retire os eletrodos do crânio e verificar para ver se há ainda fluxo de sangue por todo o animal. Isto pode ser verificado por observação dos grandes vasos no lábio ou área nasal do peixe. O fluxo de sangue pode ser facilmente visto nestas regiões. Se os eléctrodos são removidas para verificar se o fluxo de sangue no meio de gravação, quando o reposicionamento dos eléctrodos, que estará numa localização ligeiramente diferente do que eram inicialmente, negando a possibilidade de comparar directamente esta parte da gravação para a linha de base original .
Antes de iniciar este procedimento, deve-se assegurar que os tubos de intubação, bem como os tubos de perfusão, tanto para a craniotomia e as configurações são eletrofisiologialivre de quaisquer bolhas. Se as bolhas não coletar, eles podem ser executados fora do sistema, abrindo a torneira e permitindo que parte da água habitat para percorrer. Se isto não elimina o problema, uma pequena seringa pode ser ligado à extremidade do tubo, onde a cânula será colocado, e de aspiração de luz aplicada para remover qualquer ar remanescente no interior do sistema. Para bolhas teimosos, água habitat pode ser forçado através do tubo. Além disso, certifique-se de que os tubos de perfusão estão preparados e pingando antes de entubar o peixe. Se uma taxa de fluxo de ~ 1 ml / min, não se obtém, a altura da cabeça de pressão podem ser alteradas a fim de alcançar este objectivo. Isto irá assegurar que o peixe tenha acesso ao fluxo de água suficiente. Quando a configuração de eletrofisiologia perfusão está configurado com vários tubos em série, foi determinado que demorou cerca de ~ 1 min para a nova solução a ser introduzido no animal, embora as mudanças resultantes na atividade neurológica registrada eram dependentes do bein compostog introduzido. Recomenda-se que esta taxa de fluxo ser medido antes da realização de qualquer experimento. Trabalhos anteriores mostraram que tricaina pode atenuar a actividade neural, que deva ser removido do sistema, a fim de obter gravações precisas 27,28. Através de um trabalho anterior, determinou-se que um período de 45-60 min de intubação com água habitat é necessário para lavar o tricaina e para a atividade neural para atingir níveis nativas. Da mesma forma, lavagem de pentilenotetrazol foi também realizada, e determinou-se que um período de 20 min foi obrigado a retornar a actividade neural para os níveis da linha de base. Portanto, os experimentadores deve concluir os ensaios para determinar os tempos de washout para cada composto de interesse a ser introduzido no sistema.
Esta técnica requer um pouco de prática. Ao efectuar a craniotomia, deve ser tomado um cuidado especial para garantir que uma pequena região da placa óssea que cobre a cabeça pode ser perfurada e removido sem danificaro cérebro. Isto pode ser feito através da introdução de uma tesoura vanna num ângulo agudo em relação à cabeça. A área óssea que cobre o tecto óptico tem fusões, perto do centro que são fracos e servem como bons pontos de entrada para a tesoura. Uma vez que uma pequena pausa foi feita dentro da placa, use uma tesoura para cortar uma pequena área do osso, e remover usando um par de pinças finas. Peixes mais jovens muitas vezes têm mais suaves, crânios mais flexíveis, de modo que os peixes que são de 1 ano de idade ou menos são sugeridas para o uso ao mesmo tempo aprender esta técnica. Ocasionalmente, o sangue começa a recolher em torno da região da craniotomia, mas este pode ser removido por um Kimwipe esfregando suavemente em torno da área. Com este procedimento, a craniotomia é muito pequena, sendo cerca de 2 mm 2 na área. Devido a este pequeno tamanho, a secagem da região craniana não ocorreu. No entanto, se a craniotomia é maior em tamanho, é possível aplicar de agar ou outro material para evitar a perda de humidade a partir do cérebro, se isso se tornar um próblema.
Um ponto de interesse é a utilização do brometo de pancurónio. Esta química é armazenado em alíquotas de 10 ul, a fim de evitar ciclos repetitivos de congelamento e descongelamento. O volume sugerido para ser utilizado em uma experiência, sendo 1 ml por grama de peso, é geralmente suficiente para imobilizar um peixe adulto. Na ocasião, no entanto, este volume não é adequado. Quando isto ocorre e paralisia não é obtido, mais brometo de pancurónio pode ser administrado por via intraperitoneal para o peixe, enquanto a gravação não começou. Ao realizar a injeção, não tente injetar através das escalas laterais difíceis; injetar o peixe na mais suave região do abdômen, perto da saída. Se o peixe começa a se mover uma vez que o eletrodo primário foi posicionado, há uma boa chance de que a agulha foi quebrado dentro da craniotomia, eo procedimento deve ser repetido utilizando um novo animal. Através deste trabalho, foi determinado que o brometo de pancurónio pode reduzir o neural gravadaactividade em peixes-zebra de larvas (≤ 50% de amplitude de linha de base) e supõe-se que o mesmo é válido para os adultos. No entanto, na experiência recente, a atividade neural em um adulto é robusto o suficiente para que quaisquer efeitos nocivos atribuídos ao brometo de pancurônio não parecem afetar negativamente a capacidade de recolher e analisar dados. Em contraste, confunde associados com o movimento pode ser significativa. Para este procedimento, os benefícios da imobilidade completa do animal é de valor para além desta limitação e as mudanças neurais que são introduzidas são robustos o suficiente para persistir para além de quaisquer efeitos nocivos. Além disso, qualquer movimento do animal pode deslocar o eletrodo, ser registrados pelo aparelho de controlo de eletrofisiologia e, possivelmente, colocar em risco o animal.
As limitações desta técnica residem principalmente no fato de que a gravação extracelular é a única forma possível de registrar a atividade neurológica dentro do peixe-zebra adulto intacto. Ao posicionar a prima ry eléctrodo, a agulha tem de ser inserido no craniotomia, impedindo uma vejam exactamente onde o eléctrodo está a ser colocado. Embora, com a prática, é possível posicionar o eléctrodo dentro da mesma região e na mesma profundidade de forma consistente.
In vivo eletrofisiologia tem sido amplamente limitado a larvas de peixe-zebra. Isto é devido à capacidade de imobilizar facilmente os peixes pequenos e o facto de que eles não necessitam de intubação. Por isso, os estudos electrofisiológicos focaram as fases larvares e pouco se tem feito relativamente à actividade electrofisiológica dentro do cérebro adulto. Isto impediu quaisquer comparações entre jovens e adultos atividade neurológica a serem feitas. O uso do sistema de intubação multitubular permite a fácil introdução de uma variedade de compostos para o peixe. Isto também permite que os efeitos de diferentes produtos químicos ou drogas a serem estudadas dentro de ambos os sistemas de larvas e de adultos.
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Figura 1. Intubação cânula. Remover uma secção 1.5 cm da grande final de um amarelo P-200 pipetteman ponta (A). Insira um pedaço mm 6 centímetros x 1 da tubulação (seta) em um bloqueio Luer reduzindo conector (B) e inserir esta cânula na ponta da pipeta modificado. Segurar a ponta da pipeta na posição com o bloqueio Luer usando uma curta porção de ⅛ na tubagem (C).
Figura 2. Terminado a configuração base de intubação. Uma vez que a cera do Golfo tenha arrefecido, coloque a configuração cânula no orifício menor do intbase de ubation (A). Torça a 1 em larga faixa de 42 centímetros Kimwipe em uma espiral apertada e inseri-lo no tubo de drenagem de modo que o Kimwipe estende em ambas as extremidades. Insira uma extremidade do tubo de drenagem para o grande furo da placa de Petri (B), permitindo que a extremidade inferior se estender para uma 30 milímetros x 100 mm cristalizando prato (não tendo em conta). Posicione o tecido de modo que uma extremidade vou mentir perto da área do estômago do animal (delineada com linha preta pontilhada) ea extensão inferior pode escorrer para o prato.
Figura 3. Craniotomia. Sob o microscópio de dissecação, use uma tesoura primavera vanna para remover ~ 2 milímetros 2 seção do crânio que cobre o tecto óptico. Esta área se parece com uma placa óssea escuro, trapezoidal que sseu atrás do olho. O círculo pontilhado demarca onde a craniotomia está posicionado. A seta mostra que a agulha do eletrodo primário é posicionado dentro do buraco da craniotomia. O eléctrodo é constituído por um primário de 2,5 no ponto de 0,010 em fio de prata que foi galvanizada com iões de cloreto e inserido numa agulha de borosilicato capilar. A agulha capilar é cheio com 2-3 mL de 2 M de cloreto de potássio, ou o suficiente para cobrir parcialmente a ponta revestida de cloreto de o arame de prata. O eléctrodo secundário composto por um 15 na secção do mesmo fio utilizado para o eléctrodo principal excepto que uma ponta é soldada numa extremidade, que lhe permite ser inserido na parte de trás da cabeça do palco. A extremidade do fio secundário que está a ser posicionado em contato com o peixe também deve ser galvanizados com iões de cloreto. A seta indica onde o eletrodo secundário foi posicionado dentro da narina direita do peixe adulto.
Figura 4. Instalação para recolha de actividade electrofisiológica. A configuração intubação intacta é transferida para o microscópio electrofisiologia e a cânula é ligado ao sistema de perfusão (A). A água do sistema deve ser ligado, permitindo a perfusão para começar imediatamente. Usando o micromanipulador, posicionar o eléctrodo secundário (B), de modo que a ponta do eléctrodo é inserido na narina do animal ou para o mergulho atrás do maxilar superior (seta). Insira a agulha eletrodo primário (C) na abertura craniotomia. Insira a agulha de forma que ele está posicionado bastante superficial dentro do tecto óptico. A grande tubo de drenagem (D) se estende desde o prato entubação, para fora do campo de visão, e a outra extremidade desemboca no tele coleção prato.
Figura 5. Registos electrofisiolicos dentro do tecto óptico. (A) foi consistentemente observado que a actividade nativa dentro do tecto óptico do peixe-zebra adultos é estereotipada espontânea, mostrando pequena amplitude (2-10 mV) a actividade ao longo da duração da gravação. (B) Na sequência da introdução de PTZ 15 mM para o sistema, descargas epilépticas espontâneas-como começou a desenvolver cerca de 5 minutos após a introdução. Esta atividade foi inicialmente breve, pequena amplitude. Com a exposição continuada ao PTZ, um padrão consistente de grande amplitude (até 15 mV) descargas desenvolvidos que foram seguidos por explosões menores, mais freqüentes de atividade.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH / NINDS Grant R01NS070159 (a DTM, JDL e ATS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
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