Summary
Dieses Papier beschreibt, wie ein erwachsenen Zebrafisch immobilisiert werden können, intubiert und für in vivo elektrophysiologischen Experimenten verwendet, um Aufnahmen und Manipulation der neuronalen Aktivität in einem intakten Tier zu ermöglichen.
Abstract
Zuvor elektrophysiologische Studien bei erwachsenen Zebrafisch sind begrenzt worden, um die Vorbereitungen oder Augenmuschel Präparate und electrorentinogram Aufnahmen zu schneiden. Dieses Papier beschreibt, wie ein erwachsenen Zebrafisch immobilisiert werden können, intubiert und für in vivo elektrophysiologischen Experimenten verwendet, so dass die Aufnahme der neuronalen Aktivität. Immobilisierung des Erwachsenen erfordert einen Mechanismus, um gelösten Sauerstoff zu den Kiemen statt der Mund-und Kiemendeckel Bewegung zu liefern. Mit unserer Technik werden die Tiere immobilisiert und mit Lebensraum Wasser durchströmt, um diese Anforderung zu erfüllen. Ein Kraniotomie unter Tricainmethansulfonat geführt (MS-222; Tricaine) Anästhesie Zugang zum Gehirn zu liefern. Die Primärelektrode wird dann innerhalb der Kraniotomie Fenster positioniert ist, um extrazelluläre Aktivität des Gehirns erfassen. Durch die Verwendung eines Viel Perfusionssystem kann eine Vielzahl von pharmakologischen Verbindungen, die dem erwachsenen Fisch und jede Änderung in der neuralen Aktivität, verabreicht werdenbeobachtet werden. Die Methodik ermöglicht nicht nur Erklärungen zu den Veränderungen der neurologischen Aktivität gemacht werden, aber es ermöglicht auch Vergleiche zwischen Larven-und erwachsenen Zebrafisch hergestellt werden. Dies gibt Forscher die Möglichkeit, die Veränderungen in der neurologischen Aktivität aufgrund der Einführung der verschiedenen Verbindungen in verschiedenen Lebensstadien zu identifizieren.
Introduction
In diesem Artikel wird ein Protokoll für den Erhalt von In-vivo-Aufnahmen von neuronalen Aktivität bei erwachsenen Zebrafischen beschrieben. Extrazelluläre Aufzeichnungsverfahren verwendet werden, wodurch Spannungsmessungen der elektrischen Aktivität in einem kleinen Bereich des Nervengewebes. Diese Untersuchungsmethode beinhaltet die Überwachung einer großen Anzahl von Zellen in einem Tier 1 verhalten. Bisher haben die Scheibe Aufnahmen bei Erwachsenen und Larven durchgeführt wurde, wie Augenmuschel Präparate und Elektroretinogramm Aufnahmen haben. Diese Versuche sind weitgehend zum Detail durchgeführt wurde physiologischen Reaktionen der verschiedenen Sinnessysteme 5.2. Bis vor kurzem haben intakten Zubereitungen erst seit Durchführung der Elektrophysiologie mit Zebrafisch-Larve 3,6,7, wobei Atmung und die Sauerstoffdiffusion durch die Haut auftreten verfügbar. Unsere Vorbereitung ermöglicht die native neurologische Aktivität eines erwachsenen Zebrafisch zu messen, während das Tier noch bei vollem Bewusstsein und bewusst of seine Umgebung.
Zebrafisch (Danio rerio) spielen derzeit eine grundlegende Rolle als Modell für genetische, toxikologische, pharmakologische und pathophysiologische Studien 3. Zebrafische haben die Sichtbarkeit auf dem Gebiet der Neurowissenschaften gewonnen, weil sie Aktien weitgehende Homologie Säugetieren an den genetischen, neuronalen und endokrinen Ebenen 8. In den vergangenen zehn Jahren haben sich Standard-neuroanatomische und immunhistochemischen Techniken verwendet, um die detaillierten Kenn Organisation des Zebrafisch-Nervensystem 9-12 und der Verteilung der unterschiedlichen Neurotransmitter 3,8,13 bestimmen. In jüngster Zeit haben Forscher ihren Fokus auf Funktionsstudien 14,15, von denen viele zentrieren Verhaltensprozesse 16-19 und elektrophysiologische Eigenschaften von sensorischen Systemen 2,13,20 verschoben. Eine kleine Anzahl dieser Studien haben sich auf die elektrische Aktivität des speziellen Bereichen des adul engtt Zebrafischgehirn 21-23, wurden aber nicht mit einem in-vivo-Ansatz durchgeführt.
Dieses Protokoll kann für elektrophysiologische Studien sowohl spontane und evozierte Aktivität innerhalb des Zebrafisch-Nervensystem, um die Muster der Aktivität in bestimmten Hirnregionen beschreiben angepasst werden. Die Anwendung dieser Technik ermöglicht Vergleiche zwischen der neurologischen Aktivität junge Larvenstadien und Erwachsenen erfolgen. Außerdem ermöglicht unser Protokoll Vergleiche zwischen genetischen oder pharmakologische Veränderungen. Zusammen mit anderen Ansätzen, wie der Gentechnik oder pharmakologischen Tests bietet dieses Verfahren eine neue Möglichkeit für die funktionelle Analyse von neuronalen Kommunikation und Plastizität im intakten adulten Tier als auch für potentielle Anwendungen, wie z. B. das Studium späten Beginn Epilepsie oder neurodegenerativen Prozessen.
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Protocol
Alle Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und folgte Protokoll # A2011 09-003, die überprüft wurde, genehmigt und von der Universität von Georgia Institutional Animal Care und Verwenden überwacht Ausschusses.
1. Geräte-Setup
- Perfusion System zur Kraniotomie
Immobilisierung des Erwachsenen erfordert eine Intubation System gelösten Sauerstoff, um die Fische zu liefern. Eine Vielzahl von Systemen verwendet werden können, aber eine einfache Schwerkraftsystem, bestehend aus einer 60 ml Spritze verwendet. Erhöhen Sie die Druckhöhe bis zu einer Höhe, die konsequent eine Durchflussrate von ca. 1 ml / min liefert. Diese Spritze kann in Reihe mit den Spritzen, die dann für die elektro Perfusionssystem verwendet, angeordnet werden.- Besorgen Sie sich eine einzelne 60 ml Luer-Lock-Spritze Rohr entfernen und den Kolben.
- Hängen Sie die Spritze in ca. 8 &# 160; oberhalb der Basis einer Ringständer mit einer Schelle.
- Verbinden eines Ein-Wege-Hahn an das Ende der Spritze. Zum gegenüberliegenden Ende des Absperrventils, schließen ein Stück Schlauch, 2 mm im Durchmesser, die lang genug ist, um zu der Basis erstrecken Intubation ist.
- Perfusion System für die Elektrophysiologie
Für elektrophysiologischen Experimenten ist es oft notwendig, eine Vielzahl von Verbindungen im Verlauf eines Experiments vor. Eine Vielzahl von Systemen zur Verfügung, aber ein Schwerkraftsystem, bestehend aus 60 ml Spritzen in Reihe verwendet werden. Dieser Aufbau ermöglicht eine einfache, Serien Einführung von Lösungen, um durch Öffnen des entsprechenden Hahn durchgeführt werden.- Erhalten zwei oder mehr 60 ml Luer-Lock-Spritzen und entfernen Sie die Kolben von jedem. Eine Spritze erforderlich ist, um Lebensraum Wasser, um die Fische zu verabreichen, während jede nachfolgende Rohr kann eine Vielzahl von pharmakologischen Verbindungen, die dem Fisch zu verabreichen.
- Schließen Sie jede Spritze zu einer 3 -Wege-Hahn mit einem Luer-Anschluss.
- Verwenden ⅛ Außendurchmesser (OD) Schlauch, um die Spritzen in Reihe mit einem männlichen Luer-Lock an einem Ende zu verbinden.
- Die Fixierung des Gerätes, so daß die Druckhöhe auf eine Höhe von 27 oberhalb der Basis oder einer Höhe, die durchweg eine Strömungsrate von ca. 1 ml / min ergibt erhöht.
- Intubationskanüle
Die Intubationskanüle erleichtert die Einführung von Fluid zu dem Fisch. Dieses Setup bietet sowohl Flexibilität und Festigkeit auf beste Position die Kanüle in das Maul des Tieres.- Die Verwendung eines allgemeinen Schere (zB. Fiskars) oder eine Rasierklinge, entfernen Sie einen 1,5 cm Ausschnitt aus dem breiten Ende eines P-200 Pipettenspitze.
- Legen Sie eine 6 cm x 1 mm Schlauchstück in ein Regelventil mit einem weiblichen Luer-Lock-Deckel und Silikonhülse, dh eine Tuohy Borst Adapter, und legen Sie diese Kanüle in die modifizierte Pipettenspitze. Halten Sie die Pipettenspitze in Position mit dem Luer lock mit einem kurzen Abschnitt in ⅛ Rohrdurchmesser.
Figur 1
- Intubation Basis
Diese Schale wird verwendet, um den immobilisierten Tier in einer stabilen, aufrechten Position zu halten und die Entfernung der Eingabe des Tieres durch Intubation Flüssigkeit zu erleichtern. Wenn dies nicht korrekt eingerichtet ist, kann Pooling auftreten, was zu aufdringlich Schwingungssignale in der elektrophysiologischen Aufzeichnung.- Erhalten Sie die Basis Gericht aus einer 100 mm x 15 mm Petrischale aus Kunststoff.
- Verwendung eines Werkzeuges, Schmelz ein Loch mit 6 mm Durchmesser und 7,5 mm unterhalb der Lippe der Felge, an der Seite der Schale. Mit dem gleichen Werkzeug, schmelzen Sie ein Loch, 10 mm Durchmesser und 11 mm unter dem Rand der Schale ~ 74 ° gegen den Uhrzeigersinn von der kleinere Loch. Dieses Loch wird als Drainageloch zu dienen.
- Ein Rohr, 1 cm im Durchmesser, in die Bohrung mit dem Ende angehoben, so dass das Ende nicht blockiert werden. Dann legen Sie eine P-200 pipetteman Spitze in das kleine Loch, das wird als Dummy-Kanüle dienen.
- Mit der Petrischale auf der Seite des größeren Loch leicht erhöht, gießen geschmolzene Konserven Wachs in die Schale, so dass die Kanüle Loch gerade bedeckt ist. Der Bereich wird als ein Anschlag dienen, um die Kanüle bis 3 mm in das Maul des Fisches eingeführt werden. Dieses Set up sollte erstarren werden.
- Mit einem flamm erhitzt Metallkante, schnitzen einen Kanal, um die Fische zu halten, so dass der Kanal beginnt von der Spitze der Kanüle und erstreckt sich etwa 1-2 in.
- Sorgfalt muß darauf geachtet werden, dass eine kontinuierliche nach unten gerichteten Winkel von dem Kanülenfläche der Drainageöffnung gebildet ist.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
Figur 2
- Sorgfalt muß darauf geachtet werden, dass eine kontinuierliche nach unten gerichteten Winkel von dem Kanülenfläche der Drainageöffnung gebildet ist.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
- Perfusion Setup
- Bevor Sie beginnen, spülen Sie die Perfusion Set-ups mit Lebensraum Wasser, sicherzustellen, dass alle Luftblasen entfernt werden.
- In ~ 30 ml von 0,016% (630 uM) Tricaine Lösung des Schädelblutung vornehmen und ~ 2 ml durch Schläuche laufen, um sicherzustellen, dass Tricaine wird dem Tier auf Perfusion Einleitung geliefert werden. Siehe Schritt 2.2 zur Verdünnung.
- Zur Haupt Perfusion Setups fügen ~ 50 ml des Lebensraums Wasser in die erste Röhre. Füge alle gewünschten experimentellen Verbindungen zu jedem der restlichen Rohre.
- Legen Sie die Setup-Kanüle in das kleine Loch der Intubation Basis.
- Drehen Sie eine 1 in breiten Streifen von 42 cm Kimwipe in einer engen Spirale und legen Sie sie in das Drainagerohr, so dass die Kimwipe erstreckt sich an beiden Enden. Dieses Gewebe wird als Docht dienen dazu, die Flüssigkeit durchströmt zu entfernen und Flüssigkeitsansammlungen innerhalb von t verhinderner Intubation Basis, die mit elektrophysiologischen Aufzeichnung stören könnten.
- Stecken Sie ein Ende des Schlauches in das große Loch der Petrischale, so dass das untere Ende in einem inerten Gericht, das groß genug ist, um alle Perfusion Abfälle sammeln verlängern. Dieses Gericht wird als Abfluss Vorratsbehälter für das Setup zu dienen. Positionieren Sie das Gewebe, so dass ein Ende wird in der Nähe von Bauchbereich des Tieres liegen und die untere Erweiterung kann in die Schüssel tropft.
- Legen Sie diese abgeschlossen Intubation Basis in der Nähe des Binokular. Schließen Sie das Luer-Lock der Kanüle in die Tricaine Infusionsschlauch.
- Kapillar-Nadel und Elektroden
- Besorgen Sie sich eine Primärelektrode bestehend aus 2,5 in von 0,010 in Silberdraht und einer Sekundärelektrode, die sich aus 15 in der gleichen Draht sollte, um das Setup geschliffen werden. Für die Sekundärelektrode, verwenden Sie eine 15 im Schnitt 0,010 in Silberdraht mit einem aufgelöteten Spitze, die es ermöglicht zu passenim Hinterkopf-Bühne.
- Galvanisieren die Spitzen sowohl der Primär-und Sekundärsilberdrähten mit Chloridionen.
- Mit einer Mikropipette Puller, ziehen eine dünnwandige, Borosilikatglas Kapillarnadel mit einem Widerstand von <15 mOhm.
- Füllen Sie den Kapillarnadel mit 2-3 ul 2 M Kaliumchlorid, oder genug, um teilweise decken die Chlorid-beschichtete Spitze des Silberdraht.
- Legen Sie die Primärelektrode in die Kapillare Kopf und bringen Sie es in den Elektrodenhalter.
- Montieren Sie die Kopf-Bühne in einen Mikromanipulator und montieren dann die Sekundärelektrode in einen zweiten Mikromanipulator. Mit dem Setup, erste Position jeder Elektrode und passen dann die gelötet Spitze der Sekundärelektrode in die Rückseite der Kopf Bühne.
- Besorgen Sie sich eine Primärelektrode bestehend aus 2,5 in von 0,010 in Silberdraht und einer Sekundärelektrode, die sich aus 15 in der gleichen Draht sollte, um das Setup geschliffen werden. Für die Sekundärelektrode, verwenden Sie eine 15 im Schnitt 0,010 in Silberdraht mit einem aufgelöteten Spitze, die es ermöglicht zu passenim Hinterkopf-Bühne.
2. Herstellung von Lösungen, Perfusion-System und Elektrophysiologische Aufnahmegerät
- Erhalten 1 L Lebensraum Wasservon Aquarium Fische.
- 0,016% T] Tricainmethansulfonat (Tricaine) (50 ml 630 uM) 24.
- Tauwetter ein Aliquot von 0,4% Tris-gepufferte Tricaine, pH 7,2.
- In 2,1 ml 0,4% Tris-gepufferte Tricaine auf 47,9 ml des Lebensraums Wasser und mischen.
- Auftauen Lager Konzentration der gewünschten wasserlöslichen experimentelle Verbindung (zB 300 mM Pentylentetrazol eine gemeinsame chemoconvulsant).
- Tauen Sie eine aliquote Menge von 1 ug / ul Pancuroniumbromid in Ringer-Lösung.
- Füllen Sie sowohl betäubende und experimentellen Intubation Systeme mit Lebensraum Wasser und Abfluss zumindest genug, um alle Luftblasen aus den Rohren zu entfernen. Dies muß getan werden, weil Luftblasen behindern Fluidstrom, was zum Ersticken des Tieres.
- Vollständig entleeren Sie die Rohre, die Durchblutung Medikamente ohne dass Luft in den Verbindungsschlauch halten wird.
- Füllen Sie die betäubende Rohr mit 0,016% (630 uM) Tricaine-Lösung und stellen Sie keine expermentelle Verbindung (en) in zusätzliche Röhre (n) auf experimentellen Perfusionssystem.
- Das erste Rohr von Versuchsdurchblutung sollte nur Lebensraum Wasser enthalten.
- Befeuchten Sie die kleinen Porenschwamm mit Wasser und Lebensraum in einem leeren 60 mm x 15 mm Petrischale. Dieser Teller verwendet werden, um die Fische zu halten, während das Anästhetikum injiziert.
3. Craniotomy
- Genug von der 630 uM Lösung Tricaine In den 15 x 60 mm Petrischale, um es etwa drei Viertel des Weges zu füllen. Wiegen Sie den gefüllten Teller. Diese werden verwendet, um das Tier zu immobilisieren, so daß weitere Narkose intraperitoneal injiziert werden.
- Tauchen Sie das Tier in der Schale mit Tricaine und wiegen das Gericht wieder.
- Subtrahieren der Differenz zwischen den Gewichten der Schritte 1 und 2, um das Gewicht des Fisches zu erhalten.
- Lassen Sie das Tier in der Tricaine Lösung, bis Ruhe und die meisten Bewegung aufgehört hat, zu bleiben.
- Mit einem Paar von breiten Pinzette, übertragen Sie die Fische auf die vorbefeuchtetes Schwamm und positionieren Sie es seitlich. Übertragen Sie den Fisch am Schwanz funktioniert gut für diesen Prozess.
- Legen Sie den Schwamm und Fisch unter dem Binokular.
- Mit einer Spritze, die Nanofil eine 34-G-Nadel, messen Sie genug Pancuroniumbromid, so dass es 1 ug / g Fischgewicht.
- Mit einem Eis am Stiel-Stick an der dorsalen Seite der Fische, um sie ruhig zu halten, die Verwaltung der Pancuroniumbromid intraperitoneal mit der Nanofil Spritze.
- Mit den feinen Pinzette, schnappen die Fische durch den Unterkiefer und schnell zu übertragen, das Tier an die Intubation Basis.
- Die Position des Tieres, so daß es Rücken-up auf der Wachsform und dass der 1 mm-Kanüle in den Mund eingeführt werden. Mit den feinen Pinzette, um die Fische zu manövrieren und öffnen Sie den Mund um die Kanüle. Aufgrund der Zusammensetzung der Schale Intubation wurde ein Anschlag in den Sockel konstruiert, so dass dieKanüle bis 3 mm in das Maul des Fisches eingeführt werden.
- Einmal in Position, schalten Sie die Schwerkraft gespeiste Perfusionsschlauch Tricaine enthält.
- Schneiden Sie ein 3 cm 2 Abschnitt Kimqipe Gewebe und nass ist es mit Lebensraum Wasser.
- Legen Sie das Gewebe über das Tier, um ein Austrocknen zu verhindern. Die Kimwipe Abschnitt kann auch angeordnet werden, um das Halten des Tieres Rücken-up helfen.
- Unter dem Dissektionsmikroskop verwenden vanna Frühjahr Schere auf ~ 2 mm 2 Abschnitt des Schädels für den Tectum opticum entfernen. Dieser Bereich sieht aus wie ein dunkles, Knochenplatte, die hinter dem Auge sitzt.
Fig. 3- Legen Sie ein Blatt der vanna Schere am Rand der Platte und schieben mit genug Kraft, um Eindringente die Knochen, ohne Durchstechen des Gehirns. Schließen Sie die Schere, um die Knochen schnippeln.
- Entfernen Sie das Knochenstück.
- Falls Blut vorhanden ist, entfernen Sie mit dem Rand eines Kimwipe. Blutungen in der Regel stoppt kurz nach Durchführung der Kraniotomie.
4. Elektrophysiologie
- Schalten Sie die Intubation Hahn und schnell trennen Sie das Luer-Lock-Anschluss der Basis bis zur Intubation Tricaine Tropf.
- Bewegen Sie die intakte Intubation Setup auf die Elektrophysiologie Mikroskop und eine Verbindung zu dem Perfusionssystem.
- Schalten Sie den Lebensraum Wasser und durchströmen mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min für ca. 1 Stunde, um zum Auswaschen der Tricaine.
- Mit einem Mikromanipulator unter Sichtkontrolle, positionieren Sie den Sekundärelektrode, so dass die Elektrodenspitze kann in das Tier Nasenloch oder in das Tauch hinter dem Oberkiefer eingesetzt werden.
- Legen Sie die Primärelektrode Nadel in die Schädelöffnung. Legen Sie dieNadel in das Gewebe, so dass die Spitze ziemlich oberflächlich innerhalb der optischen Tectum positioniert.
- Wenn die Elektrode zu tief ist, kann das elektrische Signal klein sein.
- Sammeln und zu analysieren, die elektrische Unterschied zwischen der primären und sekundären Referenzelektroden aufgezeichnet. Dieser Prozess wird für extrazelluläre Aufnahmen erzielen lässt.
- Sammeln der Daten in Gap-freien Modus bei einer Abtastrate von 5 kHz, mit einem Tiefpassfilter von 0,1 kHz und einem Hochpassfilter von 1 Hz ist.
- Sie Aufnahme elektrophysiologische Aktivität, bis Lebensraum Wasser für mindestens 45 min durchströmt nicht beginnen.
- Aufzeichnen einer Grundlinie des nativen Aktivität für mindestens 15 min vor der Zugabe von experimentellen Arzneimitteln. Beginnen Perfusion mit experimentellen Mittel der Wahl und Aufnahme für die gewünschte Menge an Zeit. Bei gesunden Zubereitungen ist es möglich, die neurologische Aktivität 2-3 Stunden aufzuzeichnen.
5. Aufräumen
- Euthanize das Tier durch Drogen-Überdosis mit Tricaine in Übereinstimmung mit den anerkannten Verfahren, wie von der American Veterinary Medical Association (AVMA) Richtlinien für die Euthanasie von Tieren (2013) beschrieben.
- Zebrafisch eingeschläfert werden sollte in einem Tricaine Lösung bei 200-500 mg / L. platziert werden Fische sind in der Lösung für ein Minimum von 10 Minuten nach Beendigung der rhythmischen Aktivität Kiemendeckel, nach der sie an ein physikalisches Mittel der Euthanasie (zervikale Trennung) unterzogen, um sicherzustellen, Tod überlassen werden.
- Führen DI-Wasser durch alle Rohre und sammeln zur Entsorgung, wenn gefährliche.
- Lassen Sie die Absperrhähne für jede Röhre in der offenen Position, um Luft das Trocknen zu erleichtern.
- Weichen Sie die Elektroden, die in 70% Ethanol und an der Luft trocknen.
- Reinigen Sie jedes Stück mit 70% Ethanol und an der Luft trocknen.
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Representative Results
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die neuronale Aktivität von erwachsenen Zebrafisch in vivo zu messen. Diese elektrophysiologischen Ableitungen sind konsequent und reproduzierbar erhalten. Abbildung 5 zeigt ein repräsentatives Beispiel von nativen und induzierte Veränderungen der neuronalen Aktivität eines erwachsenen Zebrafisch, wenn Pentylentetrazol (PTZ), eine gemeinsame chemoconvulsant 6,7,25,26, ist in der Intubation eingeführt Setup.
Die native neurologische Aktivität des erwachsenen Zebrafisch wurde für jedes Experiment (Fig. 5A) überwacht. Es wurde konsequent beobachtet, daß diese Aktivität spontan und kleine Amplitude während der Dauer der Aufzeichnung. Nach der Einführung von 15 mM PTZ dem System begann spontane epileptiforme Entladungen artige bis etwa 5 min entwickeln. nach der Einführung. Diese Tätigkeit war zunächst kurze, kleine Amplitude und trat häufig auf, ähnlich dem, was innerhalb Larven z beobachtetebrafish 6,7. Bei längerer Einwirkung auf das PTZ, ein einheitliches Muster entwickelt großer Amplitude Entladungen, die durch kleinere, häufigere Ausbrüche von Aktivität und eine anschließende Ruhephase (5B) folgten.
Diese Technik wurde erfolgreich verwendet, um andere chemoconvulsants durch die Intubation System einzuführen. Mit diesen Verbindungen wurden Änderungen in der nativen neurologische Aktivität auch effektiv hervorgerufen. Pentylentetrazol wurde als Beispiel da es robust Fähigkeit, ändern die native neuronale Aktivität des Zebrafisch in einer stereotypen Art und Weise verwendet.
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Discussion
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die neuronale Aktivität von erwachsenen Zebrafisch in vivo zu messen. Mit etwas Übung können neuronale Aktivität konsequent eingehalten werden, obwohl die Eigenschaften (Amplitude und Form der Ereignisse) der aufgezeichneten Aktivität kann zwischen einzelnen Fische variieren. Nutzung der extrazellulären Aufnahmetechnik kann diese Beobachtung erklären. Das Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Überwachung einer Vielzahl von Zellen in einem Bereich 1, so dass Variationen in der Positionierung der primären Elektrode kann eine Rolle bei der beobachteten Aktivität spielen. Tiefe der Primärelektrode ändert sich auch die Region gemessen wird. Wenn die Spitze der Elektrode zu tief in einem Bereich positioniert ist, wird das beobachtete Signal kleiner als erwartet und Veränderungen in der Aktivität wird schwieriger zu beobachten sein, wenn dies der Fall ist, ziehen Sie einfach wieder die primäre Elektrode, so dass die Spitze mehr oberflächlich sitzen . Beachten Sie, dass dies ist charakteristisch für die Tectum opticum und nicht seinen sah in der Tiefe in anderen Regionen des Gehirns. Jedoch könnte diese Verfahren in einem anderen Bereich des Gehirns durchzuführen. Falls die beobachtete neuronale Aktivität auf das Ausgangsniveau sinkt während des Experiments, und es ist ungewiss, ob die Fische noch am Leben ist, entfernen Sie die Elektroden aus dem Schädel und überprüfen, ob es noch den Blutfluss in der gesamten Tier. Dies kann durch die Beobachtung der großen Gefäße in der Lippe oder Nasenbereich des Fisches überprüft werden. Blutfluss kann leicht in diesen Regionen zu erkennen. Wenn die Elektroden entfernt, um den Blutfluss in der Mitte der Aufnahme überprüft, wenn die Neupositionierung der Elektroden, werden sie in einer etwas anderen Stelle sein als sie ursprünglich waren, negiert die Möglichkeit, diesen Teil der Aufnahme zu der ursprünglichen Basislinie direkt zu vergleichen .
Vor Beginn dieses Verfahrens muss gewährleistet werden, dass die Intubation Rohre sowie die Perfusionsschläuche sowohl für die Kraniotomie und die Elektrophysiologie Setups sindfrei von Blasen. Wenn Blasen sammeln, können sie aus dem System durch das Öffnen der Hahn und so etwas von der Lebensraum Wasser durch laufen ausgeführt werden. Wenn dies nicht das Problem zu beseitigen, kann eine kleine Spritze am Ende der Röhre, wo die Kanüle platziert werden würde befestigt werden, und Licht Saug angelegt, um jegliches restliche Luft in dem System zu entfernen. Für hartnäckige Luftblasen können Lebensraum Wasser durch den Schlauch gedrückt werden. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Durchblutung Rohre grundiert und tropft vor Intubation der Fische. Wenn eine Strömungsgeschwindigkeit von ~ 1 ml / min nicht erreicht wird, kann die Höhe des Druckkopfs, um dies zu erreichen, verändert werden. Dadurch wird sichergestellt, dass der Fisch verfügt über eine ausreichende Wasserströmung. Wenn der Elektro Perfusion Einrichtung eingerichtet ist mit zahlreichen Röhren in Reihe, wurde bestimmt, dass es dauerte ca. 1 Min. für die neue Lösung für das Tier eingebracht werden, obwohl sich daraus ergebenden Änderungen in der aufgezeichneten neurologische Aktivität war abhängig von der Verbindung, being eingeführt. Es wird empfohlen, dass diese Durchflussrate vor der Durchführung keine Experimente gemessen werden. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Tricaine neuronale Aktivität zu dämpfen, ist es erforderlich, um aus dem System, um eine genaue Aufnahmen 27,28 erhalten entfernt werden. Durch früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass ein Zeitraum von 45 bis 60 min mit der Intubation Lebensraum Wasser benötigt zum Auswaschen der Tricaine und für neuronale Aktivität in den einheitlichen Niveau zu erreichen. Ebenso Auswaschen Pentylentetrazol wurde ebenfalls durchgeführt, und es wurde festgestellt, dass ein Zeitraum von 20 min war erforderlich, um die neuronale Aktivität auf das Ausgangsniveau zurück. Daher sollte Experimentatoren Studien zu vervollständigen Auswaschzeiten für jede Verbindung von Interesse, die in das System eingeführt zu bestimmen.
Diese Technik erfordert etwas Übung. Bei der Durchführung der Kraniotomie muss besonders darauf geachtet werden, dass ein kleiner Bereich der Knochenplatte, die den Kopf abdeckt können punktiert und ohne Beschädigung entfernt werden kanndas Gehirn. Dies kann durch die Einführung der vanna Schere in einem spitzen Winkel in Bezug auf den Kopf erfolgen. Die knöcherne Fläche von der Optik hat Tectum-Fusionen in der Nähe der Mitte, die schwach sind und dienen als gute Einstiegspunkte für die Schere. Sobald eine kleine Pause hat innerhalb der Platte gemacht, mit einer Schere einen kleinen Bereich des Knochens schneiden und entfernen mit einer feinen Pinzette. Die kleinen Fische haben oft weicher, geschmeidiger Schädel, so dass Fische, die 1 Jahr oder weniger sind für den Einsatz vorgeschlagen und lernen diese Technik. Gelegentlich wird Blut beginnen, um den Bereich der Schädel sammeln, aber das kann durch Abtupfen eine Kimwipe sanft in die Umgebung entfernt werden. Bei diesem Verfahren ist die Kraniotomie sehr klein, etwa 2 mm 2 Fläche. Aufgrund dieser geringen Größe hat Austrocknung des Oberkopf nicht aufgetreten ist. , Wenn die Kraniotomie in der Größe größer ist, ist es jedoch möglich, Agar oder ein anderes Material aufzubringen, um den Feuchtigkeitsverlust aus dem Gehirn zu verhindern, wenn dies nicht zu einem professionellenblem.
Eine Sehenswürdigkeit ist die Verwendung des Pancuroniumbromid. Diese Chemikalie wird in Aliquots von 10 ul, um sich wiederholende Einfrieren und Auftauen verhindert werden. Die vorgeschlagene Volumen in einem Experiment verwendet werden, wobei 1 ul pro Gramm beträgt, ist normalerweise ausreichend, um eine erwachsene Fische zu immobilisieren. Gelegentlich ist dies jedoch nicht ausreichend Volumen. Wenn dies auftritt und Paralyse nicht erhalten wird, mehr Pancuroniumbromid können intraperitoneal an die Fische, solange die Aufnahme noch nicht begonnen hat, verabreicht werden. Bei der Durchführung der Injektion, versuchen Sie nicht, durch die harten Schuppen Seite injizieren, spritzen die Fische in der weicheren Bauchbereich, in der Nähe der Lüftungs. Wenn die Fische zu bewegen beginnt, sobald der Primärelektrode angeordnet wurde, besteht eine gute Chance, daß die Nadel ausgeschaltet wurde innerhalb der Kraniotomie gebrochen, und das Verfahren muß unter Verwendung eines neuen Tier wiederholt werden. Durch diese Arbeit wurde festgestellt, dass Pancuroniumbromid können die aufgezeichneten neuronalen reduzierenAktivität in Zebrafisch-Larven (≤ 50% des Ausgangsamplitude) und es wird angenommen, dass das gleiche gilt für Erwachsene. In den letzten Erfahrungen, ist die neuronale Aktivität in einem erwachsenen robust genug, dass alle dämpfenden Effekte auf Pancuroniumbromid zurückzuführen scheinen nicht nachteilig auf die Fähigkeit, Daten zu sammeln und zu analysieren. Im Gegensatz dazu kann verwechselt mit Bewegung verbunden signifikant sein. Für dieses Verfahren ist die Vorteile der völligen Unbeweglichkeit des Tieres der Wert über dieser Einschränkung und die neuronalen Veränderungen, die eingeführt werden, robust genug, um jenseits aller dämpfenden Effekte andauern. Auch kann jede Bewegung aus dem Tier die Elektrode zu verschieben, von der Elektrophysiologie Aufnahmegeräte registriert werden und möglicherweise gefährden das Tier.
Die Grenzen dieses Verfahrens liegen vor allem darin, dass die extrazelluläre Aufnahme ist der einzig mögliche Weg des Aufzeichnungs neurologische Aktivität in intakten erwachsenen Zebrafisch. Bei der Positionierung der prima ry Elektrode muss die Nadel in die Kraniotomie eingefügt werden, verhindert eine aus genau sehen, wo die Elektrode platziert wird. Aber mit der Praxis ist es möglich, die Elektrode in der Region und in der gleichen Tiefe konstant zu halten.
Elektrophysiologie in vivo weitgehend auf Zebrabärblingembryonen beschränkt. Dies beruht auf der Fähigkeit, leicht immobilisieren kleine Fische und die Tatsache, dass sie Intubation erfordern. Deshalb haben elektrophysiologische Untersuchungen zu den Larvenstadien fokussiert und wurde wenig über die elektrophysiologische Aktivität im Gehirn von Erwachsenen gemacht. Dies hat keine Vergleiche zwischen jugendlichen und erwachsenen neurologische Aktivität gemacht werden verhindert. Die Verwendung des Rohrbündel Intubation System erlaubt für eine einfache Einführung einer Vielzahl von Verbindungen zu dem Fisch. Dies ermöglicht auch die Auswirkungen von verschiedenen Chemikalien oder Medikamente in sowohl die Larven-und Erwachsenensysteme untersucht werden.
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Fig. 1 ist. Intubationskanüle. Entfernen eines 1,5 cm Ausschnitt aus dem breiten Ende eines gelben P-200 pipetteman Spitze (A). Legen Sie eine 6 cm x 1 mm Schlauchstück (Pfeil) in einen Luer-Lock-Anschluss reduziert (B) und setzen diese Kanüle in die modifizierte Pipettenspitze. Halten Sie die Pipettenspitze in Position mit dem Luer-Lock mit einem kurzen Abschnitt in ⅛ Schlauch (C).
2. Fertige Intubation Basis-Setup. Sobald der Golf Wachs abgekühlt ist, legen Sie die Setup-Kanüle in das kleinere Loch des intubation Basis (A). Drehen Sie eine 1 in breiten Streifen von 42 cm Kimwipe in einer engen Spirale und legen Sie sie in das Drainagerohr, so dass die Kimwipe erstreckt sich an beiden Enden. Stecken Sie ein Ende des Drainageschlauch in das große Loch der Petrischale (B), so dass das untere Ende in ein 30 mm x 100 mm Kristallisierschale (nicht in Sicht) zu verlängern. Positionieren Sie das Gewebe, so dass ein Ende wird in der Nähe von Bauchbereich des Tieres (mit schwarz-gestrichelten Linie umrandet) liegen und die untere Erweiterung kann in die Schüssel tropft.
3. Kraniotomie. Unter dem Dissektionsmikroskop verwenden vanna Frühjahr Schere auf ~ 2 mm 2 Abschnitt des Schädels für den Tectum opticum entfernen. Dieser Bereich sieht aus wie ein dunkles, trapezförmigen Knochenplatte, dass sdessen hinter dem Auge. Der gestrichelte Kreis abgrenzt, wo der Kraniotomie positioniert ist. Die Pfeilspitze zeigt, dass es die Nadel der Primärelektrode ist innerhalb der Bohrung der Kraniotomie positioniert. Die Primärelektrode besteht aus einer 2,5 im Schnitt 0,010 Silberdraht, der mit Chloridionen elektrolytisch und in eine Kapillare Borosilikat Nadel eingeführt wurde. Die Kapillare Nadel mit 2-3 &mgr; l 2 M Kaliumchlorid, oder genug, um teilweise abdecken Chlorid-beschichtete Spitze des Silberdrahtes gefüllt. Die Sekundärelektrode 15 besteht aus einem im Querschnitt der gleichen Draht für die primäre Elektrode, mit der Ausnahme, dass eine Spitze an einem Ende angelötet, so dass er in die Rückseite der Kopfstufe eingefügt werden. Das Ende der Sekundärleitung angeordnet ist, die den Fisch berührt werden soll, muss auch mit Chloridionen elektroplattiert werden. Der Pfeil zeigt an, wo die Sekundärelektrode hat im rechten Nasenloch der erwachsenen Fische positioniert.
4. Einrichtung zum Sammeln von elektrophysiologischen Aktivität. Die intakte Intubation Einrichtung ist mit dem Elektromikroskop bewegt und der Kanüle ist mit dem Perfusionssystem (A) verbunden ist. Das System Wasser muss eingeschaltet werden, so dass Durchblutung, um sofort zu starten. Verwendung des Mikromanipulators, positionieren die Sekundärelektrode (B), so daß die Elektrodenspitze in die Nasenöffnung des Tieres oder in das Tauch hinter der oberen Backe (Pfeil) eingesetzt. Legen Sie die Primärelektrode Nadel (C) in die Schädelöffnung. Führen Sie die Nadel, so dass es innerhalb des Tectum opticum ziemlich oberflächlich positioniert ist. Die große Drainagerohr (D) von der Intubation Schale, aus dem Sichtfeld, und das andere Ende mündet in ter Auffangschale.
5. Elektrophysiologische Aufzeichnungen im Tectum opticum. (A) Es wurde konsequent beachtet, dass die native Tätigkeit im Tectum opticum des erwachsenen Zebrafisch ist stereotyp spontan, zeigt kleine Amplitude (2-10 mV) Tätigkeit während der Dauer der Aufnahme. (B) Nach der Einführung der 15 mM PTZ mit dem System begann spontane epileptiforme artigen Einleitungen in ca. 5 min zu entwickeln nach der Einführung. Diese Tätigkeit war zunächst kurze, kleine Amplitude. Bei fortgesetzter Einwirkung des PTZ, ein einheitliches Muster mit großer Amplitude (bis zu 15 mV) Entladungen entwickelt, die durch kleinere, häufigere Ausbrüche von Aktivität folgte.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH / NINDS Zuschuss R01NS070159 (TMD, JDL und ATS) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
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