Summary
Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos para permitir grabaciones y la manipulación de la actividad neuronal en un animal intacto.
Abstract
Anteriormente, los estudios electrofisiológicos en adultos de pez cebra se han limitado a cortar los preparados o de preparación para la Copa del ojo y grabaciones electrorentinogram. Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos, lo que permite la grabación de la actividad neuronal. Inmovilización del adulto requiere un mecanismo para entregar el oxígeno disuelto de las branquias en lugar del movimiento bucal y opercular. Con nuestra técnica, los animales se inmovilizan y perfundidos con agua hábitat para cumplir con este requisito. Una craneotomía se realiza bajo tricaína metanosulfonato (MS-222; tricaína) anestesia para facilitar el acceso al cerebro. El electrodo primario se coloca entonces dentro de la ventana de craneotomía para registrar la actividad cerebral extracelular. A través del uso de un sistema de perfusión de haces tubulares, una variedad de compuestos farmacológicos se puede administrar a los peces adultos y cualquier alteración en la actividad neuralse puede observar. La metodología no sólo permite observaciones que se hagan con respecto a cambios en la actividad neurológica, sino que también permite que se hagan comparaciones entre las larvas y adultos de pez cebra. Esto da a los investigadores la capacidad de identificar las alteraciones en la actividad neurológica debido a la introducción de diversos compuestos en diferentes etapas de la vida.
Introduction
En este artículo, un protocolo se describe para la obtención de grabaciones in vivo de la actividad neuronal en adultos de pez cebra. Se utilizan métodos de registro extracelular, proporcionando mediciones de voltaje de actividad eléctrica dentro de una pequeña región de tejido neural. Este método de investigación implica el seguimiento de un gran número de células en un animal de comportarse 1. Anteriormente, las grabaciones de división se han realizado en adultos y larvas, como lo han hecho los preparativos de la taza del ojo y grabaciones electrorretinograma. Estos experimentos se han realizado en gran medida al detalle las respuestas fisiológicas de diferentes sistemas sensoriales 2-5. Hasta hace poco, los preparativos cerebrales intactas sólo han estado disponibles para la realización de electrofisiología con 3,6,7 larva de pez cebra, que se puede producir la difusión de la respiración y el oxígeno a través de la piel. Nuestra preparación permite que la actividad neurológica nativa de un pez cebra adulto a medir mientras el animal sigue siendo plenamente consciente y consciente of sus alrededores.
El pez cebra (Danio rerio) actualmente juegan un papel fundamental como modelo para estudios genéticos, toxicológicos, farmacológicos y fisiopatológicos 3. El pez cebra se han ganado visibilidad en el campo de la neurociencia, ya que comparten una amplia similitud con los mamíferos a nivel genético, neurales y endocrinas niveles 8. Durante la última década, las técnicas neuroanatómicas y inmunohistoquímicos estándar se han utilizado para determinar la organización característica detallada del sistema nervioso pez cebra 9-12 y de la distribución de los diferentes neurotransmisores 3,8,13. Más recientemente, los investigadores han cambiado su enfoque a los estudios funcionales 14,15, muchos de los cuales se centran en los procesos conductuales 16-19 y características electrofisiológicas de los sistemas sensoriales 2,13,20. Un pequeño número de estos estudios se han concentrado en la actividad eléctrica de las áreas específicas del adult cerebro del pez cebra 21-23, pero no se llevaron a cabo utilizando un enfoque in vivo.
Este protocolo puede ser adaptado para estudios electrofisiológicos de tanto la actividad espontánea y evocada dentro del sistema nervioso pez cebra para describir los patrones de actividad en regiones específicas del cerebro. El uso de esta técnica permite que se hagan comparaciones entre la actividad neurológica de los estadios larvales y adultos jóvenes. Además, nuestro protocolo permite comparaciones entre alteraciones genéticas o farmacológicas. Junto con otros enfoques, como la ingeniería genética o pruebas farmacológicas, este método ofrece una nueva posibilidad para el análisis funcional de la comunicación neuronal y la plasticidad en el adulto animal intacto, así como para las aplicaciones potenciales, tales como el estudio de la epilepsia de inicio tardío o los procesos neurodegenerativos.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales se realizaron en estricto acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y siguieron el protocolo # A2011 09-003, que fue revisado, aprobado y supervisado por la Universidad de Georgia Institucional Cuidado de Animales y Uso Comité.
1. Configuración del equipo
- Sistema de perfusión para la craneotomía
Inmovilización del adulto requiere un sistema de intubación para entregar oxígeno disuelto a los peces. Una variedad de sistemas puede ser utilizado, pero se utiliza un sistema de gravedad simple que consiste en una jeringa de 60 ml. Elevar la presión de la cabeza a una altura que produce consistentemente una velocidad de flujo de 1 ~ ml / min. Esta jeringa se puede colocar en serie con las jeringas que luego se utilizan para el sistema de perfusión electrofisiológico.- Obtener una 60 ml Luer del tubo de la jeringa de bloqueo y retire el émbolo.
- Suspender la jeringa aproximadamente 8 in &º 160, por encima de la base de un anillo-soporte mediante una abrazadera.
- Conectar una llave de paso de un solo sentido para el extremo de la jeringa. Para el extremo opuesto de la llave de paso, conectar una pieza de tubo, 2 mm de diámetro, que es lo suficientemente largo como para extenderse a la base de la intubación.
- Sistema de perfusión para electrofisiología
Para los experimentos electrofisiológicos, a menudo es necesario introducir una gran variedad de compuestos durante el curso de un experimento. Una variedad de sistemas están disponibles, pero un sistema de gravedad que consiste en 60 ml de jeringas en serie puede ser utilizado. Esta configuración permite una introducción simple, serie de soluciones que se llevarán a cabo mediante la apertura de la llave de paso correspondiente.- Obtener dos o más 60 ml Luer jeringas de bloqueo y quite los émbolos de cada uno. Se requiere una jeringa para administrar agua hábitat para los peces, mientras que cada tubo subsiguiente se puede utilizar para administrar una variedad de compuestos farmacológicos para los peces.
- Conecte cada jeringa a un 3 -manera llave de paso con una conexión Luer.
- Utilice ⅛ en diámetro exterior del tubo (OD) para conectar las jeringas en serie con un bloqueo Luer macho en un extremo.
- Asegure el dispositivo de tal manera que el cabezal de presión se eleva a una altura de 27 en encima de la base, o una altura que produce consistentemente un caudal de 1 ~ ml / min.
- Cánula de intubación
La cánula de intubación facilita la introducción de fluido a los peces. Esta configuración proporciona la flexibilidad y la firmeza a la mejor posición de la cánula dentro de la boca del animal.- El uso de cualquier par de tijeras en general (por ejemplo,. Fiskars) o una hoja de afeitar, quitar una sección de 1,5 cm desde el extremo ancho de una punta de pipeta P-200.
- Inserte un trozo de tubo mm 6 cm x 1 en una válvula reductora con un tapón hembra Luer lock y la férula de silicona, es decir, un adaptador Tuohy Borst, e insertar esta cánula en la punta de la pipeta modificado. Sostenga la punta de la pipeta en posición con el Luer lock utilizando una corta porción de ⅛ en tubo de diámetro.
Figura 1
- Base de intubación
Este plato es utilizado para sostener el animal inmovilizado en una posición estable, en posición vertical y para facilitar la eliminación del fluido que entra en el animal a través de la intubación. Si esto no se ha establecido correctamente, se puede producir la puesta en común, lo que lleva a las señales vibratorias intrusivos en el registro electrofisiológico.- Obtener el plato de base de un 100 mm x 15 mm placa Petri de plástico.
- Utilizando una herramienta de soldadura, fundir un agujero, 6 mm de diámetro y 7,5 mm por debajo del borde de la llanta, en el lado del plato. Utilizando la misma herramienta, fundir un agujero, 10 mm de diámetro y 11 mm por debajo del labio del plato ~ 74 ° en sentido antihorario desde el agujero más pequeño. Este agujero servirá como el orificio de drenaje.
- Inserte un tubo, 1 cm de diámetro, en el agujero con el extremo levantado de tal manera que al final no puede ser bloqueada. A continuación, inserte una punta P-200 pipetteman en el pequeño orificio, lo que servirá como una cánula maniquí.
- Con la placa de Petri ligeramente elevada en el lado del agujero más grande, se vierte la cera fundida enlatado en el plato de manera que el orificio de la cánula quede cubierto. La región servirá como un tope, lo que permite la cánula que se inserta ~ 3 mm en la boca de los peces. Esta puesta en marcha se debe permitir que se solidifique.
- El uso de un borde de metal de llama calentado, tallar un canal para mantener el pescado de manera que el canal comienza a partir de la punta de la cánula y se extiende aproximadamente 1-2 pulg
- Se debe tener cuidado para asegurar que se forma un ángulo hacia abajo continua de la zona de cánula al puerto de drenaje.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
Figura 2
- Se debe tener cuidado para asegurar que se forma un ángulo hacia abajo continua de la zona de cánula al puerto de drenaje.065fig2.jpg "width =" 400px "/>
- Configuración de perfusión
- Antes de empezar, limpiar las perfusión set-ups con agua del hábitat, lo que garantiza que se eliminen todas las burbujas de aire.
- Añadir ~ 30 ml de 0,016% (630 mM) solución tricaína a la configuración de la perfusión craneotomía y permiten ~ 2 ml a ejecutar a través de la tubería para asegurar que tricaína será entregado al animal tras el inicio de la perfusión. Ver el paso 2.2 de dilución.
- Para la configuración principal de perfusión, agregue ~ 50 ml de agua de hábitat al primer tubo. Añadir todos los compuestos experimentales deseados a cada uno de los tubos restantes.
- Coloque la configuración cánula en el pequeño orificio de la base de la intubación.
- Gire un 1 en toda la franja de 42 cm Kimwipe en un espiral apretado y la inserta en el tubo de drenaje de forma que el Kimwipe extiende en ambos extremos. Este tejido servirá como una mecha para eliminar el líquido perfundido y para evitar la acumulación de fluido dentro de tque la intubación de base, lo que podría interferir con el registro electrofisiológico.
- Inserte un extremo del tubo en el orificio grande de la placa de Petri, permitiendo que el extremo inferior de extender en un plato inerte que es lo suficientemente grande como para recoger todos los residuos de la perfusión. Este plato será el depósito de salida para la configuración. Coloque el tejido de manera que un extremo se encuentran cerca de la región del abdomen del animal y la extensión inferior puede gotear en el plato.
- Coloque esta base de intubación completado cerca del microscopio de disección. Conectar el cierre Luer de la cánula para el tubo de perfusión tricaína.
- Capilar de la aguja y electrodos
- Obtener un electrodo primario que consiste en 2,5 en la de 0.010 en hilo de plata y un electrodo de secundaria que debe ser formada por 15 en el mismo cable a tierra a la instalación. Para el electrodo secundario, utilizar un 15 en la sección de 0,010 en alambre de plata con una punta soldada, que permite que quepaen la parte trasera de una etapa de la cabeza.
- Electrochapa las puntas de ambos los alambres de plata primaria y secundaria con los iones de cloruro.
- El uso de un extractor de micropipeta, tire un borosilicato aguja capilar de pared delgada con una resistencia de <15 mΩ.
- Llenar la aguja capilar con 2-3 l de 2 M de cloruro de potasio, o lo suficiente para cubrir parcialmente la punta cloruro recubierto de alambre de plata.
- Inserte el electrodo primario en la cabeza del capilar y montarlo en el soporte del electrodo.
- Monte la etapa de la cabeza en un micromanipulador y luego montar el electrodo secundario en un segundo micromanipulador. Con la instalación, la primera posición de cada electrodo y luego coloque la punta del electrodo de soldadura secundaria en la parte posterior de la etapa de la cabeza.
- Obtener un electrodo primario que consiste en 2,5 en la de 0.010 en hilo de plata y un electrodo de secundaria que debe ser formada por 15 en el mismo cable a tierra a la instalación. Para el electrodo secundario, utilizar un 15 en la sección de 0,010 en alambre de plata con una punta soldada, que permite que quepaen la parte trasera de una etapa de la cabeza.
2. Preparación de las soluciones, sistema de perfusión, y electrofisiológico Equipo de grabación
- Obtener 1 L de agua hábitatdel acuario de los peces.
- 0,016% T] metanosulfonato de tricaína (tricaína) (50 ml de 630 mM) 24.
- Descongelar una alícuota de 0,4% tricaína tamponada con Tris, pH 7,2.
- Añadir 2,1 ml de 0,4% tricaína Tris-buffer a 47,9 ml de agua del hábitat y mezclar.
- Descongele concentración madre de deseado compuesto experimental soluble en agua (por ejemplo pentilentetrazol 300 mM, un chemoconvulsant común).
- Descongelar una alícuota de 1 mg / l bromuro de pancuronio en solución de Ringer.
- Llenar ambos sistemas de intubación experimentales con agua y hábitat anestesiante y drene por lo menos lo suficiente como para eliminar todas las burbujas de los tubos. Esto debe hacerse porque las burbujas obstruyen el flujo de fluido, que conduce a la asfixia del animal.
- Vaciar completamente los tubos de perfusión que sostendrán los medicamentos sin permitir que el aire en el tubo de conexión.
- Llene el tubo anestesiante con 0,016% (630 M) solución tricaína y colocar cualquier expercompuesto imental (s) en el tubo adicional (s) en el sistema de perfusión experimental.
- El primer tubo de perfusión experimental debe contener sólo agua del hábitat.
- Humedezca la pequeña esponja de poros con agua hábitat y colocar en un vacío de 60 mm x 15 mm placa de Petri. Este plato se utiliza para mantener a los peces mientras se inyecta el anestésico.
3. Craneotomía
- Agregar suficiente de la solución tricaína 630 M a un 15 x 60 mm placa de Petri para llenarlo aproximadamente tres cuartas partes del camino. Pesar el plato lleno. Esto se utiliza para inmovilizar el animal para que otros anestesia pueden ser inyectados por vía intraperitoneal.
- Sumerja el animal en el plato que contiene tricaína y pesarlos de nuevo.
- Restar la diferencia entre los pesos de los pasos 1 y 2 para obtener el peso de los peces.
- Permita que el animal permanezca en la solución tricaína hasta la calma y la mayor movimiento ha cesado.
- Con un par de pinzas grandes, traslado a los peces a la esponja prehumedecido y posicionar lateralmente. Transferencia de los peces por la cola funciona bien para este proceso.
- Coloque la esponja y los peces bajo el microscopio de disección.
- Con una jeringa Nanofil que contiene una aguja 34, mida lo suficiente bromuro de pancuronio tal que no es 1 g / g de peso del pez.
- El uso de un palito de paleta a lo largo de la parte dorsal de los peces a mantenerla firme, administrar el bromuro de pancuronio intraperitoneal utilizando la jeringa Nanofil.
- Usando las pinzas finas, coge el pez por la mandíbula y rápidamente transferir el animal a la base de la intubación.
- Coloque el animal de modo que es dorsal-up en la forma de cera y de tal manera que la cánula 1 mm puede ser insertado en la boca. Utilice las pinzas finas para maniobrar el pescado y abrir la boca alrededor de la cánula. Debido a la composición de la bandeja de intubación, una parada se diseñó en la base, permitiendo que elcánula que se inserta 3 mm en la boca de los peces.
- Una vez en posición, encienda el tubo de perfusión por gravedad que contiene tricaína.
- Corte una sección de 3 cm2 de tejido Kimqipe y mojarlo con agua del hábitat.
- Coloque el tejido sobre el animal para evitar la desecación. La sección Kimwipe también puede ser posicionada para ayudar en la sujeción del animal dorsal plano.
- Bajo el microscopio de disección, utilice tijeras de primavera vanna para eliminar ~ 2 mm 2 sección del cráneo que cubre el techo óptico. Esta zona parece un plato oscuro y huesudo que se sienta detrás del ojo.
Figura 3- Inserte una hoja de la tijera vanna en el borde de la placa y empujar con la fuerza suficiente para la penetraciónte El hueso, sin perforar el cerebro. Cierre las tijeras para cortar el hueso.
- Retire el trozo de hueso.
- Si nada de sangre está presente, retire con el borde de un Kimwipe. El sangrado por lo general se detiene poco después de la realización de la craneotomía.
4. Electrofisiología
- Cierre la llave de paso de la intubación y rápidamente desconectar el bloqueo Luer que conecta la base a la intubación por goteo tricaína.
- Mueva la configuración intubación intacta al microscopio electrofisiología y conectar con el sistema de perfusión.
- Abra el agua y hábitat perfusión a una velocidad de 1 ml / min durante aproximadamente 1 hora, con el fin de lavar el tricaína.
- El uso de un micromanipulador bajo control visual, la posición del electrodo secundario de manera que la punta del electrodo se puede insertar en la fosa nasal del animal o en el baño detrás de la mandíbula superior.
- Inserte la aguja del electrodo principal en la apertura craneotomía. Inserte elaguja en el tejido, de tal manera que la punta se posiciona bastante superficial en el techo óptico.
- Si el electrodo es demasiado profundo, la señal eléctrica puede ser pequeña.
- Recopilar y analizar la diferencia eléctrica registrada entre los electrodos de referencia primarios y secundarios. Este proceso permitirá que las grabaciones extracelulares que se obtengan.
- Recoge los datos en modo-Gap libre a una velocidad de muestreo de 5 kHz, con un filtro de paso bajo de 0.1 kHz y un filtro de paso alto de 1 Hz.
- No comience a grabar la actividad electrofisiológica hasta que el agua del hábitat ha perfundido durante un mínimo de 45 min.
- Grabación de una línea de base de la actividad nativa durante al menos 15 min antes de la adición de fármacos experimentales. Comenzar la perfusión con fármacos experimentales de elección y registro de la cantidad de tiempo deseado. En las preparaciones sanos, es posible grabar la actividad neurológica durante 2-3 h.
5. Limpiar
- La eutanasia a los animales por sobredosis de drogas utilizando tricaína de acuerdo con las prácticas aceptadas, como se indica por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) Directrices para la Eutanasia de los Animales (2013).
- El pez cebra que ser sacrificados debe ser colocado en una solución tricaína a 200-500 mg / L. Los peces son para ser dejado en la solución durante un mínimo de 10 minutos después de la cesación de la actividad opercular rítmica, después de lo cual se les somete a un medio físico de la eutanasia (transección de cuello uterino) para asegurar la muerte.
- Deje correr el agua desionizada, a través de todos los tubos y recoger para su correcta eliminación, si peligroso.
- Agregar las llaves de paso para cada tubo en la posición abierta para facilitar el secado de aire.
- Sumerja los electrodos en etanol al 70% y dejar secar al aire.
- Limpie cada pieza con etanol al 70% y dejar secar al aire.
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Representative Results
Este protocolo se ha usado para medir la actividad neuronal de adultos de pez cebra en vivo. Estos registros electrofisiológicos se consistente y reproducible obtenidos. Figura 5 muestra un ejemplo representativo de las alteraciones inducidas nativas y de la actividad neural de un pez cebra adultos cuando pentilentetrazol (PTZ), una chemoconvulsant común 6,7,25,26, se introduce en la intubación configuración.
La actividad neurológica nativo del pez cebra adulto se controló para cada experimento (Figura 5). Se observó consistentemente que esta actividad es espontánea y pequeña en amplitud durante la duración de la grabación. Tras la introducción de 15 mM PTZ al sistema, las descargas epileptiformes-como espontáneos comenzaron a desarrollar unos 5 min. después de la introducción. Esta actividad fue inicialmente breve, pequeña amplitud y se produjo con frecuencia, similar a lo que se observó dentro de Z larvasebrafish 6,7. Con la exposición continuada a la PTZ, un cuadro persistente de grandes descargas de amplitud desarrollados que fueron seguidas por pequeñas explosiones y más frecuentes de actividad y un período de calma posterior (Figura 5B).
Esta técnica se ha utilizado con éxito para introducir otros chemoconvulsants a través del sistema de intubación. Con estos compuestos, cambios en la actividad neurológica nativa también fueron evocados efectivamente. Pentilentetrazol se usa aquí como un ejemplo la capacidad debido a alterar robustamente la actividad neuronal nativo del pez cebra de una manera estereotípica.
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Discussion
Este protocolo se ha usado para medir la actividad neuronal de adultos de pez cebra en vivo. Con la práctica, la actividad neuronal se puede observar constantemente, a pesar de las características (amplitud y la forma de eventos) de la actividad registrada pueden variar entre los peces. La utilización de la técnica de grabación extracelular puede explicar esta observación. El método proporciona control simultáneo de un gran número de células dentro de una región 1, por lo que las variaciones en el posicionamiento del electrodo primario puede desempeñar un papel en la actividad observada. Profundidad del electrodo primario también cambia la región que se está midiendo. Si la punta del electrodo se coloca demasiado profundo dentro de una región, la señal observada será menor de lo esperado y las alteraciones en la actividad serán más difíciles de observar, y si esto ocurre, simplemente tire hacia atrás el electrodo primario para que la punta está sentado más superficialmente . Tome en cuenta que esto es característico del techo óptico y no ha seren examinará en profundidad en otras regiones del cerebro. Sin embargo, este procedimiento podría llevarse a cabo dentro de una región diferente del cerebro. Si la actividad neuronal observada disminuye a los niveles basales durante el experimento y no se sabe si el pescado está todavía viva, retire los electrodos del cráneo y comprobar para ver si todavía hay flujo de sangre por todo el animal. Esto se puede comprobar mediante la observación de los grandes vasos en el labio o en la zona nasal de los peces. El flujo de sangre se puede ver fácilmente en estas regiones. Si se retiran los electrodos para comprobar el flujo de sangre en el medio de una grabación, cuando el reposicionamiento de los electrodos, que estarán en una ubicación ligeramente diferente de lo que eran inicialmente, negando la capacidad de comparar directamente esta porción de la grabación de la línea de base original .
Antes de comenzar este procedimiento, hay que asegurarse de que los tubos de intubación, así como los tubos de perfusión, tanto para la craneotomía y las configuraciones de electrofisiología sonlibre de burbujas. Si las burbujas no recogen, se pueden ejecutar fuera del sistema abriendo la llave de paso y permitiendo que una parte del agua del hábitat para ejecutar a través de. Si esto no elimina el problema, una pequeña jeringa puede estar unido al extremo del tubo, donde se coloca la cánula, y la luz de succión aplicada a eliminar cualquier aire restante dentro del sistema. Por burbujas persistentes, agua hábitat puede ser forzado a través de la tubería. Además, asegúrese de que los tubos de perfusión están preparados y goteando antes de la intubación de los peces. Si / min no se obtiene un caudal de 1 ~ ml, la altura de la cabeza de presión puede ser alterado con el fin de lograr este objetivo. Esto asegurará que el pescado tiene acceso a suficiente flujo de agua. Cuando la configuración de la perfusión electrofisiología está configurado con numerosos tubos en serie, se determinó que tomó cerca de ~ 1 min para la nueva solución para ser introducido en el animal, a pesar de los cambios resultantes en la actividad neurológica registrada dependían del bein compuestog introdujo. Se aconseja que este caudal se mide antes de llevar a cabo cualquier experimento. Trabajos anteriores han demostrado que tricaína puede atenuar la actividad neuronal, pidiendo que sea retirado del sistema con el fin de obtener registros precisos 27,28. A través del trabajo anterior, se determinó que se requiere un período de 45 a 60 min de la intubación con agua hábitat para vaciar este tricaína y para la actividad neuronal para alcanzar niveles nativas. Del mismo modo, lavado de pentilentetrazol también se llevó a cabo, y se determinó que era necesario un período de 20 min para volver la actividad neuronal a los niveles basales. Por lo tanto, los experimentadores deben completar los ensayos para determinar los tiempos de lavado para cada compuesto de interés de ser introducido en el sistema.
Esta técnica requiere un poco de práctica. Al realizar la craneotomía, un cuidado especial se debe tomar para asegurarse de que una pequeña región de la placa ósea que cubre la cabeza puede ser perforado y se retira sin dañarel cerebro. Esto se puede hacer mediante la introducción de las tijeras vanna en un ángulo agudo con respecto a la cabeza. El área de hueso que cubre el techo óptico tiene fusiones cerca del centro que son débiles y que sirven como buenos puntos de entrada para las tijeras. Una vez que un pequeño descanso se ha realizado dentro de la placa, utilice unas tijeras para recortar un área pequeña de la médula, y retirar con un par de pinzas finas. Los peces más jóvenes tienen a menudo más suaves, más flexibles cráneos, por lo que los peces que son de 1 año de edad o menos se sugieren para su uso, mientras que el aprendizaje de esta técnica. Ocasionalmente, la sangre comenzará a acumularse alrededor de la región de la craneotomía, pero esto se puede quitar frotando un Kimwipe suavemente alrededor de la zona. Con este procedimiento, la craneotomía es muy pequeña, siendo de 2 mm en la zona 2. Debido a este pequeño tamaño, no se ha producido la desecación de la región craneal. Sin embargo, si la craneotomía es más grande en tamaño, es posible aplicar agar o algún otro material para evitar la pérdida de humedad desde el cerebro si esto se convierte en un Problema.
Un punto de interés es el uso de bromuro de pancuronio. Este producto químico se almacena en alícuotas de 10 l con el fin de evitar la congelación y descongelación repetitivo. El volumen sugerido para ser usado en un experimento, siendo 1 l por gramo de peso, es generalmente suficiente para inmovilizar a un peces adultos. En ocasiones, sin embargo, este volumen no es la adecuada. Cuando esto se produce y no se obtiene la parálisis, más bromuro de pancuronio puede ser administrado por vía intraperitoneal a los peces, siempre y cuando no se ha iniciado la grabación. Al llevar a cabo la inyección, no intente inyectarse a través de las escalas laterales duras; inyectar el pescado en la región del abdomen blando, cerca de la ventilación. Si el pescado comienza a moverse una vez que el electrodo primario se ha posicionado, hay una buena probabilidad de que la aguja se ha roto dentro de la craneotomía, y el procedimiento debe ser repetido utilizando un nuevo animal. A través de este trabajo, se ha determinado que el bromuro de pancuronio puede reducir la neuronal registradaactividad en larvas de pez cebra (≤ 50% de la amplitud de la línea de base) y se supone que lo mismo es cierto para los adultos. Sin embargo, en la experiencia reciente, la actividad neural en un adulto es lo suficientemente robusta que cualquier efecto de amortiguación atribuidas al bromuro de pancuronio no parecen afectar negativamente a la capacidad de recopilar y analizar los datos. En contraste, factores de confusión asociadas con el movimiento pueden ser significativos. Para este procedimiento, los beneficios de la completa inmovilidad del animal es de valor más allá de esta limitación y los cambios neuronales que se introducen son lo suficientemente robusta como para persistir más allá de los efectos de las vibraciones. Además, cualquier movimiento del animal puede desplazar el electrodo, se registrará por el aparato de la electrofisiología y posiblemente poner en peligro a los animales.
Las limitaciones de esta técnica se encuentran principalmente en el hecho de que la grabación extracelular es la única forma posible de grabación de la actividad neurológica en el pez cebra adulto intacto. Al colocar la prima electrodo RY, la aguja debe insertarse en la craneotomía, la prevención de uno de ver exactamente donde se va a colocar el electrodo. Aunque, con la práctica, es posible posicionar el electrodo dentro de la misma región y a la misma profundidad constante.
En la electrofisiología vivo en gran parte se ha limitado a las larvas de pez cebra. Esto es debido a la capacidad de inmovilizar fácilmente el pescado pequeño y el hecho de que no requieren la intubación. Por lo tanto, los estudios electrofisiológicos se han centrado en las etapas de larva y se ha hecho poco en cuanto a la actividad electrofisiológica del cerebro adulto. Esto ha impedido que las comparaciones entre los menores y la actividad neurológica de adultos que se harán. El uso del sistema de intubación multitubular permite una fácil introducción de una variedad de compuestos a los peces. Esto también permite los efectos de diferentes productos químicos o medicamentos para ser estudiadas en ambos los sistemas de larvas y adultos.
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Figura 1. Intubación cánula. Retire una sección de 1,5 cm desde el extremo ancho de una punta amarilla P-200 pipetteman (A). Inserte una pieza de 6 mm x 1 cm de tubo (flecha) en un bloqueo Luer reducir conector (B) e inserte esta cánula en la punta de la pipeta modificado. Sostenga la punta de la pipeta en posición con el bloqueo Luer utilizando una porción corta de ⅛ en tubo (C).
Figura 2. Terminado configuración base de la intubación. Una vez que la cera del Golfo se ha enfriado, coloque la configuración de la cánula en el orificio más pequeño del intbase de ubation (A). Gire un 1 en toda la franja de 42 cm Kimwipe en un espiral apretado y la inserta en el tubo de drenaje de forma que el Kimwipe extiende en ambos extremos. Inserte un extremo del tubo de drenaje en el orificio grande de la placa de Petri (B), permitiendo que el extremo inferior de ampliar en un 30 mm x 100 mm cristalizar plato (no a la vista). Coloque el tejido de manera que un extremo se encuentran cerca de la zona del estómago del animal (se indica con la línea discontinua-negro) y la extensión inferior puede gotear en el plato.
Figura 3. Craneotomía. Bajo el microscopio de disección, utilice tijeras de primavera vanna para eliminar ~ 2 mm 2 sección del cráneo que cubre el techo óptico. Esta zona se ve como una placa ósea oscuro, trapezoidal que ssu detrás del ojo. El círculo punteado demarca donde se coloca la craneotomía. La punta de flecha muestra que la aguja del electrodo primario está situado dentro del agujero de la craneotomía. El electrodo primario se compone de un 2,5 en la sección de 0,010 en alambre de plata que se ha electrodepositado con los iones de cloruro y se inserta en una aguja capilar de borosilicato. La aguja capilar se llena con 2-3 l de 2 M de cloruro de potasio, o lo suficiente para cubrir parcialmente la punta cloruro recubierto de alambre de plata. El electrodo secundario consiste en un 15 en la sección de la misma alambre utilizado para el electrodo primario excepto que una punta se suelda en un extremo, permitiendo que se inserta en la parte posterior de la etapa de la cabeza. El extremo del cable secundario que se va a colocar tocar el pescado también debe ser electrochapado con iones cloruro. La flecha muestra donde el electrodo secundario ha sido colocado dentro de la fosa nasal derecha del peces adultos.
Figura 4. Configuración de colección de la actividad electrofisiológica. La configuración de la intubación intacta se mueve a la microscopio electrofisiología y la cánula está conectado al sistema de perfusión (A). El agua del sistema debe estar encendido, lo que permite la perfusión para empezar de inmediato. Usando el micromanipulador, posicionar el electrodo secundario (B) de manera que la punta del electrodo se inserta en la fosa nasal del animal o en el baño detrás de la mandíbula superior (flecha). Insertar la aguja de electrodo primario (C) en la abertura de la craneotomía. Insertar la aguja de tal manera que se posiciona bastante superficial en el techo óptico. El tubo de drenaje grande (D) se extiende desde el plato de la intubación, fuera del campo de visión, y el otro extremo se vacía en tél plato de colección.
Figura 5. Los registros electrofisiológicos en el techo óptico. (A) Se observó consistentemente que la actividad nativa dentro del techo óptico del pez cebra adulto es estereotipada espontánea, mostrando amplitud pequeña (2-10 mV) la actividad en toda la duración de la grabación. (B) A raíz de la introducción de 15 mM PTZ al sistema, las descargas epileptiformes-como espontáneos comenzaron a desarrollarse alrededor de 5 minutos después de la introducción. Esta actividad fue inicialmente breve, pequeña amplitud. Con la exposición continuada a la PTZ, un cuadro persistente de gran amplitud (hasta 15 mV) descargas desarrollados que fueron seguidos por más pequeñas y más frecuentes estallidos de actividad.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH / NINDS subvención R01NS070159 (a TMD, JDL y ATS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
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