Summary
يمكن أن يتسبب الإنتان التجريبية في الفئران باستخدام ربط الأعور وثقب (CLP) الأسلوب. يتم عرض البروتوكولات الحالية لتقييم الالتهام الذاتي في الجسم الحي في سياق الإنتان CLP التي يسببها هنا: بروتوكول لقياس الالتهام الذاتي باستخدام الفئران (GFP) LC3، وبروتوكول لقياس تشكيل جسيم بلعمي ذاتي بواسطة المجهر الإلكتروني.
Abstract
يمكن أن يتسبب الإنتان التجريبية في الفئران باستخدام ربط الأعور وثقب (CLP) الأسلوب، الذي يسبب تعفن الدم متعدد المكروبات. هنا، يتم توفير بروتوكول للحث على الإنتان متفاوتة الخطورة في الفئران باستخدام تقنية CLP. الالتهام الذاتي هو استجابة الأنسجة للإجهاد الأساسية وغزو الممرض. وتعرض اثنين من البروتوكولات الحالية لتقييم الالتهام الذاتي في الجسم الحي في سياق الإنتان التجريبية أيضا هنا. (I) يتعرضون الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتين البروتين مضان أخضر (GFP) LC3 الانصهار لCLP. تعزيز المترجمة من إشارة GFP (نقاط و)، ويعاير إما عن طريق المقايسات المناعية أو متحد البؤر، ويمكن استخدامها للكشف عن تشكيل جسيم بلعمي ذاتي معزز، وبالتالي، وتفعيل غيرت من مسار الالتهام الذاتي. (II) تعزيز فجوة ذاتية البلعمة (جسيم بلعمي ذاتي) تشكيل الأنسجة في منطقة حدة (كعلامة من التحفيز الالتهام الذاتي) يمكن قياسها كميا باستخدام المجهر الإلكتروني. دراسة الاستجابات ذاتية البلعمة لهو تسمم شركات حرجةonent من فهم الآليات التي الأنسجة الاستجابة للعدوى. نتائج البحوث في هذا المجال يمكن أن تسهم في نهاية المطاف نحو فهم الآلية المرضية للتسمم، وهو ما يمثل مشكلة كبيرة في مجال الطب والرعاية الحرجة.
Introduction
الإنتان، والاستجابة الالتهابية الجهازية للإصابة، يمثل السبب الرئيسي للوفاة في مرضى حاسمة من سوء 1. التهابات داخل البطن، وغالبا ما يؤدي إلى تعفن الدم متعدد المكروبات، تمثل 20٪ من حالات الإنتان، والتي لها معدل وفيات كبيرة تصل إلى 60٪ 2. الوفيات المرتبطة الإنتان النتائج في المقام الأول من اختلال وظيفي متعدد الجهاز مع فشل الجهاز اللاحقة 3،4. وهناك حاجة للمزيد من التحقيق في آلية المسببة للأمراض من هذا المرض على وجه السرعة لتعزيز تطوير علاجات جديدة وأكثر فعالية.
أسلوب ربط الأعور وثقب (CLP) هو إجراء يستخدم بشكل شائع لنمذجة الإنتان في الجسم الحي. كما الأعور هو الكامل من البكتيريا، نتائج ثقب في التهاب الصفاق متعدد المكروبات، إزفاء من البكتيريا في الدم (تجرثم الدم)، الصدمة الإنتانية، اختلال وظيفي متعدد الجهاز، وفي نهاية المطاف، والموت 5. ومن المسلم به عموما أن CLP يعكس السريريةالواقع أكثر دقة من التقنيات السابقة، مثل حقن الذيفان الداخلي أو البكتيريا حتى المنقى في القوارض، وهكذا، تعتبر CLP معيار الذهب (وإن كان لا يخلو من قيود) 6 لتحريض التجريبية، وبالتالي، والتحقيق في التسبب في التسمم. في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكولات مصممة لتقييم ما إذا كانت آليات المسببة للأمراض الإنتان تشمل الالتهام الذاتي.
الالتهام الذاتي، عملية الحفظ تطويريا الخلوية، ويسهل دوران من البروتينات والعضيات مثل الميتوكوندريا التالفة ويلعب دورا هاما في إزالة مسببات الأمراض بما في ذلك البكتيريا داخل الخلايا 7،8. خلال الالتهام الذاتي، التي تحتجز البروتينات عصاري خلوي أو العضيات في حويصلات غشاء محدد مزدوجة دعا autophagosomes، والتي يتم تسليمها لاحقا إلى الجسيمات الحالة لتدهور 9. وقد تم تحديد عدد من البروتينات مثل المتماثلات الثدييات من الجينات المرتبطة الالتهام الذاتي (ATG)،حددت أصلا في الخميرة، التي تنظم عملية الالتهام الذاتي. تحويل أنيبيب المرتبطة البروتين 1 سلسلة ضوء 3B (LC3B) (نديد من Atg8) من-I LC3B (شكل حر) لLC3B-II (شكل فسفاتيديل مترافق) يمثل خطوة رئيسية في تشكيل جسيم بلعمي ذاتي 9. ويرتبط ضعف ذاتية البلعمة مع الشيخوخة والأمراض التي تصيب الإنسان بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية 10. علاوة على ذلك، الالتهام الذاتي يؤثر على المناعة الفطرية والتكيفية مثل العرض مستضد والتنمية اللمفاويات وإفراز السيتوكينات من الخلايا المناعية 8. وبالتالي، فإنه يبدو من المعقول أن الالتهام الذاتي قد تلعب أيضا دورا في الاستجابة الالتهابية الجهازية للإصابة (أي في الإنتان).
حتى هذا التاريخ وقد وصفت عدة طرق لتقييم دور الالتهام الذاتي إلى إصابة نسيج في الجسم الحي. وتشمل هذه استخدام البروتين مخضر (GFP) LC3 الفئران التعبير عن والقياس الكمي لصناعة السياراتphagosomes في الأنسجة بواسطة المجهر الإلكتروني (موصوفة هاتين الطريقتين في هذه الدراسة). وتشمل وسائل إضافية لتقدير حجم ذاتية البلعمة التعبير البروتين في الخليط الأنسجة، وتحليل تدفق ذاتية البلعمة (كما هو موضح في مكان آخر) 11-13. الهدف من هذا الاستعراض هو تقديم البروتوكولات الحالية لتقييم الالتهام الذاتي في الجسم الحي في سياق الإنتان التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: وافقت اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام في بريغهام ومستشفى / المنطقة هارفارد كلية الطب المرأة الإجراءات التالية.
1. الأعور ربط والبزل
استخدام الفئران من نفس الخلفية (C57BL / 6)، الذكور، 8-10 أسابيع. الفئران الإناث أكثر من الذكور مقاومة ضد الإنتان الناجم عن الفتك. الفئران الأكبر سنا من 8 أسابيع تحقيق نتائج أقل تغيرا من الفئران الأصغر من حيث البقاء على قيد الحياة بعد CLP. حوالي N = 10 لكل مجموعة الفئران مقارنة ينبغي أن تستخدم لتحليل البقاء على قيد الحياة. N = 3-5 الفئران غير كافية لفحوصات الالتهام الذاتي.
- استخدام الأدوات المعقمة الجراحية الصغيرة (وهي مشرط، مقص وملقط التشريحية حادة)، والتي ينبغي أن تكون مناسبة لعملية جراحية القوارض.
- إعداد خليط التخدير: ل7.95 مل من برنامج تلفزيوني إضافة 150 ميكرولتر من زيلازين (AnaSed حقن 100 ملغ / مل) و 700 ميكرولتر من الكيتامين (Ketaset CIII، 100 ملغ / مل).
- لضمان ظروف معقمة أثناء العملية، وارتداء قفازات وقناع الوجه وثوب الجراحية.
- وزن الحيوانات. تخدير لهم عن طريق حقن intraperitonally (IP) خليط المذكورة في الخطوة 3 في جرعة من ميكرولتر (10X وزن الجسم في ز). على سبيل المثال، للماوس وزنها 22 غرام، إدارة 10x22 = 220 ميكرولتر من خليط التخدير. وبالتالي، فإن الجرعات النهائية من الكيتامين زيلازين وهي 17 و 80 ملغم / كغم من وزن الجسم، على التوالي. ضمان تخدير كافية، وينبغي أن تنتج أي انثناء من أقصى بعد قرصة أخمص قدميه ملاحظة: استخدام مرهم للعين على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- وضع الحيوانات على سطح العمل نظيفة على ظهورهم. موجهة ذيول والكفوف الخلفيتين نحو المحقق. تطهير الجلد في البطن استخدام الكحول (70٪ محلول ETOH) ملاحظة:. منطقة الجراحية وينبغي حليق تماما، لتجنب تلوث الجرح من خلال الاتصال معالفراء. أيضا، على النحو الأمثل، يجب استخدام وسادة تعميم الماء الدافئ للحفاظ على سوائية الحرارة من الفئران تخدير خلال الجراحة.
- باستخدام مشرط، وجعل شق الجلد طولية موازية الصغيرة وترك حوالي 1 سم إلى خط الوسط. لا تخترق حتى الآن في التجويف البريتوني. استخدام مقص صغير لتوسيع شق الأولي.
- تحديد عضلات البطن وتشريح لهم للوصول الى التجويف البريتوني.
- باستخدام ملقط التشريحية حادة، وتحديد الأعور وتحريكه من التجويف البريتوني. يجب الحرص على عدم تلف الأوعية الدموية المساريقية (وهذا يمكن أن يؤدي إلى نزيف قاتلة).
- Ligate 60٪ من الأعور لتحقيق الإنتان منتصف الصف. Ligating يساوي أو أكثر من 75٪ من الأعور النتائج عموما في الدرجة العالية الإنتان، في حين ligating يساوي أو أقل من 25٪ من النتائج الأعور في انخفاض درجة التعفن. يجب الحرص على عدم ligate صمام اللفائفية (وهذا يمكن منع استمرارية المعوية).
- باستخدام21 G إبرة، خرم الأعور من جانب واحد من خلال وعبر ثقب (اثنين من الثقوب) بالقرب من ربط. يجب أن يكون اتجاه انثقاب من المساريقي إلى الجانب المضادة للالمساريقي من الأعور. يجب الحرص على عدم ثقب الأوعية الدموية المساريقية.
- إزالة الإبرة. الضغط بلطف الأعور ligated لتأكيد المباح من خلال اثنين من الثقوب، وينبغي مقذوف سوى كمية صغيرة من البراز من خلالهم.
- نقل الأعور ligated وثقب في التجويف البريتوني.
ملاحظة: للحصول على الفئران صورية، تخطي الخطوات 1،10-1،12. - استخدام خيوط الجراحة الحرير 6-0 مع قطع الإبرة لإغلاق الجهاز العضلي في البطن. استخدام خيوط الجراحة الحرير 6-0 مع قطع الإبرة لإغلاق الجلد في منطقة البطن.
- حقن 1 مل prewarmed (37 درجة مئوية) طبيعية الملكية الفكرية المالحة لاستبدال الحرارة والماء المفقود خلال العملية. وضع الفئران تحت مصباح الحرارة حتى الإنعاش بهم ملاحظة: على النحو الأمثل، جهاز الاحترار أكثر أمانا (سوالفصل بمثابة وسادة تعميم الماء الدافئ) يمكن استخدامها بدلا من مصباح الحرارة.
- بعد العمل الجراحي حقن buprenorphin (0.05 مغ / كغ من وزن الجسم الشوري.) لتحقيق تسكين ملاحظة: يجب عدم ترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنها كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. لا ينبغي أن تعاد حيوان الذي قد خضعت لعلاج جراحي للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
- وضع الحيوانات في أقفاصها مرة أخرى مع الوصول غير المحدود إلى الغذاء والماء. وسوف يتم التخلص الفئران عندما تصبح المحتضرة (المشار إليها بواسطة علامات سريرية مثل الفشل في التحرك عند لمسها أو زرقة). تحقق الفئران كل ساعة 4 لتجنب الاضطرار منهم يموتون قبل القتل الرحيم.
2. الأنسجة الحصاد والتثبيت
- يعد حل بارافورمالدهيد 4٪ (PFA): ل889 مل PBS إضافة 111 مل من 37٪ PFA.
- التضحية الفئران باستخدام إما الخدر CO 2 التي يسببها أو الكيتامين / زيلازين قolution في جرعة عالية.
- لشل حركة الفئران على سطح العمل نظيفة. رش الجلد في البطن والصدر مع 70٪ محلول لتطهير ETOH ذلك.
- استخدام مشرط ومقص صغير لإزالة البطن والجلد والصدر وكذلك الجلد الذي يغطي منطقة القصبة الهوائية.
- تكشف القصبة الهوائية عن طريق إزالة الأنسجة التي تحيط به (العضلات والنسيج الضام).
- وضع خياطة (دون قطع إبرة) حول القصبة الهوائية. لا تشديد عليه حتى الآن.
- استخدام القسطرة الوريدية الطرفية الصغيرة (20 G) إلى "التنبيب" القصبة الهوائية. كن حذرا خلال الإدراج القسطرة لتجنب القصبة الهوائية المسيل للدموع. نلاحظ أن أكبر قطر القصبة الهوائية هو أقل بقليل من الغضروف الحلقي.
- تشديد خياطة حول القصبة الهوائية / القسطرة. إزالة الإبرة ولم يتبق سوى قنية بلاستيكية للقسطرة في القصبة الهوائية. إبرة خدم فقط كدليل سلك لإدخال قنية البلاستيك.
- بعد أن يكون قد ضمن قنية بلاستيكية في القصبة الهوائية، وقطع اله عضلات البطن، وفتح البطن وتكشف الحجاب الحاجز.
- باستخدام إبرة، ثقب في الحجاب الحاجز لإنتاج استرواح الصدر (أي إدخال الهواء إلى التجويف الجنبي). وينبغي بعد ذلك انهار الرئتين.
- باستخدام مقص صغير، وإزالة الحجاب الحاجز، وقطع على طول القص (القص)، وإزالة القفص الصدري وتكشف عن القلب والرئتين.
- من خلال قنية بلاستيكية يتم إدخالها الى القصبة الهوائية، إصلاح الرئتين مع الحل الفورمالديهايد تقل أعمارهم عن 30 سم H 2 O الضغط.
- إزالة الرئتين ووضعها في PFA 4٪ لمدة 24 ساعة وبعد ذلك في 70٪ من محلول ETOH حتى المعالجة.
- تحديد وإزالة القلب والكبد والكلى. في نفس الطريق، ووضعها في PFA 4٪ لمدة 24 ساعة وبعد ذلك في 70٪ من محلول ETOH حتى المعالجة.
3. الفئران GFP وعرض الشرائح GFP
- أداء CLP وجراحة صورية على الفئران GFP-LC3 كما هو موضح في الخطوة 1، والإجراء بعد العملية الجراحيةو كما هو موضح في الخطوة 2 من البروتوكول.
- تضمين الأنسجة (وهي الرئتين والقلب والكبد والكلى) في البارافين وقطع منها في المسلسل 5 ميكرون أقسام.
- عندما تكون جاهزا لتلطيخ GFP، احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة حتى يذوب البارافين والأنسجة تظهر شفافة.
- Deparaffinize مع سلسلة متدرجة من مستوى الزيلين الزيلين أو بدائل، 5 دقائق الزيلين 1، 2 الزيلين، والزيلين 3 ثم 3 دقائق حضانات في سلسلة متدرجة من ETOH: 100٪، 95٪، 75٪، ثم شطف في الماء المقطر.
ملاحظة: بعد deparaffinization تجنب جفاف الأنسجة، مما يزيد خلفية العينة. - أداء استرجاع مستضد باستخدام حمض الستريك العازلة (10 ملي حمض سترات الصوديوم، 0.05٪ توين 20، ودرجة الحموضة 6.0)، عن طريق الميكروويف لمدة 10-20 دقيقة. كن حذرا لاستبدال العازلة بشكل دوري لتجنب جفاف الأنسجة.
- يسمح حل لتبرد لمدة 20 دقيقة على مقاعد البدلاء لاستكمال استرجاع مستضد.
- يغسل 2-3X مع برنامج تلفزيوني. إزالة الزائدة العازلة وهيئة تنظيم الاتصالاتnsfer الشرائح من رف لوضع أفقي في مربع الشريحة أو غرفة ترطيب أخرى لمنع جفاف.
- منع 45-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 10٪ مصل حمار عادي (5٪ أيضا ألبومين المصل البقري، أو يفضل المصل من الحيوانات التي تم إنشاؤها على الضد الثانوية) في برنامج تلفزيوني.
- احتضان العينات في الأضداد GFP الأولية في 1:100 التخفيف في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في غرفة ترطيب. تطبيق بلطف قطعة صغيرة من parafilm على النسيج مع الأجسام المضادة لتعزيز الاتصال متجانسة مع الأنسجة ومنع التبخر.
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات المتبقية في درجة حرارة الغرفة. - غسل 5X مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة الأولية الزائدة. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية 1:500-1:1،000 في برنامج تلفزيوني لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل 5X مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة. إذا رغبت في ذلك، مباين الشرائح في هذه الخطوة.
- إذا باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الفلورية، واحتضان 0.1٪ الأسود في السودان 70٪ و ETOHأو 15-20 دقيقة للحد من تألق ذاتي. تمحو الزائدة السودان أسود من جميع أنحاء أنسجة وغسل 5X مع برنامج تلفزيوني أكثر من 20 دقيقة.
- جبل عينة مع ساترة وتخزين أفقيا، حتى وضعت الحل في تصاعد مستمر.
4. بروتوكول بديل: الكشف المباشر من GFP-LC3
- يقني؛ يدخل القنية وتضخيم الرئتين مع ~ 500 مل 50/50 ت / ت PBS أكتوبر.
- تغرس في أكتوبر عن طريق وضع كمية صغيرة من أكتوبر في الجزء السفلي من cryomold.
- وضع بعناية مجمع الرئة تشريح في القالب.
- تجميد ببطء على مدى methylbutane برود باستخدام الثلج الجاف.
- إضافة المزيد من أكتوبر حتى يتم تغطية الأنسجة تماما وتجميد الصلبة. الحفاظ على الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- باستخدام cryomicrotome، وقطع 5-10 ميكرون أبواب سميكة حماية أقسام من الضوء. متجر الأقسام والأنسجة المتبقية في -80 درجة مئوية.
- لإعداد الشرائح التصوير، وإزالة قسم من الفريزر وتطبق على الفور قطرة من برنامج تلفزيوني لمنع جفاف.
- إصلاح لمدة 30 دقيقة مع PFA 4٪. يغسل مع برنامج تلفزيوني.
- تطبيق دابي / Hoescht لمدة 10 دقيقة. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
- جبل عينة مع ساترة وتخزين أفقيا، حتى وضعت الحل في تصاعد مستمر.
- الصورة باستخدام المجهر epifluorescence أو متحد البؤر. مخزن العينات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
5. إعداد الأنسجة المجهري للإلكترون
- قطع الأنسجة إلى حوالي 1 مم مكعبات لتحديد.
- إصلاح الأنسجة في 2٪ الفورمالديهايد، 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.1 العازلة M كاكوديلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4.
- تغسل مع 0.1 M العازلة كاكوديلات الصوديوم لمدة 1-2 ساعة.
ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة الثابتة في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم في 4 درجات مئوية. - أضف الإصلاح في 1٪ في رباعي أكسيد الأوزميوم 0.2 M الصوديوم العازلة كاكوديلات لمدة 1 ساعة.
- شطف في 0.2 M الصوديوم العازلة كاكوديلات لمدة 10 دقيقة 3X.
- يذوى في 70٪ ETOH، 20 دقيقة 2X. يذوى في 90٪ ETOH، 10 دقيقة 2X. يذوى في 100٪ ETOH،20 دقيقة 2X.
- احتضان مع أكسيد البروبيلين (الايبوكسي البروبان) لمدة 10 دقيقة 2X.
- احتضان مع أكسيد البروبيلين / الايبوكسي خليط الراتنج (50:50) لمدة 1 ساعة. خليط راتنجات الايبوكسي هو: 24 ز آجار 100 الراتنج، 13 ز أنهيدريد dodecenylsuccinic، 13 ز أنهيدريد methylnadic و 1 مل N-benzyldimethylamine. تخلط جيدا في كوب المتاح باستخدام ملعقة خشبية.
- احتضان مع الإيبوكسي بين عشية وضحاها في قارورة لم يسبق لهم اللعب (وهذا يسمح أي أكسيد البروبيلين المتبقية لتتبخر).
- تغرس في كبسولات المسمى مع الطازجة الراتنج. تتبلمر عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- أقسام الأنسجة صورة باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ في 80 أو 60 كيلو فولت على الفيلم المجهر الالكتروني. طباعة الصور على ورق التصوير أو تخزين الوسائط الرقمية كما.
- تحليل تكوين جسيم بلعمي ذاتي في الخلايا التي تحتوي على نواة سليمة. حقول طاقة منخفضة (ه. ز. 2،000-4،000 X) يمكن استخدامها لتحديد الخلايا الأنوية. وعادة ما تستخدم 6،800-10،000 X صور عن الهو الكمي جسيم بلعمي ذاتي. عد autophagosomes في وحدة المساحة 15-30 الحقول لتمثيل الإحصائية المناسبة. Autophagosomes ديها بنية غشاء مزدوج، حيث تشبه autophogosomes مرحلة متأخرة فجوات شغلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تجرثم الدم موجود في الفئران في وقت مبكر 6 ساعة بعد CLP التي يسببها تسمم 14. تظهر العلامات السريرية للتسمم (بما في ذلك قشعريرة، تسرع التنفس وضعف النشاط الحركي) حوالي 12 ساعة بعد العملية. تعرض الفئران لCLP تبدأ في الموت عند حوالي 18 في الساعة بعد تحريض التهاب الصفاق. وأكثر شدة الإنتان هو أكثر هو زيادة الفتك 15 في التفاصيل، والدرجة العالية الإنتان يسبب وفيات 100٪ في غضون 2-3 أيام، في حين أن نتائج الإنتان منتصف الصف في معدل وفيات حوالي 60٪ في 7 أيام بعد CLP (ما وراء هذا الحد الزمني، أي حالة وفاة من المتوقع) (الشكل 1). في المقابل، ينبغي أن يكون معدل وفيات الفئران صورية الصفر
الشكل 1. منحنيات البقاء على قيد الحياة بعد CLP من شدة مختلفة في الفئران. وتعرض C57BL / 6 الفئران إلى الشام الجراحة أو الإنتان CLP التي يسببها من شدة مختلفة عن طريق ضبط ربط حفظ مستمر عدد الثقوب إلى الأعور (أي 1 "من خلال وعبر 'ثقب (اثنين من الثقوب) مع 21 G إبرة ). ربط 60٪ من النتائج الأعور في الإنتان منتصف الصف، الأمر الذي يؤدي إلى وفيات حوالي 60٪ في 7 أيام بعد CLP. ربط من ≥ 75٪ من النتائج الأعور في الدرجة العالية الإنتان، وبعد ذلك في وفيات 100٪ في غضون 2-3 أيام بعد CLP، في حين، من ربط ≤ 25٪ من الأعور يؤدي في انخفاض درجة التعفن، وبالتالي، في وفيات ما يقرب من الصفر. وأظهرت النتائج بقاء نموذجية.
لأغراض الدراسات الالتهام الذاتي، اخترنا لتنفيذ نموذج CLP من منتصف الصف الإنتان. انخفاض درجة التعفن قد لا تكون كافية للحث على الالتهام الذاتي، في حين أن عالية الجودة الإنتان قد يؤدي إلى الفتك في وقت مبكر من الفئران (قبل تحريض الالتهام الذاتي).
ve_content "> للمعايرة الالتهام الذاتي، وقد استخدمنا الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتين GFP-LC3 الانصهار تخضع لبروتوكولات الإنتان المذكورة آنفا. للحصول على إجراءات العلاج التي تؤدي إلى تحفيز مسار الالتهام الذاتي، ومن المتوقع أن يتم تعزيز المترجمة هناك إشارة GFP ( نقاط و)، ويعاير إما عن طريق المقايسات المناعية أو متحد البؤر، مما يدل على تعزيز تشكيل جسيم بلعمي ذاتي 16.
الشكل 2. التصوير GFP في المجراة في المختبر. (A، B) مثال ممثل التصوير GFP في أجهزة الماوس (مثل الكلى) المتحصل عليها من الفئران GFP-LC3B. صورة يظهر نقاط وGFP-LC3 في كبيبات الكلى من الأنسجة التي تم الحصول عليها من الفئران غير المعالجة. أشرطة النطاق = 10 مم. ( C، D) يتم توفير بيانات إضافية لتوضيح في المختبر GFP-LC3 التصوير. تم عزل الخلايا الأولية مسراق الكبيبة من GFP-LC3 الفئران المعدلة وراثيا باستخدام بروتوكول لعزل الخلايا من الفئران المعدلة وراثيا كما هو موضح سابقا. وحضنت الخلايا 17 في غياب (C) أو وجود (D) من TGF-β1 (2 نانوغرام / مل) لمدة 24 ساعة كما سبق وصفه 18. المعاملة مع TGF-β1 زيادة وفرة autophagosomes (نقاط والأخضر). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
هذا يمكن اختبار المزيد من خلال تحليل التركيبية الكلاسيكية باستخدام المجهر الإلكتروني، كما هو مبين في البروتوكول. ومن المتوقع أن أقسام الأنسجة التي تم الحصول عليها من الفئران الصرف الصحي أو غيرها من نماذج إصابة الأنسجة من شأنها أن تظهر فجوة ذاتية البلعمة تعزيز (جسيم بلعمي ذاتي) تشكيل الأنسجة في منطقة حدة.
e_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
الرقم 3. المجهر الإلكتروني لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي. A صورة مجهرية ممثل المبكر وتشكيل جسيم بلعمي ذاتي وقت متأخر من مرحلة في أنسجة الرئة أخذت من C57BL / 6 الفئران تعرض لمنتصف الصف CLP (60٪ الربط، 21 G، 2 فتحات). autophagosomes المرحلة Εarly يكون لها هيكل مزدوج غشاء (السهم)، في حين autophagosomes مرحلة متأخرة تشبه فجوة شغل (رأس السهم). M يدل على الميتوكوندريا. شريط النطاق = 1 ميكرون. يظهر صورة ممثل السيطرة أنسجة الرئة من C57BL / 6 الفئران تعرض لعملية صورية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والميزة الرئيسية لCLP هو أنه يسمح للباحثين لتحقيق الإنتان من بالقسوة مختلفة (أي من منخفضة إلى متوسطة وعالية الجودة). يتأثر شدة الإنتان الناجم عن طول الأعور ligated (التي هي المحدد الأهم)، وحجم الإبرة المستخدمة للثقب وعدد من الثقوب يؤديها 15. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للسلالة الماوس والمساواة بين الجنسين تؤثر على شدة الإنتان؛ عدة سلالات أكثر عرضة من غيرها، والذكور هم عموما أكثر عرضة من الإناث 19،20. العوامل المذكورة أعلاه مجتمعة تحديد وفيات CLP التي يسببها.
بناء على خبرتنا، وهناك فرق بين المحققين فيما يتعلق حققت فيات التي يسببها CLP. فعلى سبيل المثال، Rittirsch آخرون استخدام ربط 50٪، 21 G، 1 'من خلال وعبر' ثقب (اثنين من الثقوب) لتحقيق معدل الوفيات 60٪ 15؛ محقق في حاجتنا مجموعة أبحاثإد لاستخدام نموذج قليلا أكثر شدة (60٪ الربط، 21 G، 1 'من خلال وعبر' ثقب) للحصول على نفس معدلات الوفيات، في حين، محقق آخر في فريق البحث لدينا تستخدم نموذجا أكثر شدة (قرب 100٪ ربط ، 19 G، 1 'من خلال وعبر' ثقب) لتحقيق معدل وفيات أقل من ذلك بكثير (25٪ فقط). مع الاعتبارات المذكورة أعلاه في الاعتبار، يمكن القول أن توصيف شدة CLP (الإنتان أي المنخفضة، في منتصف أو عالية الجودة) وينبغي أن يتم بأثر رجعي (أي من خلال النظر في وفيات الناتج) وليس بأثر رجعي (أي من خلال تطبيق ظروف معينة، على سبيل المثال 50٪ ربط). عندما يحقق المشغل وفيات حوالي 60٪، ثم، وهذا هو منتصف الصف الإنتان، بغض النظر عن الظروف التي تنفذ (مثل طول الأعور ligated وتنفيذ عدد من الثقوب). وبالتالي، فإنه يبدو من المعقول أن المشغل محاولة ظروف مختلفة لتحديد تلك التي بموجبها 60٪ من الفئران يموت. ثم، المشغللديه لتنفيذ بالضبط نفس الظروف في كلا المجموعتين يجري مقارنة.
من خلال تنفيذ بالضبط نفس الظروف (مثل طول الأعور ligated، وحجم الإبرة المستخدمة للثقب، تنفيذ عدد من الثقوب، وسلالة الماوس، والجنس)، فمن المتوقع أن نتائج متسقة وقابلة للتكرار وسيتم إنتاج 15. ومع ذلك، وحتى بعد أداء CLP بطريقة موحدة (مع الأخذ في الاعتبار المحددات أعلاه)، قد تحدث تقلبات. وقد تم الاعتراف من قبل الخبراء أن 'حتى عندما يتم إعطاء الشتائم مماثلة لمجموعات من الحيوانات تتراوح أعمارهم مماثل - حتى من نفس القمامة - ويمكن رؤية تأثير الفرد المتغير' 6. وهكذا، في محاولة للحد من التقلبات، فإنه يبدو من المعقول أن المشغل أداء CLP في كلا المجموعتين مقارنة في نفس اليوم.
تحليل الالتهام الذاتي، وهي عملية ديناميكية الخلوية، معقد. البروتوكولات المحددة في هذا monograفتاه توفير أساس لتقدير تفعيل الالتهام الذاتي في الجسم الحي، استنادا إلى تحليل الكيمياء الحيوية أو المورفولوجية لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي. من حيث المبدأ، والبروتوكولات المنصوص عليها في هذا الفصل يمكن تطبيقها على تحليل الالتهام الذاتي في أي نوع من الأنسجة في الجهاز الفئران تعرض لCLP أو نماذج بديلة للتسمم. في حين أن الكبد ومن المسلم به عموما أن يمثل هدفا رئيسيا من CLP، يمكن أيضا أن يسبب هذا الإجراء إصابة الرئة أو أنسجة الكلى، والتي تستحق مزيدا من الدراسة. وكان تأثير CLP على الالتهام الذاتي من خلايا الكبد مدروسة نسبيا بالمقارنة مع آثاره على الكلى أو الالتهام الذاتي من الرئة، وتمت بعض الأدلة ذات الصلة التي نشرت مؤخرا 21،22.
تجدر الإشارة إلى أن هذه هي مقاييس ثابتة من الالتهام الذاتي، وزيادة أعداد جسيم بلعمي ذاتي قد يعكس أيضا ضعف الالتهام الذاتي من خلال انسداد ظيفة الليزوزومية والتجهيز في نهاية المرحلة. في هذا الصدد، ينبغي أن تستكمل هذه المقايسات مع دكاكفحوصات كال للدوران الركيزة ذاتية البلعمة (على سبيل المثال التمويه) كما هو موضح مؤخرا وتكييفها لالمجراة يحلل 11. ويمكن أيضا أن تستكمل هذه المقايسات وفق المعايير تحليل طخة مناعية الغربية للتعبير عن البروتينات الرئيسية في الأنسجة الالتهام الذاتي كما هو موضح في الآونة الأخيرة 12،13. وبالتالي، فمن المستحسن أن الجمع بين هذه الاختبارات سيتم تنفيذها للحصول على تقدير دقيق لحالة الالتهام الذاتي في النسيج المصاب 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة إلى إعلان
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL108801 P01، R01-HL60234، R01-HL55330، R01-HL079904، إلى AMK تشوي. تلقى S. ريتر الدعم الراتب من معهد أبحاث الجهاز التنفسي لوفليس.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
References
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
- Rivers, E., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. Med, shock.N. .E. ngl.J. . 345, 1368-1377 (2001).
- Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
- Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
- Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
- Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
- Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
- Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
- Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
- Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
- Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).
