Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Слепой кишки Лигирование и прокол, вызванной Сепсис как модель для изучения аутофагии у мышей

doi: 10.3791/51066 Published: February 9, 2014

Summary

Экспериментальная сепсис могут быть вызваны у мышей с помощью слепой кишки перевязки и пункции метод (CLP). Современные протоколы для оценки аутофагию в естественных условиях в контексте CLP-индуцированного сепсиса представлены здесь: протокол для измерения аутофагию используя (GFP)-lc3 мышей и протокол для измерения образование аутофагосом с помощью электронной микроскопии.

Abstract

Экспериментальная сепсис могут быть вызваны у мышей с помощью слепой кишки перевязки и пункции метод (CLP), что приводит к полимикробная сепсис. Здесь, протокол предоставляется вызвать сепсис различной степени тяжести у мышей с использованием метода CLP. Аутофагия является ответом фундаментальная ткани к стрессу и возбудителя инвазии. Два настоящие протоколы для оценки аутофагию в естественных условиях в контексте экспериментального сепсиса также представлены здесь. (I) Трансгенные мыши, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP)-LC3 слитого белка подвергают CLP. Локализованный усиление сигнала (GFP Puncta), а анализировали либо иммуногистохимических анализов или конфокальных, могут быть использованы для обнаружения формирование расширенной аутофагосом и, таким образом, изменения активация аутофагии пути. (II) усиление аутофагической вакуоль (аутофагосом) формирование на единицу площади ткани (в качестве маркера аутофагии стимуляции) может быть определена количественно с помощью электронной микроскопии. Изучение аутофагии ответов на сепсиса является одним из важнейших получения оценочногоonent понимания механизмов, посредством которых ткани реагируют на инфекции. Результаты исследований в этой области в конечном итоге может способствовать понимания патогенеза сепсиса, который представляет собой серьезную проблему в реаниматологии.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Сепсис, системный воспалительный ответ на инфекцию, представляет собой основной причиной смерти в критически больных пациентов 1. Интраабдоминальной инфекции, часто ведущие к полимикробной сепсиса, составляют 20% от сепсиса случаях, которые имеют существенное смертность до 60% 2. Сепсис-связанная с ними смертность в первую очередь является результатом дисфункции многих органов с последующим органной недостаточности 3,4. Дополнительная расследование патогенного механизма этого заболевания необходимо в срочном порядке содействовать развитию новых и более эффективных методов лечения.

Метод слепой кишки перевязки и пункции (CLP) является широко используемым процедура моделирования сепсиса в естественных условиях. Как слепая кишка полна бактерий, ее результаты пункции в полимикробная перитонита, транслокация бактерий в кровь (бактериемия), септический шок, дисфункция полиорганной и, в конечном счете, смерть 5. Принято считать, что CLP отражает клиническийреальность более точно, чем предыдущие методы, такие как инъекции эндотоксина или даже очищенных бактерий в грызунов, таким образом, CLP считается золотым стандартом (хотя и не без ограничений) 6 для экспериментальной индукции и, следовательно, исследование патогенеза сепсиса. В этой монографии мы описываем протоколы, предназначенные для оценки патогенетические механизмы сепсиса включают ли аутофагию.

Аутофагия, эволюционно консервативными клеточный процесс, облегчает оборот поврежденных белков и органелл типа митохондрий и играет важную роль в оформлении внутриклеточных патогенов, включая бактерии 7,8. Во время аутофагии, цитозольные белки или органеллы поглощенных в двойные мембраной пузырьков, называемых Аутофагосомы, которые впоследствии доставлены в лизосомах деградации 9. Ряд белков были идентифицированы как гомологов млекопитающих генов аутофагии, связанных с (ГПТ),первоначально идентифицирован в дрожжах, регулирующих процесс аутофагии. Превращение микротрубочек связанных белков-1 легкой цепи 3В (LC3B) (гомолог Atg8) от LC3B-I (свободной форме), чтобы LC3B-II (фосфатидилэтаноламина-сопряженных форма) представляет собой важный шаг в аутофагосом образования 9. Аутофагической дисфункция связана со старением и человека заболеваний, включая рак и нейродегенеративные расстройства 10. Кроме того, аутофагии влияет врожденного и адаптивного иммунитета, таких как презентации антигена, развитие лимфоцитов и секрецию цитокинов иммунных клеток 8. Таким образом, кажется разумным, что аутофагии может также играть роль в системной воспалительной реакции на инфекцию (т.е. при сепсисе).

На сегодняшний день несколько методов были описаны для оценки роли аутофагии в повреждение тканей в естественных условиях. Они включают в себя использование зеленого флуоресцентный белок (GFP)-LC3, выражающих мышей и количественную оценку автофагосомы в ткани с помощью электронной микроскопии (эти два метода описаны в монографии). Дополнительные способы включают количественное аутофагической экспрессии белка в гомогенатах тканей, а также анализ аутофагической потока (как описано в другом месте) 11-13. Цель этого обзора является предоставление настоящие протоколы для оценки аутофагию в естественных условиях в контексте экспериментального сепсиса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Примечание: Комитет Уходу за животными и использование в Бригама и Женской больницы / Гарвардской медицинской школы Площадь утверждены следующие процедуры.

1. Слепой кишки Лигирование и Прокол

Используйте мышей того же фоне (C57BL / 6), мужчина, в возрасте 8-10 недель. Женские мыши более устойчивы, чем мужчины против индуцированной сепсисом летальности. Мыши старше 8 недель производят меньше переменных результаты, чем более молодых мышей с точки зрения выживания после CLP. Примерно N = 10 мышей в группе по сравнению должен быть использован для анализа выживаемости. N = 3-5 мышей достаточно для аутофагии анализов.

  1. Используйте стерильные небольшие хирургические инструменты (именно скальпеля, ножницы и тупые анатомические щипцы), которые должны быть уместно для хирургии грызунов.
  2. Подготовка анестезии смесь: Чтобы 7,95 мл PBS добавить 150 мкл Ксилазин (AnaSed впрыска 100 мг / мл) и 700 мкл Кетамин (Ketaset   C-III, 100 мг / мл).
  3. Для обеспечения асептических условий во время процедуры, носить перчатки, маску и хирургическое платье.
  4. Взвешивание животных. Обезболить их путем инъекции intraperitonally (IP) смесь упоминалось в шаге 3 в дозе мкл (10x массы тела в граммах). Например, для мыши весом 22 г, администрирование 10x22 = 220 мкл анестетика смеси. Таким образом, окончательные дозы ксилазина и кетамин являются 17 и 80 мг / кг массы тела соответственно. Убедитесь, что анестезия является адекватной; не сгибание конечности не должны быть извлечены после схождения щепоткой Примечание:. Используйте глазной мази на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
  5. Поместите животных на чистую рабочую поверхность на их спинах. Хвосты и задние лапы ориентированы на следователя. Лечить кожи живота употребления алкоголя (70%-ный раствор этанола). Примечание: Хирургическое область должна быть полностью бритая, чтобы не допустить загрязнения раны в результате контакта смех. Кроме того, оптимально, циркулирующий теплый подушка вода должна быть использована для поддержания нормотермию анестезированных мышей во время операции.
  6. С помощью скальпеля, сделать небольшой продольный разрез кожи параллельно и примерно на 1 см слева средней линии. Пока не проникают в брюшную полость. Используйте маленькие ножницы, чтобы продлить первоначальный разрез.
  7. Определить мышцы живота и анализировать их, получить доступ в брюшную полость.
  8. С помощью тупых анатомические щипцы, определить слепой кишки и переместить его из брюшной полости. Будьте осторожны, чтобы не повредить мезентериальных сосудов (это может привести к летальному кровоизлияния).
  9. Лигируют 60% от слепой кишки для достижения среднего класса сепсис. Лигирование равна или больше, чем 75% от слепой кишки обычно приводит к высокой степени сепсиса, тогда как лигирование, равной или менее 25% результатов слепой кишки в низкосортного сепсиса. Будьте осторожны, чтобы не перевязывать илеоцекального клапана (это может блокировать кишечной непрерывности).
  10. С помощью21 G игла, перфорации слепой кишки на один сквозной и-через прокол (два отверстия) недалеко от перевязки. Направление перфорации должно быть от брыжеечных к анти-брыжеечной стороне слепой кишки. Будьте осторожны, чтобы не проколоть мезентериальных сосудов.
  11. Удалите иглу. Осторожно выжать лигировали слепой кишки, чтобы подтвердить проходимость через два отверстия, и только небольшое количество фекалий должны быть экструдирован через них.
  12. Перемещение лигируют и проколотый слепой кишки в брюшную полость.
    Примечание: Для фиктивных мышей, пропустите шаги 1,10-1,12.
  13. Использовать шелк хирургических швов 6-0 с режущими иглу, чтобы закрыть брюшной мускулатуры. Использовать шелк хирургических швов 6-0 с режущими иглу, чтобы закрыть кожи живота.
  14. Введите 1 мл нагретого (37 ° С) физиологический раствор ИС для замены тепло и увлажнение потерял во время процедуры. Поместите мышей под инфракрасной лампой, пока их реанимации. Примечание: Оптимально, безопаснее потепление устройство (суCH в качестве циркулирующей теплой воды) площадки могут быть использованы вместо инфракрасной лампой.
  15. В послеоперационном периоде вводить buprenorphin (0,05 мг / кг массы тела подкожно). Для достижения обезболивания. Примечание: животное не следует оставлять без присмотра, пока он не пришел в достаточной сознание поддерживать грудины лежачее положение. Животное, которое претерпела хирургическое лечение не должны быть возвращены компании других животных, пока полностью выздоровел.
  16. Поместите животных обратно в их клетках с неограниченным доступом к пище и воде. Мыши будут умерщвлены, когда они становятся умирающий (обозначается клинических признаков, таких как неспособность двигаться при прикосновении или цианоз). Проверьте мышам каждые 4 ч, чтобы избежать необходимости им умереть до эвтаназии.

2. Ткань Урожай и фиксация

  1. Подготовьте 4% параформальдегида (PFA) решение: Для 889 мл PBS добавить 111 мл 37% PFA.
  2. Жертвоприношение мышей с использованием либо СО 2-индуцированный наркоз или Кетамин / Ксилазин сПовышенное в высокой дозировке.
  3. Остановите мышей на чистую рабочую поверхность. Спрей брюшной и грудной кожу 70%-ным раствором этанола его лечить.
  4. Используйте скальпель и маленькие ножницы для удаления брюшной и грудной кожу, а также кожу, охватывающую зону трахеи.
  5. Выявить трахею, удалив окружающие его ткани (мышцы и соединительной ткани).
  6. Поставьте шов (без резки иглы) вокруг трахеи. Не затягивайте его еще.
  7. С помощью небольшой периферической венозный катетер (20 г) в 'интубировать' трахеи. Будьте осторожны при введении катетера, чтобы избежать трахеи слезу. Обратите внимание, что самый большой диаметр трахеи чуть ниже перстневидного хряща.
  8. Затянуть шов вокруг трахеи / катетера. Удалите иглу оставив только пластиковой канюли катетера в трахею. Игла служил в качестве руководства проволоки для вставки пластиковую канюлю.
  9. После заручившись пластиковую канюлю в трахею, вырезать тыс.э брюшной мускулатуры, открыть живот и раскрыть диафрагму.
  10. С помощью иглы, проколоть мембрану для производства пневмоторакс (т.е. вставки воздуха в плевральную полость). Легкие должны быть рухнул.
  11. Использование маленькие ножницы, удалить диафрагму, разрезать вдоль грудины (стернотомии), удалить грудную клетку и раскрыть сердце и легкие.
  12. Через пластиковой канюли, введенной в трахею, легкие исправить с формальдегидом раствора при 30 см H 2 O давления.
  13. Удалить легкие и не размещать их в 4% PFA в течение 24 часов и затем в 70% растворе этанола до обработки.
  14. Выявление и устранение сердца, печени и почек. Таким же образом, не поместить их в 4% PFA в течение 24 ч, а затем в 70%-ном растворе EtOH до обработки.

3. GFP Мыши и просмотра GFP Слайды

  1. Выполните CLP и фиктивные операции на GFP-LC3 мышей, как описано в шаге 1, и в послеоперационном процедурыс, как описано в шаге 2 протокола.
  2. Вставить ткани (а именно легкие, сердце, печень и почки) в парафин и сократить их в серийных 5 мкм разделах.
  3. Когда готов для окрашивания GFP, инкубировать при 60 ° С в течение 30-60 мин, пока парафин плавится и ткань не появится полупрозрачный.
  4. Deparaffinize со стандартным серии градуированных ксилола или ксилола заменителей, 5 мин ксилол 1, ксилол 2, а ксилола 3 затем 3 мин инкубации в серии градуированных этанола: 100%, 95%, 75%, а затем промыть в дистиллированной воде.
    Примечание: После Депарафинирование избежать тканей высыхание, что увеличивает образец фон.
  5. Выполните извлечение антигена с помощью лимонной кислоты буфера (10 мМ цитрат натрия кислоты, 0,05% Tween 20, рН 6,0), в микроволновую печь в течение 10-20 мин. Будьте осторожны, чтобы периодически заменять буфер, чтобы избежать тканей высыхание.
  6. Разрешить решение для охлаждения в течение 20 мин на скамейке, чтобы завершить извлечение антигена.
  7. Вымойте 2-3x с PBS. Удалите излишки буфера и траnsfer скользит от стойки в горизонтальное положение в коробке слайд или другой влажной камере, чтобы предотвратить высыхание.
  8. Блок 45-60 мин при комнатной температуре с 10% нормальный осла сыворотки (также 5% бычий сывороточный альбумин, или предпочтительно сыворотки от животного, в котором было подготовлено вторичное антитело) в PBS.
  9. Инкубируйте образцы в начальном GFP антител в разведении 1:100 в PBS в течение ночи при 4 ° С в увлажненной камере. Осторожно применять небольшие кусочки ткани над Parafilm с антителом для содействия гомогенной контакт с тканью и предотвращать испарение.
    Примечание: Остальные этапы выполняются при комнатной температуре.
  10. Вымойте 5x с PBS, чтобы удалить лишнюю первичного антитела. Инкубируйте с вторичными антителами 1:500-1:1,000 в PBS в течение 1-2 ч при комнатной температуре.
  11. Вымойте 5x с PBS, чтобы удалить лишнюю вторичного антитела. Если желательно, контрастирующая слайды на этом шаге.
  12. При использовании флуоресцентного вторичные антитела, инкубировать 0,1% судан черный в 70% этанола еили 15-20 минут, чтобы уменьшить аутофлюоресценция. Сотрите избыток Судан черный со всего ткани и мыть 5x с PBS в течение 20 мин.
  13. Установите образца с покровным и хранить горизонтально, пока монтажный раствор не схватится.

4. Альтернативная протокол: Прямая Обнаружение GFP-LC3

  1. Иглу и раздувать легкие с ~ 500 мл 50/50 об / об октября PBS.
  2. Вставить в октябре, поместив небольшое количество октября в нижней части cryomold.
  3. Осторожно поместите расчлененный комплекс легких в форме.
  4. Медленно замерзают метилбутан охлажденным с помощью сухого льда.
  5. Добавьте больше октябрь пока ткань не будет полностью покрыта и замерзла. Держите на сухом льду и хранить при температуре -80 ° С.
  6. Использование cryomicrotome, вырезать 5-10 мкм разделы, защищающие разделы от света. Храните разделы и оставшиеся ткани при температуре -80 ° С.
  7. Для подготовки слайдов для работы с изображениями, удалить раздел с морозильной камерой и сразу же нанесите каплю PBS, чтобы предотвратить высыхание.
  8. Fix течение 30 мин с 4% PFA. Промыть PBS.
  9. Применить DAPI / Hoescht в течение 10 мин. Вымойте 3x с PBS.
  10. Установите образца с покровным и хранить горизонтально, пока монтажный раствор не схватится.
  11. Изображение с помощью эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии. Храните образцы при температуре 4 ° С на срок до одного месяца.

5. Подготовка ткани для электронной микроскопии

  1. Вырезать ткани в приблизительно 1 мм кубики для крепления.
  2. Закрепить ткани в 2% формальдегида, 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М какодилатном натриевого буфера, рН 7,4.
  3. Промыть 0,1 М какодилатном натрия буфера в течение 1-2 часов.
    Примечание: Фиксированный ткани могут быть сохранены в 0,1 М какодилате натрия при 4 ° С.
  4. Начать исправления в 1% осмия в 0,2 буфере М натрий-какодилатном в течение 1 часа.
  5. Промыть в 0,2 буфера какодилатном М натрия в течение 10 мин 3 раза.
  6. Дегидрировать в 70% этанола, 20 мин 2 раза. Дегидрировать в 90% этанола, 10 мин 2 раза. Дегидрировать в 100% этанола,20 мин 2x.
  7. Инкубировать с пропиленоксидом (эпоксидная пропан) в течение 10 мин 2 раза.
  8. Инкубировать с пропиленоксид / эпоксидной смолы смеси (50:50) в течение 1 часа. Смесь смолы эпоксидной является: 24 г Агар 100 смолы, додеценилянтарной ангидрид 13 г, methylnadic ангидрид 13 г и 1 мл N-бензилдиметиламина. Тщательно перемешать в одноразовом стакане деревянным шпателем.
  9. Выдержите с эпоксидной смолой в течение ночи в незакрытых флаконах (это позволяет любой оставшийся оксид пропилена испаряться).
  10. Вставить в маркированных капсул со свежеприготовленным смолы. Заполимеризуйте при 60 ° С в течение 48 часов.
  11. Срезы ткани для съемки с использованием просвечивающего электронного микроскопа при 80 или 60 кВ на электронном микроскопе пленки. Печать изображения на фотобумаге или сохранить в качестве цифровых медиа.
  12. Анализ аутофагосом образование в неповрежденных клеток, содержащих ядро. Поля малой мощности (э. Гр. 2000-4000 X) может быть использован для идентификации ядерных клеток. Обычно 6,800-10,000 X изображения используются для гоявляется аутофагосом количественное. Всего Аутофагосомы на единицу площади от 15-30 полей для соответствующей статистической представительства. Аутофагосомы имеют двойную структуру мембраны, где поздней стадии autophogosomes напоминал заполнено вакуоли.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Бактериемия присутствует у мышей уже в 6 часов после CLP-индуцированной сепсисом 14. Клинические признаки сепсиса (включая озноб, тахипноэ и нарушенной двигательной активности) появляются приблизительно 12 ч после процедуры. Мыши подвергались CLP начинают умирать около 18 часов после индукции перитонита. Чем тяжелее сепсис более увеличился является летальность 15. В деталях, полноценно сепсис вызывает 100%-ную смертность в течение 2-3 дней, в то время как в середине класса результаты сепсис в около 60% смертности в 7 дней после CLP (за пределами этого срока, ни одного случая смерти не ожидается) (рис. 1). В противоположность этому, смертность мышей из фиктивных должна быть равна нулю

Рисунок 1
Кривые после CLP разной степени тяжести у мышей Рисунок 1. Выживание. C57BL / 6 мышей подвергали мнимое хирургии или CLP-индуцированной сепсисом различной степени тяжести, регулируя лигирование поддержания постоянной количество перфораций в слепой кишке (т.е. 1 'через-и-через "прокол (два отверстия) с иглой 21 G ). Лигирование 60% результатов слепой кишки в середине класса сепсиса, что приводит к примерно 60% смертности в 7 дней после CLP. Лигирование ≥ 75% результатов слепой кишки в полноценного сепсиса и, впоследствии, в 100% смертности в течение 2-3 дней после CLP, в то время, перевязка ≤ 25% от слепой кишки приводит в низкосортных сепсиса и, таким образом, почти нулевой смертности. Типичные результаты выживаемости показаны.

Для целей настоящих аутофагии исследований, мы выбрали для реализации CLP модель среднего класса сепсиса. Низкосортные сепсис может быть недостаточно, чтобы вызвать аутофагию, а полноценно сепсис может привести к ранней летальности мышей (до индукции аутофагии).

ve_content "> дл анализа аутофагию мы использовали трансгенных мышей, экспрессирующих GFP-LC3 слитый белок подвергают вышеупомянутых протоколов сепсиса. Для лечебных процедур, которые приводят к стимуляции аутофагии пути, ожидается, что будет локализована усиление сигнала GFP ( Puncta), а анализировали либо иммуногистохимических или конфокальной анализов, указывающих на усиленному образованию аутофагосом 16.

Рисунок 2
Рисунок 2. GFP изображений в естественных условиях и в пробирке. (А, В) представитель пример GFP изображений в органах мыши (например почек), полученный от GFP-LC3B мышей. Изображение показывает GFP-LC3 Puncta в клубочков почечной ткани, полученной из необработанных мышей. Масштабные бары = 10 мм. ( С, D) Дополнительные данные приведены для иллюстрации GFP-LC3 изображений в пробирке. Первичные мезангиальных клеток были выделены из GFP-lc3 трансгенных мышей с использованием протокола для выделения клеток из генетически модифицированных мышей, как описано ранее. 17 Клетки инкубировали в отсутствие (С) или в присутствии (D) из TGF-β1 (2 нг / мл) в течение 24 ч, как описано выше 18. Лечение с TGF-β1 увеличилось обилие аутофагосом (зеленый Puncta). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Это можно провести дополнительную проверку по классической ультраструктурного анализа с помощью электронной микроскопии, как указано в протоколе. Предполагается, что срезы ткани, полученные от мышей с сепсисом или других моделях повреждения ткани покажут расширенные вакуоль аутофагической (аутофагосом) формирование на единицу площади ткани.

e_content "FO: держать-together.within страницах =" всегда "> Рисунок 3
Рисунок 3. Электронной микроскопии аутофагосом формации. Представитель микрофотография рано и образование аутофагосом поздней стадии в легочной ткани, взятой из C57BL / 6 мышей, подвергнутых воздействию среднего класса CLP (60% лигирования, 21 г, 2 отверстия). Εarly этап Аутофагосомы имеют структуру двойной мембраны (стрелка), а поздней стадии Аутофагосомы напоминать наполненный вакуоль (стрелки). М обозначает митохондрии. Шкала бар = 1 мкм. Представитель управления изображением показан легочной ткани от мышей C57BL / 6, подвергнутых имитации операции. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Основным преимуществом CLP является то, что позволяет исследователям изучить сепсис различных степеней тяжести (то есть от низкой до середины и высокого класса). Тяжесть индуцированного сепсиса зависит от длины слепой кишки лигированного (которых наиболее важным фактором, определяющим), размер иглы, используемой для пункции и количество отверстий выполняется 15. Кроме того, штамм мыши и пол может повлиять на тяжести сепсиса; несколько штаммов более восприимчивы чем другие, и самцы, как правило, более чувствительны, чем у женщин 19,20. Вышеуказанные факторы, взятые вместе, определяют CLP-индуцированной смертности.

Основываясь на нашем опыте, есть разница между исследователями в связи с достигнутым CLP-индуцированной смертности. . Например, Rittirsch др. используется 50% труб, 21 г, 1 'через-и-через' прокол (два отверстия) для достижения 60% смертности 15; следователь в нашей исследовательской группы нуждающихсяред использовать несколько более сильную модель (60% труб, 21 г, 1 'и через сквозной "прокол), чтобы получить ту же смертность, тогда как другой исследователь в нашей исследовательской группы использовали более тяжелой модели (около 100% лигирования , 19 г, 1 'и через сквозной "прокол), чтобы достичь значительно более низкую смертность (только 25%). С учетом указанных выше соображений, можно утверждать, что характеристика тяжести CLP (т.е. низкой, средней или полноценно сепсис) должно быть сделано задним числом (то есть глядя на полученной смертности), а не в перспективе (т.е. путем применения определенных условиях, например, 50% труб). Когда оператор достигает смертность около 60%, то, в этом нет среднего качества сепсис, независимо от того, какие условия (например, длины слепой кишки лигированного и количеством отверстий, выполненных) реализованы. Таким образом, кажется разумным, что оператор попробовать различные условия для выявления тех, при которых 60% мышей умирают. Затем оператордолжен осуществить точно такие же условия в обеих группах сравнивают.

Реализуя те же условиях (например, длины слепой кишки лигируют, размер иглы, используемой для прокола, количество отверстий, выполненных, штамм мыши и пол), предполагается, что последовательные и воспроизводимые результаты будут выпускаться 15. Тем не менее, даже после выполнения CLP в стандартизированной форме (с учетом вышеуказанных факторов, определяющих), изменчивость может произойти. Было признано экспертами, что "даже если идентичные оскорбления даются одинаково в возрасте группы животных - даже из одного помета - переменная индивидуальный эффект можно увидеть" 6. Таким образом, в попытке уменьшить вариабельность, представляется разумным, что оператор выполнить CLP в обоих сравниваемых групп в тот же день.

Анализ аутофагии, динамический клеточный процесс, является сложной. Протоколы, изложенные в настоящем monograтел служат основой для оценки активации аутофагии в естественных условиях, на основе биохимического или морфологического анализа аутофагосом образования. В принципе, протоколы, представленные в этой главе может быть применен к анализу аутофагии в любом ткани органа у мышей, подвергнутых CLP или альтернативных моделей сепсиса. В то время как печень является общепринятым для представления первичной мишенью CLP, эта процедура также может привести к травмам легких или почечной ткани, которая заслуживает дальнейшего изучения. Эффект CLP на аутофагии гепатоцитов был относительно хорошо изучены по сравнению с его влияние на аутофагии почки или легкого, а некоторые соответствующие доказательства был недавно опубликован 21,22.

Следует отметить, что эти статические меры аутофагии, как увеличение числа аутофагосом может также отражать аутофагии дисфункции через блокирование функции лизосом и обработки последней стадии. В этой связи эти тесты должны быть дополнены Biochemческих анализы для аутофагической оборота подложки (например,   поток), как недавно описал и адаптирован для в естественных условиях анализирует 11. Эти анализы также могут быть дополнены стандартной Западной иммуноблот-анализа на экспрессию основных аутофагии белков в ткани, как недавно описано 12,13. Таким образом, рекомендуется, что сочетание этих испытаний быть реализованы, чтобы получить точную оценку статуса аутофагии в поврежденной ткани 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы, объявляющие

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH гранты P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, к АМК Чой. С. Ryter получил поддержку зарплаты от Лавлейс Респиратор Научно-исследовательского института.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice Riken (Japan) RBRC00806 GFP-LC3#53
Xylazine Henry-Schein 568-0606 Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine Henry-Schein 995-2949 Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH Fisher A405-20 Histology Grade
EtOH Fisher A407-1 For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0 Owens & Minor 2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl Henry-Schein 614-5157 Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution JT Baker S898-09
xylenes Fisher X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody Life Technologies G10362
Hoescht Sigma 944403
DAPI Invitrogen D1306
OCT VWR scientific 25608-930
Sudan Black Santa Cruz sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate Electron microscopy Sciences 15960
propylene oxide Sigma 240397
Agar 100 resin Agar scientific R1045
dodecenylsuccinic anhydride Sigma 46346
methylnadic anhydride Sigma 45359
N-benzyldimethylamine Sigma 185582

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
  2. Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
  3. Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
  4. Rivers, E., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. Med, shock.N. .E. ngl.J. . 345, 1368-1377 (2001).
  5. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24, (Suppl 1), 19-23 (2005).
  6. Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
  7. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  8. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
  9. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  10. Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
  11. Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
  12. Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
  13. Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
  14. Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
  15. Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
  16. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  17. Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
  18. Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
  19. Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
  20. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
  21. Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
  22. Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).
Слепой кишки Лигирование и прокол, вызванной Сепсис как модель для изучения аутофагии у мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).More

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter