Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht

Published: February 9, 2014 doi: 10.3791/51066
Automatic Translation
1,3, 1, 2, 2, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Renal Division, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3First Department of Critical Care Medicine and Pulmonary Services, University of Athens Medical School, Evangelismos Hospital, Athens, Greece

Summary

Experimentelle Sepsis in Mäusen mit der Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode ausgelöst werden. Aktuelle Protokolle Autophagozytose in vivo im Rahmen des CLP-induzierten Sepsis beurteilt werden hier vorgestellt: Ein Protokoll für die Messung unter Verwendung Autophagozytose (GFP)-LC3 Mäuse und ein Protokoll für die Messung Autophagosom Bildung durch Elektronenmikroskopie.

Abstract

Experimentelle Sepsis in Mäusen mit der Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode, die Sepsis verursacht polymikrobiellen induziert werden. Hier wird ein Protokoll vorgesehen, um Sepsis unterschiedlichen Schweregrades in Mäusen zu induzieren mit der CLP Technik. Autophagie ist ein Grundgewebereaktion auf Stress und Krankheitserreger Invasion. Zwei Stromprotokollen zu Autophagozytose in vivo im Rahmen des experimentellen Sepsis beurteilen sind auch hier vorgestellt. (I) Transgene Mäuse, grün fluoreszierendes Protein (GFP)-LC3-Fusionsprotein exprimieren, werden CLP unterworfen. Lokalisierten Erhöhung der GFP-Signal (puncta), entweder durch immunhistochemische Assays getestet oder konfokalen kann verwendet werden, um verbesserte Bildung Autophagosom erfassen und somit verändert Aktivierung der Autophagie werden. (II) Verbesserte autophagischen Vakuole (Autophagosom)-Bildung pro Einheit Gewebebereich (als Marker der Autophagie Stimulation) kann mit Hilfe der Elektronenmikroskopie quantifiziert werden. Das Studium der Autophagie Antworten auf Sepsis ist eine kritische Layoutonent Verständnis der Mechanismen, durch die Gewebe reagieren auf eine Infektion. Forschungsergebnisse in diesem Bereich kann letztendlich zum Verständnis der Pathogenese der Sepsis, die ein großes Problem in der Intensivmedizin stellt beitragen.

Introduction

Sepsis, eine systemische entzündliche Reaktion auf eine Infektion, eine der häufigsten Todesursachen bei kritisch-kranken Patienten ein. Intra-abdominale Infektionen, die oft polymikrobiellen Sepsis führen, entfallen 20% der Sepsisfälle, die erhebliche Sterblichkeit von bis zu 60% 2 haben. Sepsis-assoziierte Mortalität resultiert im Wesentlichen aus Multi-Organ-Dysfunktion mit anschließender Organversagen 3,4. Weitere Untersuchungen in den Pathomechanismus dieser Erkrankung ist dringend erforderlich, um die Entwicklung neuer und wirksamere Therapien zu fördern.

Die Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Modellierung von Sepsis in vivo. Wie der Blinddarm ist voll von Bakterien, seiner Punktion ergibt polymikrobiellen Peritonitis, Translokation von Bakterien in das Blut (Bakteriämie), septischer Schock, Multi-Organ-Dysfunktion und schließlich Tod 5. Es ist allgemein anerkannt, daß CLP reflektiert klinischenRealität genauer als frühere Verfahren, wie Injektion von Endotoxin oder gereinigten Bakterien in Nagetieren Somit CLP wird als Goldstandard (wenn auch nicht ohne Einschränkungen) 6 für die experimentelle Induktion und somit die Untersuchung der Pathogenese von Sepsis. In dieser Monographie, beschreiben wir Protokolle entwickelt, um zu beurteilen, ob pathogene Mechanismen der Sepsis sind Autophagie.

Autophagy eine evolutionär konservierte zelluläre Prozess erleichtert den Umsatz von beschädigten Proteinen und Organellen, wie Mitochondrien und spielt eine wichtige Rolle bei der Clearance von intrazellulären Pathogenen wie Bakterien 7,8. Während Autophagozytose sind cytosolische Proteine ​​oder Organellen in die Doppelmembran-Vesikel gebunden genannt autophagosomes, die anschließend zu den Lysosomen zum Abbau 9 geliefert werden abgetrennt. Eine Reihe von Proteinen, wie den Säugerhomologen Autophagozytose-Genen (ATG) identifiziert,ursprünglich in der Hefe, die den Prozess der Autophagie regulieren identifiziert. Die Umwandlung von Mikrotubuli-assoziierten Protein-1-Leichtketten-3B (LC3B) (Homolog Atg8) aus LC3B-I (freie Form) zu LC3B-II (Phosphatidylethanolamin-konjugierter Form) stellt einen wichtigen Schritt in Autophagosom Bildung 9. Autophagische Dysfunktion ist mit dem Altern und der menschlichen Krankheiten, darunter Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen 10 zugeordnet. Darüber hinaus wirkt sich die Autophagie angeborenen und erworbenen Immunität, wie Antigen-Präsentation, Lymphozytenentwicklung und Zytokin-Sekretion von Immunzellen 8. So scheint es sinnvoll, dass die Autophagie könnte auch in der systemischen Entzündungsreaktion auf eine Infektion (zB bei Sepsis) eine Rolle spielen.

Bisher mehrere Verfahren beschrieben worden, um die Rolle der Autophagie in Gewebeverletzung in vivo zu beurteilen. Dazu gehören der Einsatz der grünen Fluoreszenz-Protein (GFP)-LC3 exprimierenden Mäusen und die Quantifizierung der AutoPhagosomen in Gewebe durch Elektronenmikroskopie (Diese beiden Verfahren werden in dieser Monographie beschrieben). Weitere Methoden sind die Quantifizierung von Autophagie-Protein-Expression in Gewebehomogenaten, und die Analyse der Autophagie Fluss (wie an anderer Stelle beschrieben), 11-13. Das Ziel dieser Überprüfung ist es, für die Beurteilung der aktuellen Protokolle Autophagie in vivo im Rahmen der experimentellen Sepsis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hinweis: Die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss am Brigham and Womens Hospital / der Harvard Medical School Raums zugelassenen die folgenden Verfahren.

1. Blinddarm-Ligation und Punktion

Verwenden Mäusen des gleichen Hintergrund (C57Bl / 6), männlich, 8-10 Wochen alt. Weibliche Mäuse sind widerstandsfähiger als Männer gegen die Sepsis-induzierten Letalität. Mäuse älter als 8 Wochen produzieren weniger unterschiedliche Ergebnisse als jüngere Mäuse in Bezug auf die Überlebensrate nach CLP. Etwa N = 10 Mäuse pro Gruppe sollte im Vergleich zur Überlebensanalyse verwendet werden. N = 3-5 Mäusen ist ausreichend für die Autophagie-Assays.

  1. Verwenden Sie sterile kleine chirurgische Instrumente (nämlich Skalpell, Schere und Pinzette stumpf anatomische), die für Nager Chirurgie geeignet sein sollte.
  2. Bereiten Anästhesie Mischung: Um 7.95 ml PBS hinzufügen 150 ul Xylazin (AnaSed Injektion von 100 mg / ml) und 700 ul von Ketamin (Ketaset   CIII, 100 mg / ml).
  3. Um aseptischen Bedingungen während des Verfahrens zu gewährleisten, Handschuhe, Gesichtsmaske und OP-Kittel.
  4. Wiegen Tiere. Anesthetize sie durch die Injektion intraperitoneal (ip) die in Schritt 3 in einer Dosierung von ul (10x Körpergewicht in g) genannten Mischung. Zum Beispiel für eine Maus mit einem Gewicht von 22 g, zu verwalten 10x22 = 220 ul der Mischung von Anästhetika. Somit werden die endgültigen Dosen von Xylazin und Ketamin 17 und 80 mg / kg Körpergewicht. Stellen Sie sicher, dass die Narkose ausreichend ist, keine Beugung der Extremität sollte nach Zehe Prise hergestellt werden. Hinweis: Verwenden Sie Augensalbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
  5. Zeigen Tiere auf eine saubere Arbeitsfläche auf dem Rücken. Tails und Hinterpfoten sind auf die Ermittler ausgerichtet. Desinfizieren Sie die Bauchhaut mit Alkohol (70% EtOH-Lösung). Hinweis: Chirurgische Bereich sollte komplett rasiert werden, um eine Verunreinigung der Wunde durch den Kontakt mit vermeidenFell. Auch optimal, eine zirkulierende Warmwasser-Pad sollte zur Normothermie von betäubten Mäusen während der Operation beibehalten werden.
  6. Durch die Verwendung eines Skalpells, machen Sie einen kleinen Hautschnitt in Längsrichtung parallel und ca. 1 cm links der Mittellinie. Noch nicht eindringen in die Bauchhöhle. Verwenden Sie kleine Schere, um die anfängliche Schnitt verlängern.
  7. Identifizieren Bauchmuskeln und zu zerlegen, den Zugang in die Bauchhöhle zu gewinnen.
  8. Durch die Verwendung von stumpfen anatomische Pinzetten, identifizieren den Blinddarm und verschieben Sie sie aus der Bauchhöhle. Seien Sie vorsichtig, nicht zu mesenterialen Blutgefäße beschädigen (dies kann zu tödlichen Blutungen führen kann).
  9. Ligieren 60% der Blinddarm, eine Mitte-Grade-Sepsis zu erzielen. Ligation von gleich oder mehr als 75% des Blinddarms führt in der Regel hochwertige Sepsis, während Ligation von gleich oder weniger als 25% der Blinddarm Ergebnisse in low-grade Sepsis. Achten Sie darauf, die lleozökalklappe (dies könnte die Darmkontinuität zu blockieren) zu ligieren.
  10. Durch die Verwendung eines21 G Nadel perforieren Blinddarm von einem durch und durch Punktion (zwei Löcher) in der Nähe der Ligation. Die Richtung der Perforation sollte der mesenterialen der Anti mesenterialen Seite des Blinddarms sein. Seien Sie vorsichtig, nicht zu mesenterialen Blutgefäße durchstechen.
  11. Entfernen Sie die Nadel. Drücken Sie vorsichtig die ligiert Blinddarm, um die Durchgängigkeit durch die beiden Löcher zu bestätigen, nur eine kleine Menge von Fäkalien sollte durch sie extrudiert werden.
  12. Bewegen Sie den ligiert und punktiert Blinddarm in die Bauchhöhle.
    Hinweis: Für Schein Mäuse, überspringen Sie die Schritte von 1,10 bis 1,12.
  13. Verwenden Seide chirurgisches Nahtmaterial 6-0 mit Schneid Nadel Bauchmuskulatur zu schließen. Verwenden Seide chirurgisches Nahtmaterial 6-0 mit Schneid Nadel Bauchhaut zu schließen.
  14. Spritzen 1 ml vorgewärmten (37 ° C) normaler Kochsalzlösung ip, Wärme-und Flüssigkeitszufuhr während des Verfahrens verloren zu ersetzen. Legen Sie die Mäuse unter einer Wärmelampe, bis ihre Lungen-Wiederbelebung. Hinweis: Optimal ist ein sicherer Wärmegerät (such als zirkulierendes warmes Wasser Pad) kann anstelle einer Wärmelampe verwendet werden.
  15. Postoperativ injizieren Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht sc). Analgesie zu erreichen. Hinweis: Ein Tier sollte nicht unbeaufsichtigt bleiben, bis er wieder zu Bewusstsein kam, um ausreichend Brustlage zu halten. Ein Tier, das eine chirurgische Behandlung unterzogen wurde, nicht auf die Firma von anderen Tieren, bis sie vollständig zurückgewonnen.
  16. Zeigen Tiere zurück in ihre Käfige mit unbegrenztem Zugang zu Nahrung und Wasser. Mäuse eingeschläfert werden, wenn sie moribund (von klinischen Zeichen wie Fehler zu bewegen, wenn sie berührt oder Zyanose bezeichnet) zu werden. Überprüfen Mäuse alle 4 Stunden zu vermeiden, dass sie vor der Euthanasie sterben.

2. Tissue Ernte und Fixation

  1. Bereiten Sie eine 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung: Um 889 ml PBS hinzufügen 111 ml 37% PFA.
  2. Sacrifice Mäuse entweder mit CO 2-induzierte Narkose oder Ketamin / Xylazin slösung in einer hohen Dosierung.
  3. Immobilisieren die Mäuse auf eine saubere Arbeitsfläche. Sprühen Sie die Bauch-und Brusthaut mit 70% EtOH-Lösung, um es zu desinfizieren.
  4. Verwenden Sie ein Skalpell und eine kleine Schere, um den Bauch-und Brusthaut sowie die Haut, die den Luftröhrenbereich zu entfernen.
  5. Reveal Luftröhre durch Entfernen der umliegenden Gewebe (Muskeln und Bindegewebe).
  6. Legen Sie eine Naht (ohne Schneid Nadel) um die Luftröhre. Weiß noch nicht festziehen.
  7. Verwenden Sie einen kleinen peripheren Venenkatheter (20 G) auf 'intubieren "Luftröhre. Seien Sie vorsichtig, während der Katheter an Luftröhren Träne zu vermeiden. Beachten Sie, dass der größte Durchmesser der Luftröhre ist gerade unterhalb des Ringknorpels.
  8. Ziehen Sie den Faden um die Luftröhre / Katheter. Nach Entfernen der Nadel so dass nur die Kunststoffkanüle der Katheter in die Trachea. Nadel diente nur als Führungsdraht zum Einsetzen der Kunststoffkanüle.
  9. Nachdem die Kunststoffkanüle in die Luftröhre gesichert, schneiden the Bauchmuskulatur, öffnen Sie den Bauch und zeigen die Membran.
  10. Mit einer Nadel punktieren die Membran Pneumothorax (dh Einsetzen von Luft in die Brusthöhle) zu produzieren. Lungen sollten dann zusammengelegt werden.
  11. Mit einer kleinen Schere, entfernen Sie die Membran entlang des Brustbeins (Sternotomie) schneiden, entfernen Sie den Brustkorb und zeigen das Herz und die Lunge.
  12. Durch die Kunststoffkanüle in die Trachea eingeführt, fixieren die Lungen mit der Formaldehydlösung unter 30 cm H 2 O Druck.
  13. Entfernen Sie die Lungen und legen Sie sie in die 4% PFA für 24 h und anschließend in 70% EtOH-Lösung bis zur Verarbeitung.
  14. Suchen und entfernen Sie Herz, Leber und Nieren. In gleicher Weise stellen sie in 4% PFA für 24 Stunden und anschließend in 70% EtOH-Lösung bis zur Verarbeitung.

3. GFP-Mäuse und Anzeigen von GFP Slides

  1. Führen CLP-und Scheinoperation auf GFP-LC3-Mäuse wie in Schritt 1 und postoperative Verfahren beschriebens wie in Schritt 2 des Protokolls beschrieben.
  2. Betten Sie das Gewebe (insbesondere Lunge, Herz, Leber und Nieren) in Paraffin und schneiden Sie sie in Serien 5 um Abschnitte.
  3. Wenn Sie bereit sind für GFP-Färbung, Inkubation bei 60 ° C für 30-60 Minuten, bis Paraffin schmilzt und Gewebe scheint scheinend.
  4. Entparaffinieren mit Standard abgestufte Reihe von Xylol oder Xylol ersetzt, 5 min Xylol 1, 2 Xylol und Xylol 3 dann 3 min Inkubation in abgestuften Reihe von EtOH: 100%, 95%, 75%, und dann spülen in destilliertem Wasser.
    Hinweis: Nach Entparaffinierung vermeiden Gewebeaustrocknung, die Probe Hintergrund erhöht.
  5. Antigen-Wiedergewinnung durchzuführen unter Verwendung von Zitronensäure-Puffer (10 mM Natriumcitrat Säure, 0,05% Tween 20, pH 6,0), durch die Mikrowelle für 10-20 min. Achten Sie darauf, in regelmäßigen Abständen zu ersetzen, um Puffergewebeaustrocknung zu vermeiden.
  6. Anschließend Lösung für 20 Minuten auf der Bank zu kühlen, um Antigen-Retrieval abzuschließen.
  7. 2-3x Waschen mit PBS. Überschüssigen Puffer und transfer gleitet von der Zahnstange in die horizontale Position in einer Dia-Box oder anderen feuchten Kammer, um ein Austrocknen zu verhindern.
  8. Block 45-60 min bei Raumtemperatur mit 10% normalem Eselserum (auch 5% Rinderserumalbumin, oder bevorzugt Serum aus dem Tier, in dem der sekundäre Antikörper erzeugt wurde) in PBS.
  9. Verwendung von Primär GFP Antikörper inkubieren einer Verdünnung von 1:100 in PBS über Nacht bei 4 ° C in der feuchten Kammer. Kleine Stücke von Parafilm über Gewebe sanft an mit Antikörper homogene Kontakt mit dem Gewebe fördern und verhindern, dass die Verdunstung.
    Hinweis: Verbleibende Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
  10. 5x Waschen mit PBS, um überschüssige primäre Antikörper zu entfernen. Inkubieren mit sekundärem Antikörper 1:500-1:1,000 in PBS für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur.
  11. 5x Waschen mit PBS, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen. Falls gewünscht, Gegenfärbung der Objektträger bei diesem Schritt.
  12. Wenn unter Verwendung von fluoreszierenden sekundären Antikörper, Inkubation 0,1% Sudan Schwarz in 70% EtOH foder 15-20 min auf Autofluoreszenz zu reduzieren. Wischen Sie überschüssiges Sudan Schwarz aus aller Gewebe und waschen 5x mit PBS über 20 min.
  13. Montieren Probe mit Deckglas und horizontal zu speichern, bis Montagelösung gesetzt hat.

4. Alternative Protokoll: Direkter Nachweis von GFP-LC3

  1. Kanülieren und blasen Lunge mit ~ 500 ml 50/50 v / v Oktober PBS.
  2. Im Oktober, indem eine kleine Menge von Oktober in den Boden einer cryomold einbinden.
  3. Legen Sie das seziert Lungenkomplex in der Form.
  4. Langsam frieren unter Verwendung von Trockeneis über Methyl gekühlt.
  5. Noch Oktober, bis das Gewebe vollständig bedeckt und eingefroren solide. Halten Sie auf Trockeneis und bei -80 ° C
  6. Mit einem Kryomikrotom, schneiden 5-10 um dicke Schnitte Schutz der Abschnitte aus Licht. Speicherabschnitte und die verbleibenden Gewebe bei -80 ° C.
  7. Um Folien für die Bildgebung vorzubereiten, entferne Abschnitt aus dem Gefrierschrank und einem Tropfen PBS sofort anwenden, um ein Austrocknen zu verhindern.
  8. Fix für 30 min mit 4% PFA. Mit PBS waschen.
  9. Bewerben DAPI / Hoechst für 10 min. 3x Waschen mit PBS.
  10. Montieren Probe mit Deckglas und horizontal zu speichern, bis Montagelösung gesetzt hat.
  11. Bild mit Epi-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop. Proben bei 4 ° C für bis zu einem Monat.

5. Herstellung von Seiden für Elektronenmikroskopie

  1. Schneiden Gewebe in etwa 1 mm Würfel zur Befestigung.
  2. Fix das Gewebe in 2% Formaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4.
  3. Waschen mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für 1-2 Std.
    Hinweis: Fest Gewebe in 0,1 M Natriumcacodylat bei 4 ° C gelagert werden
  4. Sende fix in 1% Osmiumtetroxid in 0,2 M Natriumcacodylatpuffer für 1 Stunde.
  5. Spülen in 0,2 M Natriumkakodylat-Puffer für 10 min 3x.
  6. Entwässern in 70% EtOH, 20 min 2x. Entwässern in 90% EtOH, 10 min 2x. Entwässern in 100% EtOH,2x 20 Minuten.
  7. Inkubation mit Propylenoxid (Epoxy Propan) für 10 min 2x.
  8. Inkubieren mit Propylenoxid / Epoxyharz-Mischung (50:50) für 1 Stunde. Das Epoxidharzgemisch ist: 24 g Agar 100 Harz, 13 g Dodecenylbernsteinsäureanhydrid, 13 g Methylnadinsäureanhydrid und 1 ml N-Benzyldimethylamin. Gründlich mischen in einem Einweg-Becher mit einem Holzspatel.
  9. Inkubation mit Epoxidharz über Nacht unverschlossen in Fläschchen (dies kann jeder restliche Propylenoxid verdampfen).
  10. Bei markiertem Kapseln mit frisch zubereiteten Harz einbetten. Polymerisation bei 60 ° C für 48 Stunden.
  11. Foto Gewebeschnitten unter Verwendung eines Transmissions-Elektronenmikroskops bei 80 oder 60 kV auf Elektronenmikroskop Film. Drucken Sie die Bilder auf Fotopapier oder als digitale Medien zu speichern.
  12. Analysieren Autophagosom Bildung in intakten Zellen Kern mit. Niedriger Energiefelder (e. G. 2.000-4.000 X) kann verwendet werden, um kernhaltigen Zellen zu identifizieren. Typischerweise 6,800-10,000 X Bilder für th verwendetist Autophagosom Quantifizierung. Graf Autophagosomen pro Flächeneinheit von 15 bis 30 Felder für entsprechende statistische Darstellung. Autophagosomen haben Doppel-Membran-Struktur, in der späten Phase autophogosomes glich gefüllter Vakuolen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bakteriämie bei Mäusen vorhanden ist, so früh wie 6 Stunden nach der CLP-induzierten Sepsis 14. Klinische Zeichen einer Sepsis (einschließlich Schüttelfrost, Tachypnoe und eingeschränkte motorische Aktivität) erscheinen etwa 12 Stunden nach dem Eingriff. Mäuse CLP unterworfen beginnen bei rund 18 Stunden nach Induktion der Peritonitis sterben. Je schwerer ist die Sepsis die mehr erhöht ist die Letalität 15. Im Detail führt hochwertige Sepsis 100% Mortalität innerhalb von 2-3 Tagen, während Mitte-Grade-Sepsis führt zu rund 60% Mortalität bei 7 Tage nach CLP (jenseits dieser Frist keine Todesfälle zu erwarten) (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu sollte die Sterblichkeit von Schein-Mäusen Null sein

Figur 1
Abbildung 1. Lebenskurven nach CLP verschiedener Schweregrad bei Mäusen. C57BL / 6 Mäuse wurden einer Operation oder CLP-induzierten Sepsis unterschiedlicher Schwere durch Einstellen der Ligation mit einer 21 G Nadel Konstanthalten der Anzahl von Perforationen, um den Blinddarm (dh 1 'durch und durch "Punktion (zwei Löcher) Schein ). Ligation von 60% der Blinddarm Ergebnisse in einem Mittelklasse-Sepsis, die zu etwa 60% Mortalität 7 Tage nach CLP führt. Ligation von ≥ 75% der Blinddarm Ergebnisse in hochwertigen Sepsis und anschließend in 100% Mortalität innerhalb 2-3 Tage nach CLP, während, führt die Ligation von ≤ 25% der Blinddarm in low-grade Sepsis und damit in fast Null-Mortalität. Typische Überlebensergebnisse werden angezeigt.

Für die Zwecke der Autophagie Studien, entschieden wir uns, ein CLP-Modell der Mittelklasse-Sepsis zu implementieren. Low-grade Sepsis könnte unzureichend sein, um die Autophagie induzieren, während hochwertige Sepsis kann zu frühen Letalität von Mäusen führen (vor der Induktion der Autophagie).

ve_content "> zur Bestimmung Autophagozytose haben wir transgene Mäuse verwendet LC3 GFP-Fusionsprotein den genannten Sepsis Protokollen unterworfen exprimieren. Für Behandlungsverfahren, das in der Stimulation der Autophagie führen, ist zu erwarten, dass es lokalisiert Verbesserung der GFP-Signal ( puncta), untersucht, wie entweder durch immunhistochemische oder konfokalen Assays, was auf verbesserte Autophagosom Formation 16.

Figur 2
2. GFP Bildgebung in vivo und in vitro. (A, B) Repräsentative Beispiel GFP Bildgebung in Mausorganen (z. B. Niere) von GFP-LC3B Mäusen erhalten. Bild zeigt GFP-LC3 puncta in den Glomeruli der von unbehandelten Mäusen Nierengewebe. Maßstabsbalken = 10 mm. ( C, D) Zusätzliche Daten sind vorgesehen, um in vitro-GFP-LC3 Abbildungs ​​illustrieren. Primär Mesangialzellen wurden aus GFP-LC3-transgenen Mäusen unter Verwendung eines Protokolls zur Zellisolierung von gentechnisch veränderten Mäusen, wie zuvor beschrieben, isoliert. 17. Die Zellen wurden in Abwesenheit (C) oder in Gegenwart (D) von TGF-β1 (2 ng / ml) für 24 h wie zuvor beschrieben 18. Die Behandlung mit TGF-β1 erhöht die Fülle der Autophagosomen (grün puncta). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Dies kann durch klassische Ultrastrukturanalyse mittels Elektronenmikroskopie geprüft werden, wie in dem Protokoll beschrieben. Es wird erwartet, dass Gewebeschnitte von septischen Mäusen oder anderen Gewebeverletzung Modelle erhalten würde, verbesserte autophagischen Vakuole (Autophagosom)-Bildung pro Einheit Gewebebereich zu zeigen.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Fig. 3
Abbildung 3. Elektronenmikroskopie Autophagosom Bildung. Ein Vertreter Mikroskopische Aufnahme von Früh-und Spätstadium Autophagosom Bildung im Lungengewebe von C57BL / 6 Mäusen entnommen und Mitte-Grade-CLP (60%-Ligation, 21 G, 2 Löcher) unterzogen. Εarly Bühne Autophagosomen mit einem Doppelmembran-Struktur (Pfeil), während spät Autophagosomen ähneln einem gefüllten Vakuole (Pfeilspitze). M bezeichnet Mitochondrien. Maßstabsbalken = 1 um. Eine repräsentative Bildkontrolle wird von Lungengewebe von C57BL / 6 Mäusen, die Scheinoperation unterzogen dargestellt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der große Vorteil des CLP ist, dass es erlaubt Forschern, Sepsis unterschiedlicher Schweregrade (dh von Low-bis Mid-und High-grade) zu untersuchen. Der Schweregrad der induzierten Sepsis wird durch die Länge der Blinddarm ligiert (was die wichtigste Determinante) betroffen, die Größe der Nadel für die Punktion verwendet, und die Anzahl der Löcher 15 durchgeführt. Darüber hinaus kann die Maus-Stamm und Geschlecht von der Schwere der Sepsis beeinflussen; mehrere Stämme sind anfälliger als andere und Männern im Allgemeinen anfälliger als Frauen 19,20. Die oben genannten Faktoren zusammen bestimmen die CLP-induzierten Mortalität.

Basierend auf unserer Erfahrung, es gibt einen Unterschied zwischen den Ermittlern im Hinblick auf die erzielte CLP-induzierten Mortalität. . Zum Beispiel Rittirsch et al 50% der Ligation 21 G, 1 'durch und durch' Punktion (zwei Löcher), um eine 60% ​​Mortalität 15 zu erreichen; ein Ermittler in unserer Forschungsgruppe Notwendigkeited, eine etwas schwerere Modell (60% der Ligation, 21 G, 1 'durch und durch' Punktion) zu verwenden, um die gleiche Sterblichkeitsrate zu erhalten, während ein anderer Ermittler in unserer Arbeitsgruppe verwendet eine schwere Modell (in der Nähe von 100%-Ligation 19 G +1' bis und Through 'Einstich) einen viel niedriger Mortalität (nur 25%) erzielen. Mit den oben genannten Gesichtspunkten könnte man argumentieren, dass die Charakterisierung der Schwere der CLP (dh Low-, Mid-oder High-Grade-Sepsis) ist retrospektiv erfolgen (zB durch Blick auf die daraus resultierenden Mortalität) werden eher als prospektiv (dh durch die Anwendung bestimmten Bedingungen, beispielsweise 50% der Ligation). Wenn ein Bediener erreicht eine Mortalität von etwa 60%, dann ist diese Mittelklasse-Sepsis, egal welche Bedingungen (wie die Dauer des Blinddarms ligiert und Anzahl der Löcher durchgeführt) durchgeführt werden. So scheint es sinnvoll, dass der Betreiber versuchen, verschiedene Bedingungen wie in denen 60% der Mäuse sterben zu identifizieren. Dann die Bedienungshat genau die gleichen Bedingungen in beiden Gruppen verglichen zu implementieren.

Durch die Implementierung von genau den gleichen Bedingungen (z. B. der Länge der Blinddarm ligiert, Größe der Nadel für die Punktion, Anzahl der Bohrungen durchgeführt, die Maus-Stamm und Geschlecht), wird erwartet, dass konsistente und reproduzierbare Ergebnisse werden produziert 15 werden. Aber auch nach Leistung der CLP in standardisierter Weise (unter Berücksichtigung der oben genannten Faktoren), kann Variabilität auftreten. Es wurde von Experten erkannt, dass "selbst wenn identische Beleidigungen werden gegeben, um gleich im Alter von Gruppen von Tieren - auch aus dem gleichen Wurf - eine Variable, individuelle Wirkung gesehen werden kann" 6. So wird in Versuch, Variabilität zu reduzieren, scheint es sinnvoll, dass der Betreiber durchzuführen CLP in beiden Gruppen im Vergleich am selben Tag.

Die Analyse der Autophagie, ein dynamischer zellulärer Prozess, ist komplex. Die in diesem monogra skizziert ProtokollepH-Wert die Grundlage für die Schätzung Autophagozytose Aktivierung in vivo, basierend auf biochemischen und morphologischen Analyse Autophagosom Bildung. Im Prinzip können die Protokolle in diesem Kapitel auf die Analyse von Autophagozytose in jeder Organgewebe bei Mäusen CLP oder alternative Modelle von Sepsis unterzogen angewendet werden. Während die Leber ist allgemein akzeptiert, um eine primäre Ziel von CLP darstellen, kann dieses Verfahren auch zu Verletzungen führen zu Lungen-oder Nierengewebe, das würdig weitere Untersuchungen. Die Wirkung von CLP auf Autophagie von Hepatozyten war relativ gut im Vergleich zu den Auswirkungen auf die Autophagie von Nieren-oder Lungen studiert, und einige relevante Beweise wurde vor kurzem veröffentlicht 21,22.

Es sei darauf hingewiesen, dass diese statische Maßnahmen der Autophagie, da erhöhte Autophagosom Nummern können auch Autophagie Dysfunktion reflektieren durch Blockade der lysosomale Funktion und End-Verarbeitungsstufe werden. In dieser Hinsicht sollte diese Assays mit Biochem ergänztschen Tests für autophagischen Substratumsatz (z. B.   Fluss), wie kürzlich beschrieben, und für die in vivo-Analysen 11 angepasst. Diese Assays können auch durch Standard-Western-Immunoblot-Analyse der Expression von Schlüssel Autophagozytose Proteine ​​in Gewebe ergänzt werden, wie kürzlich beschrieben 12,13. Daher wird empfohlen, eine Kombination aus diesen Tests durchgeführt, um eine genaue Schätzung des Status Autophagozytose in verletztem Gewebe 16 erhalten werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb zu erklären

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse HL108801 P01, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, AMK Choi unterstützt. S. Ryter erhielt Unterstützung von der Gehalts Lovelace Respiratory Research Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice Riken (Japan) RBRC00806 GFP-LC3#53
Xylazine Henry-Schein 568-0606 Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine Henry-Schein 995-2949 Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH Fisher A405-20 Histology Grade
EtOH Fisher A407-1 For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0 Owens & Minor 2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl Henry-Schein 614-5157 Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution JT Baker S898-09
xylenes Fisher X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody Life Technologies G10362
Hoescht Sigma 944403
DAPI Invitrogen D1306
OCT VWR scientific 25608-930
Sudan Black Santa Cruz sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate Electron microscopy Sciences 15960
propylene oxide Sigma 240397
Agar 100 resin Agar scientific R1045
dodecenylsuccinic anhydride Sigma 46346
methylnadic anhydride Sigma 45359
N-benzyldimethylamine Sigma 185582

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
  2. Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
  3. Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
  4. Rivers, E., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. Med, shock.N. .E. ngl.J. . 345, 1368-1377 (2001).
  5. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
  6. Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
  7. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  8. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
  9. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  10. Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
  11. Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
  12. Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
  13. Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
  14. Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
  15. Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
  16. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  17. Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
  18. Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
  19. Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
  20. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
  21. Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
  22. Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).

Tags

Infektion Autophagosom Autophagie Blinddarm-Ligation und Punktion Mäuse Sepsis
Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding,… More

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter