Cecal Ligation och Punktering-inducerad Sepsis som en modell för att studera Autophagy i möss

Summary

Experimentell sepsis kan induceras i möss med användning av cecal ligation och punkteringsmetod (CLP). Nuvarande protokoll för att bedöma autophagy in vivo i samband med CLP-inducerad sepsis presenteras här: Ett protokoll för mätning av autophagy med användning av (GFP)-LC3 möss, och ett protokoll för att mäta autophagosome bildning genom elektronmikroskopi.

Abstract

Experimentell sepsis kan induceras i möss med användning av cecal ligation och punkteringsmetod (CLP), som orsakar polymikrobiella sepsis. Här är ett protokoll som att framkalla sepsis av varierande svårighetsgrad hos möss med hjälp av kommandotolken tekniken. Autophagy är en grundläggande vävnadssvaret på stress och patogen invasion. Två strömprotokoll för att bedöma autophagy in vivo i samband med experimentell sepsis presenteras också här. (I) Transgena möss som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP)-LC3 fusionsprotein utsattes för CLP. Lokaliserad förstärkning av GFP-signal (puncta), som analyserades antingen genom immunohistokemiska eller konfokala analyser kan användas för att detektera ökad autophagosome bildning och sålunda ändras aktiveringen av autophagy reaktionsväg. (II) Förstärkt autophagic vakuolen (autophagosome) bildande per enhetsvävnadsområde (som en markör för autophagy stimulering) kan kvantifieras med hjälp av elektronmikroskopi. Studien av autophagic svar till sepsis är en kritisk komponent av att förstå de mekanismer genom vilka vävnader svarar på infektion. Forskningsresultat inom detta område kan i slutändan bidra till ökad förståelse för uppkomsten av blodförgiftning, vilket är ett stort problem inom intensivvård medicin.

Introduction

Sepsis, en systemisk inflammatorisk reaktion på infektion, är en ledande dödsorsak i kritiskt sjuka patienter ^1. Intraabdominella infektioner, ofta leder till polymikrobiella sepsis, står för 20% av sepsis, som har betydande dödlighet på upp till 60% ^2. Sepsis-associerad dödlighet resulterar i första hand från multiorgandysfunktion med efterföljande organsvikt ^3,4. Ytterligare utredning av patogena mekanismen av denna sjukdom krävs snarast för att främja utvecklingen av nya och mer effektiva behandlingar.

Den cecal ligation och punktering (CLP)-metoden är ett vanligt använt förfarande för modellering sepsis in vivo. Som blindtarmen är full av bakterier, dess punkterings leder polymikrobiella peritonit, translokation av bakterier i blodet (bakteriemi), septisk chock, flerorgandysfunktion och slutligen död ^5. Det är allmänt accepterat att CLP avspeglar kliniskverkligheten mer exakt än tidigare tekniker, såsom injektion av endotoxin eller renade bakterier i gnagare, alltså CLP anses guldmyntfoten (om än inte utan begränsningar) ⁶ för experimentell induktion och därmed utredningen av patogenesen av sepsis. I denna monografi, beskriver vi protokoll som syftar till att bedöma om patogena mekanismer för sepsis inkluderar autophagy.

Autophagy, ett evolutionärt bevarat cellulär process, underlättar omsättningen av skadade proteiner och organeller såsom mitokondrier och spelar en viktig roll vid clearance av intracellulära patogener, inklusive bakterier ^7,8. Under autophagy är cytosoliska proteiner eller organeller binds till dubbelmembranbundna vesiklar kallade autophagosomes, som sedan levereras till lysosomer för nedbrytning ^9. Ett antal proteiner har identifierats som de däggdjurshomologer av autophagy relaterade gener (ATG),ursprungligen identifierats i jäst, som reglerar processen med autophagy. Omvandlingen av mikrotubuli-associerat protein-1 lätt kedja 3B (LC3B) (homolog av Atg8) från LC3B-I (fri form) att LC3B-II (fosfatidyletanolamin-konjugerad form) är ett stort steg i autophagosome formation ^9. Autophagic dysfunktion är förknippad med åldrande och mänskliga sjukdomar, inklusive cancer och neurodegenerativa sjukdomar ^10. Dessutom påverkar autophagy medfödd och adaptiv immunitet, såsom antigenpresentation, lymfocytutveckling och cytokinutsöndring av immunceller ^8. Sålunda förefaller det rimligt att autophagy också kan spela en roll i det systemiska inflammatoriska svaret på infektion (dvs sepsis).

Hittills flera förfaranden har beskrivits för att utvärdera rollen av autophagy i vävnadsskada in vivo. Dessa inkluderar användning av grönt fluorescerande protein (GFP)-LC3 uttrycker möss och kvantifiering av autophagosomes i vävnad genom elektronmikroskopi (dessa två metoder beskrivs i denna monografi). Ytterligare metoder innefattar kvantifiering av autophagic proteinuttryck i vävnadshomogenat, och analysen av autophagic flussmedel (som beskrivits på annat ställe) ^11-13. Målet med denna översyn är att ge nuvarande protokoll för bedömning autophagy in vivo i samband med experimentell sepsis.

Protocol

Obs: Institutional Animal Care och användning kommittén vid Brigham and Women sjukhus / Harvard Medical School Area godkände följande procedurer.

1. Cecal Ligation och Punktering

Använd möss av samma bakgrund (C57BL / 6), hane, 8-10 veckor gamla. Kvinnliga möss är mer resistenta än män mot sepsisinducerad dödlighet. Möss äldre än 8 veckor producerar mindre varierande resultat än yngre möss när det gäller överlevnad efter CLP. Cirka N = 10 möss per jämfört grupp bör användas för överlevnadsanalys. N = 3-5 möss är adekvat för autophagy analyser.

1. Använda sterila små kirurgiska instrument (det vill säga skalpell, sax och trubbiga anatomiska pincett), som bör vara lämpliga för gnagare kirurgi.
2. Förbered anestesi blandning: Till 7,95 ml PBS lägga 150 pl av xylazin (AnaSed injektion 100 mg / ml) och 700 pl av Ketamine (Ketaset   CIII, 100 mg / ml).
3. För att säkerställa aseptiska förhållanden under förfarandet, handskar, ansiktsmask och operationsrock.
4. Väg djur. Bedöva dem genom injektion intraperitonealt (ip) i blandningen som nämns i steg 3 i en dos av | il (10x kroppsvikt i g). Till exempel för en mus som väger 22 g, administrera 10x22 = 220 | il av den anestetiska blandningen. Sålunda är de slutliga doserna av xylazin och ketamin är 17 och 80 mg / kg kroppsvikt, respektive. Se till att anestesin är tillräcklig, ingen böjning av extremitet bör produceras efter tå nypa Anm. Använd oftalmologiska salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
5. Placera djur på en ren arbetsyta på ryggen. Tails och baktassarna inriktad utredaren. Desinficera bukhuden använda alkohol (70% EtOH-lösning) Anm. Kirurgiskt område bör helt rakat, för att undvika kontaminering av såret genom kontakt medpäls. Också optimalt, en cirkulerande varmvatten pad ska användas för att upprätthålla normotermi av sövda möss under operationen.
6. Genom att använda en skalpell, gör ett litet längd hud snitt parallellt och ca 1 cm kvar till mittlinjen. Inte penetrera ännu in i peritonealhålan. Använd en liten sax för att låta det planerade snittet.
7. Identifiera magmusklerna och dissekera dem för att komma in i bukhålan.
8. Genom att använda trubbiga anatomiska pincett, identifiera blindtarmen och flytta den ut ur bukhålan. Var försiktig så att du inte skadar mesenterial blodkärl (detta kan leda till dödlig blödning).
9. Ligera 60% av blindtarmen för att åstadkomma en mid-grade sepsis. Ligering lika med eller mer än 75% av blindtarmen i allmänhet resulterar i hög kvalitet sepsis, medan ligering lika med eller mindre än 25% av blindtarmen ger låggradig sepsis. Var noga med att inte ligate ileocecal ventilen (detta kan blockera tarm kontinuitet).
10. Genom att använda en21 G nål, perforera blindtarmen genom ett genomgående och genom punktering (två hål) nära till ligering. Riktningen för perforering bör vara från mesenteriska till anti-mesenteriala sidan av blindtarmen. Var noga med att inte punktera mesenterial blodkärl.
11. Ta bort nålen. Tryck försiktigt på ligerade blindtarmen för att bekräfta öppenhet genom de två hålen, endast en liten mängd avföring ska pressas igenom dem.
12. Flytta ligerade och punkterade blindtarmen in i bukhålan.
    Obs: För bluff möss, hoppa över steg från 1,10 till 1,12.
13. Använd silke kirurgiska suturer 6-0 med skärande nål för att stänga bukmuskulaturen. Använd silke kirurgiska suturer 6-0 med skärande nål för att stänga buken hud.
14. Injicera 1 ml förvärmd (37 ° C) normal saltlösning ip att ersätta värme-och vätsketillförsel förloras under förfarandet. Placera möss under en värmelampa tills deras återupplivning Anm. Optimalt en säkrare värmande enhet (sulm som ett cirkulerande varmvattendyna) kan användas i stället för en värmelampa.
15. Postoperativt injicera buprenorfin (0,05 mg / kg kroppsvikt fm.) För att uppnå smärtlindring. Notera: Ett djur bör inte lämnas utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Ett djur som har genomgått en kirurgisk behandling bör inte återlämnas till bolaget för andra djur förrän återhämtat sig helt.
16. Placera djuren tillbaka i sina burar med obegränsad tillgång till mat och vatten. Möss kommer att avlivas när de blir döende (indikeras av kliniska tecken såsom underlåtenhet att röra vid beröring eller cyanos). Kontrollera möss var 4 timmar för att slippa dem dör före eutanasi.

2. Tissue Harvest och Fixering

1. Förbered en 4% paraformaldehyd (PFA) lösning: Till 889 ml PBS till 111 ml 37% PFA.
2. Sacrifice möss med antingen _{CO2-inducerad} narkos eller ketamin / Xylazine sÖSNING i en hög dos.
3. Immobilisera mössen på en ren arbetsyta. Spraya buk och bröstkorg hud med 70% EtOH-lösning för att desinficera det.
4. Använd en skalpell och en liten sax för att avlägsna buk-och bröst huden samt det hudtäckande trakeala området.
5. Avslöja luftstrupen genom att ta bort dess omgivande vävnader (muskler och bindväv).
6. Placera en sutur (utan att skära nål) runt luftstrupen. Dra inte åt den ännu.
7. Använd en liten perifer venkateter (20 G) till "intuberas" luftstrupen. Var försiktig under katetrar för att undvika trakeal tår. Lägg märke till att den största diametern hos luftstrupen är strax under krikoidbrosket.
8. Dra åt sutur runt luftstrupen / kateter. Ta bort nålen lämnar endast plastkanyl av katetern i luftstrupen. Needle tjänade endast som en guide-tråd för att sätta in kanylen.
9. Efter att ha säkrat kanylen i luftstrupen, skära the bukmuskulaturen, öppna buken och avslöjar membranet.
10. Med hjälp av en kanyl, punktera membranet att producera pneumothorax (dvs införing av luft i pleurahålan). Lungor bör därefter kollapsade.
11. Med hjälp av en liten sax, ta bort membranet, skär längs bröstbenet (sternotomy), ta bort bröstkorgen och avslöja hjärtat och lungorna.
12. Genom plastkanyl införes i luftstrupen, fixa lungorna med formaldehydlösning under 30 cm _H2O tryck.
13. Ta lungorna och placera dem i 4% PFA i 24 timmar och därefter i 70% EtOH-lösning till dess bearbetning.
14. Identifiera och ta bort hjärta, lever och njurar. På samma sätt, placera dem i 4% PFA under 24 h och därefter i 70% EtOH-lösning till dess bearbetning.

3. GFP Möss och visning av GFP Slides

1. Utför CLP och bluff kirurgi på GFP-LC3 möss som beskrivs i steg 1, och postoperativ förfarandes enligt beskrivningen i steg 2 i protokollet.
2. Bädda vävnader (dvs lungor, hjärta, lever och njurar) i paraffin och skär dem i serie 5 ìm sektioner.
3. När klar för GFP färgning, inkubera vid 60 ° C i 30-60 min tills paraffin smälter och vävnader visas genomskinlig.
4. Avparaffinera med standard graderad serie av xylen eller xylensubstitut, 5 min xylen en, xylen 2 och xylen 3 sedan 3 min inkubationer i graderad serie EtOH: 100%, 95%, 75% och sedan skölja i destillerat vatten.
   OBS: Efter Avparaffinering undvika vävnads uttorkning, vilket ökar prov bakgrund.
5. Utför antigenåtervinning med användning av citronsyrabuffert (10 mM natriumcitrat-syra, 0,05% Tween 20, pH 6,0), genom mikrovågsugnen under 10-20 min. Var noga med att byta buffert jämna mellanrum för att undvika vävnads uttorkning.
6. Låt lösningen svalna i 20 minuter på bänken för att slutföra antigenåtervinning.
7. Tvätta 2-3x med PBS. Ta bort överflödig buffert och transfer glider från rack till horisontellt läge i en bild låda eller annan fuktig kammare för att förhindra uttorkning.
8. Block 45-60 min vid rumstemperatur med 10% normal donkey serum (även 5% bovint serumalbumin, eller företrädesvis serum från djuret i vilket den sekundära antikroppen genererades) i PBS.
9. Inkubera proverna i primär GFP-antikropp vid 1:100 utspädning i PBS över natt vid 4 ° C i fuktad kammare. Försiktigt tillämpa små bitar av Parafilm över vävnad med antikropp för att främja homogen kontakt med vävnaden och förhindra avdunstning.
   Anm: återstående stegen utförs vid rumstemperatur.
10. Tvätta 5x med PBS för att avlägsna överskott av primär antikropp. Inkubera med sekundär antikropp 1:500-1:1,000 i PBS under 1-2 timmar vid rumstemperatur.
11. Tvätta 5x med PBS för att avlägsna överskott av sekundär antikropp. Om så önskas, motfärga bilderna i detta steg.
12. Om du använder fluorescerande sekundär antikropp, inkubera 0,1% Sudansvart i 70% EtOH feller 15-20 min för att minska autofluorescens. Torka bort överskott av Sudan Black från runt vävnaden och tvätta 5x med PBS under 20 min.
13. Montera prov med täckglas och förvara horisontellt, tills monteringslösning har satt.

4. Alternativ protokoll: Direkt detektion av GFP-LC3

1. Kanylera och blåser lungorna med en ~ 500 ml av en 50/50 volym / volym oktober PBS.
2. Bädda in i oktober, genom att sätta en liten mängd av oktober i botten av en cryomold.
3. Placera försiktigt dissekerade lungkomplexet i formen.
4. Långsamt fryser metylbutan kyld med torris.
5. Lägg mer oktober tills vävnaden är helt täckt och fryst fast. Förvara på torr is och förvara vid -80 ° C.
6. Med hjälp av en cryomicrotome, skär 5-10 mikrometer tjocka sektioner skyddar avsnitten från ljus. Förvara sektioner och resterande vävnad vid -80 ° C.
7. För att förbereda bilder för bildbehandling, ta bort avsnittet ur frysen och genast tillämpa en droppe PBS för att förhindra uttorkning.
8. Fix för 30 min med 4% PFA. Tvätta med PBS.
9. Applicera DAPI / Hoescht under 10 min. Tvätta 3x med PBS.
10. Montera prov med täckglas och förvara horisontellt, tills monteringslösning har satt.
11. Bild med epifluorescence eller konfokalmikroskop. Förvara proverna vid 4 ° C i upp till en månad.

5. Beredning av Mjukpapper för elektronmikroskopi

1. Skär vävnader i ca 1 mm kuber för fastställande.
2. Fäst vävnad i 2% formaldehyd, 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylat-buffert, pH 7,4.
3. Tvätta med 0,1 M natrium-kakodylat buffert under 1-2 timmar.
   Anmärkning: Fast vävnad kan lagras i 0,1 M natriumkakodylat vid 4 ° C.
4. Post fix i 1% osmiumtetroxid i 0,2 M natriumkakodylat-buffert under 1 timme.
5. Skölj i 0,2 M natriumkakodylat-buffert under 10 min 3x.
6. Torka i 70% EtOH, 20 min 2x. Torka i 90% EtOH, 10 min 2x. Torka i 100% EtOH,20 min 2x.
7. Inkubera med propylenoxid (epoxipropan) under 10 min 2x.
8. Inkubera med propylenoxid / epoxiharts-blandning (50:50) under 1 timme. Hartsblandningen epoxi är: 24 g Agar 100 harts, 13 g dodecenylsuccinic hydrid, 13 g methylnadic anhydrid och 1 ml N-bensyldimetylamin. Blanda väl i en disponibel bägare med en träspatel.
9. Inkubera med epoxiharts över natten i icke-begränsade flaskor (detta gör att eventuella kvarvarande propylenoxid avdunsta).
10. Bädda in märkta kapslar med nygjord harts. Polymerisera vid 60 ° C under 48 timmar.
11. Photograph vävnadssektioner med användning av ett transmissionselektronmikroskop vid 80 eller 60 kV på elektronmikroskopfilm. Skriv ut bilderna på fotopapper eller lagra som digitala medier.
12. Analysera autophagosome bildning i intakta celler innehållande kärnan. Låg effekt fält (e. G. 2000-4000 X) kan användas för att identifiera kärnförsedda celler. Normalt 6,800-10,000 X bilder används för thär autophagosome kvantifiering. Räkna autophagosomes per ytenhet 15-30 fält för lämplig statistisk representation. Autophagosomes har dubbla membranstruktur, där sena skede autophogosomes liknade fyllda vakuoler.

Representative Results

Bakteriemi finns i möss så tidigt som 6 h efter CLP-inducerad sepsis ^14. Kliniska tecken på sepsis (inkluderande frossa takypné och försämrad motorisk aktivitet) att framträda ungefär 12 timmar efter ingreppet. Möss som utsätts för CLP börjar dö på runt 18 timmar efter induktion av peritonit. Ju allvarligare är sepsis desto mer ökas är leta ^15. I detalj, orsakar hög kvalitet sepsis 100% dödlighet inom 2-3 dagar, medan mitten-grade sepsis leder till cirka 60% dödlighet vid 7 dagar efter CLP (bortom denna tidsgräns, inga dödsfall förväntas) (Figur 1). Däremot bör dödligheten av falska möss vara noll

Figur 1. Överlevnadskurvor efter CLP av olika svårighetsgrad i möss. C57BL / 6 möss utsattes för skenkirurgi eller CLP-inducerad sepsis av olika svårighetsgrad genom att justera ligering hålla konstant antalet perforeringar till blindtarmen (dvs. en "genom-och-through" punktering (två hål) med en 21 G nål ). Ligering av 60% av blindtarmen resulterar i en mid-grade sepsis, vilket leder till cirka 60% mortalitet vid 7 dagar efter CLP. Ligering av ≥ 75% av blindtarmen ger höggradig sepsis och därefter i 100% dödlighet inom 2-3 dagar efter CLP, medan, ligation av ≤ 25% av blindtarmen leder i låggradig sepsis och därmed i nästan noll dödlighet. Typiska överlevnadsresultat visas.

Vid tillämpningen av de autophagy studier, valde vi att genomföra en CLP-modell av mellankvalitet sepsis. Låg kvalitet sepsis kan vara otillräckliga för att framkalla autophagy, medan högvärdigt sepsis kan leda till tidig dödlighet hos möss (före induktion av autophagy).

ve_content "> För att analysera autophagy har vi använt transgena möss som uttrycker GFP-LC3 fusionsprotein utsattes för de tidigare nämnda sepsis protokoll. För behandlingsförfaranden, som resulterar i stimulering av autophagy pathway, förväntas det att det kommer att vara lokaliserad förstärkning av GFP-signal ( puncta), som analyserades antingen genom immunhistokemiska eller konfokala analyser tyder på förbättrad autophagosome bildning ^16.

Figur 2. GFP avbildning in vivo och in vitro. (A, B) Representativa exempel på GFP avbildning i mus organ (t.ex. njure) som erhållits från GFP-LC3B möss. Bilden visar GFP-LC3 puncta i glomeruli i njurvävnad som erhållits från obehandlade möss. Skalstrecken = 10 mm. ( C, D) Ytterligare data finns för att illustrera in vitro GFP-LC3 avbildning. Primära mesangiala celler isolerades från GFP-LC3 transgena möss genom att använda ett protokoll för cellisolering från genetiskt modifierade möss som tidigare beskrivits. ¹⁷ Cellerna inkuberades i frånvaro (C) eller närvaro (D) av TGF-β1 (2 ng / ml) under 24 h såsom beskrivits tidigare ^18. Behandling med TGF-β1 ökade överflödet av autophagosomes (grön puncta). Klicka här för att visa en större bild.

Detta kan testas ytterligare genom klassiska ultra analys med hjälp av elektronmikroskopi, som beskrivs i protokollet. Det förväntas att vävnadssnitt som erhållits från septiska möss eller andra modeller vävnadsskada skulle visa förbättrad autophagic vacuole (autophagosome) bildas per enhet vävnadsområde.

e_content "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
Figur 3. Elektronmikroskopi av autophagosome bildning. En representant mikroskop av tidiga och sena skedet autophagosome bildning i lungvävnad tas från C57BL / 6 möss utsattes för mid-grade CLP (60% ligation, 21 G, 2 hål). Εarly scen autophagosomes har en dubbelmembranstruktur (pil), medan sent skede autophagosomes likna en fylld vacuole (pilspets). M betecknar mitokondrier. Scale bar = 1 um. En representant kontroll bilden visas i lungvävnad från C57BL / 6 möss som utsätts för simulerad operation. Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Den stora fördelen med CLP är att det tillåter forskare att undersöka sepsis av olika svårighetsgrader (dvs. från låg-till mitten och hög kvalitet). Allvarlighetsgrad av inducerad sepsis påverkas av längden på blindtarmen ligeras (som den viktigaste faktorn), storleken på nålen som används för punktering och antalet hål utfört ^15. Dessutom kan musen stam och kön påverka svårighetsgraden av sepsis, flera stammar är mer mottagliga än andra och män är generellt mer känsliga än honorna ^19,20. Ovanstående faktorer som tillsammans bestämmer CLP-inducerad dödlighet.

Baserat på vår erfarenhet, det finns en skillnad mellan utredare när det gäller uppnått CLP-inducerad dödlighet. . Exempelvis et al använde Rittirsch 50% ligation, 21 G, 1 "genom-och-genom" punktering (två hål) för att uppnå en 60% dödlighet ^15, en utredare i vår forskargrupp behoved för att använda en något mer allvarlig modell (60% ligation, 21 G, 1 "genom-och-genom" punktering) för att erhålla samma dödlighet, medan en annan utredare i vår forskargrupp använde en mer allvarlig modell (nära 100% ligation , 19 G, 1 "genom-och-genom" punktering) för att uppnå en mycket lägre dödlighet (endast 25%). Med ovanstående överväganden i åtanke, skulle man kunna hävda att den karakterisering av allvaret i CLP (dvs. låg-, medel-eller hög kvalitet sepsis) bör göras i efterhand (det vill säga genom att titta på den resulterande dödlighet) i stället prospektivt (dvs. genom att tillämpa vissa förutsättningar, till exempel 50% ligation). När en operatör uppnår en dödlighet på cirka 60%, då är detta mid-grade sepsis, oavsett vilka villkor (såsom längd blindtarmen ligeras och antal hål utförts) genomförs. Således verkar det rimligt att operatören prova olika förutsättningar för att identifiera dem som gäller 60% av mössen dör. Då operatörenhar att genomföra exakt samma villkor i båda grupperna som jämförs.

Genom att implementera exakt samma villkor (t.ex. längden på blindtarmen ligeras, storlek på nål som används för punktering, antal hål utförda, musen stammen, och kön), det förväntas att konsekventa och reproducerbara resultat kommer att produceras ^15. Men även efter prestanda CLP på ett standardiserat sätt (med beaktande av ovanstående bestämningsfaktorer), kan variationer förekomma. Det har erkänts av experter att "även om identiska förolämpningar ges till identiskt åldrarna djurgrupper - även från samma kull - en variabel individuell effekt kan ses" ^6. Således, i försök att minska variabiliteten, verkar det rimligt att operatören utför CLP i båda jämförda grupperna på samma dag.

Analysen av autophagy, en dynamisk cellulär process, är komplex. De protokoll som beskrivs i detta monograph ligga till grund för beräkning av autophagy aktivering in vivo, baserat på biokemisk eller morfologisk analys av autophagosome bildning. I princip kan de protokoll som anges i detta kapitel tillämpas på analysen av autophagy i någon organvävnad hos möss som utsätts för CLP eller alternativa modeller av sepsis. Även levern är allmänt accepterat att utgöra ett primärt mål för CLP, kan detta förfarande också orsaka skador på lungorna eller njurvävnad, som är värd ytterligare studier. Effekten av CLP om autophagy av hepatocyter har varit relativt väl studerat i jämförelse med dess effekter på autophagy av njure eller lunga, och några relevanta bevis har nyligen publicerats ^21,22.

Det bör noteras att dessa är statiska åtgärder för autophagy, som ökade autophagosome siffror kan också spegla autophagy dysfunktion genom blockering av lysosomala funktion och slutbearbetningsledet. I detta avseende bör dessa analyser kompletteras med biochemtiska analyser för autophagic substratomsättning (t.ex.   flöde) som nyligen beskrivits och anpassad för in vivo-analyser ^11. Dessa analyser kan också kompletteras med standard Western immunoblotanalys för uttrycket av viktiga autophagy proteiner i vävnad som nyligen beskrivits ^12,13. Sålunda är det rekommenderat att en kombination av dessa tester genomföras för att få en korrekt uppskattning av statusen av autophagy i skadad vävnad ^16.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice	Riken (Japan)	RBRC00806	GFP-LC3#53
Xylazine	Henry-Schein	568-0606	Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine	Henry-Schein	995-2949	Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH	Fisher	A405-20	Histology Grade
EtOH	Fisher	A407-1	For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0	Owens & Minor	2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl	Henry-Schein	614-5157	Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution	JT Baker	S898-09
xylenes	Fisher	X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody	Life Technologies	G10362
Hoescht	Sigma	944403
DAPI	Invitrogen	D1306
OCT	VWR scientific	25608-930
Sudan Black	Santa Cruz	sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate	Electron microscopy Sciences	15960
propylene oxide	Sigma	240397
Agar 100 resin	Agar scientific	R1045
dodecenylsuccinic anhydride	Sigma	46346
methylnadic anhydride	Sigma	45359
N-benzyldimethylamine	Sigma	185582