Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Onderzoek naar de effecten van probiotica op Pneumococcal Kolonisatie Met behulp van een Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

In vitro kan hechting assays worden gebruikt om de hechting van Streptococcus pneumoniae onderzoeken naar cel monolagen epitheliale en mogelijke acties zoals het gebruik van probiotica voor het remmen pneumococcal kolonisatie onderzoeken.

Abstract

Hechting van Streptococcus pneumoniae (pneumokok de) de epitheliale bekleding van de nasofarynx kan resulteren in kolonisatie en wordt beschouwd als een voorwaarde voor pneumococcen infecties zoals longontsteking en otitis media. In vitro hechting assays kunnen worden gebruikt om de hechting van pneumococcen studie naar cel epitheliale monolagen en mogelijke acties, zoals het gebruik van probiotica onderzoeken tegen pneumokokken kolonisatie remmen. De hier beschreven protocol wordt gebruikt om de effecten van de probiotische Streptococcus salivarius de hechting van pneumococcen de humane epitheel cellijn CCL-23 onderzocht (soms aangeduid als HEp-2 cellen). De test bestaat uit drie stappen: 1) de voorbereiding van epitheliale en bacteriële cellen, 2) toevoeging van bacteriën om celmonolagen epitheliale, en 3) de detectie van aanhangend pneumokokken door kiemgetal (seriële verdunning en plating) of kwantitatieve real-time PCR (qPCR ). Deze technique is betrekkelijk eenvoudig en niet gespecialiseerde apparatuur anders dan een weefselkweek setup nodig. De test kan worden gebruikt om andere probiotische soorten en / of potentiële remmers van pneumokokken kolonisatie testen en kan eenvoudig worden aangepast aan andere wetenschappelijke vragen over pneumokokken hechting en invasie te pakken.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pneumokok het) is een Gram-positieve bacterie die infecties zoals longontsteking, middenoorontsteking en hersenvliesontsteking kan veroorzaken. Het is een belangrijke oorzaak van ziekte bij kinderen in landen met lage inkomens en verantwoordelijk voor naar schatting 800.000 sterfgevallen van kinderen onder de leeftijd van vijf jaar 1. Pneumokokken worden vaak gedragen in de nasofarynx van jonge kinderen. Hoewel dit kolonisatie algemeen beschouwd asymptomatisch het vooraf pneumococcen infectie en dient als reservoir voor de bacteriën in menselijke populaties 2. Pneumokokkenvaccinatie vermindert effectief vervoer van de serotypen die in het vaccin. Er zijn meer dan 90 pneumokokkenserotypen en vaccinatie kan leiden tot serotype vervangen, waardoor de eliminatie van vaccinserotypen wordt gevolgd door een stijging in vervoer en ziekte veroorzaakt door nonvaccine serotypen 3. Ook in sommige hoog-risicogroepen, pneumokokkenkolonisatie komt vaak heel vroeg in het leven, vóór de toediening van de eerste dosis vaccin: 4,5. Onlangs is het gebruik van probiotica voorgesteld als aanvullende strategie pneumokokken kolonisatie 6,7 remmen. In vitro hechting assays werden gebruikt om pneumococcen hechting 8,9 onderzocht. Deze testen zijn aangepast om het effect van de probiotische Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) op pneumokokken hechting 10 onderzoeken.

Naast LGG en andere melkzuurbacteriën, Streptococcus salivarius, een gemeenschappelijk ingezetene van de mondholte, is onderzocht als een potentiële probiotische de luchtwegen vanwege de kolonisatie potentieel en het vermogen om pneumokokken en andere respiratoire pathogenen in vitro te remmen 11 - 13. De hier gepresenteerde protocol beschrijft een hechting assay gebruikt om de effecten te onderzoeken van S. salivarius K12 op pneumokokken aanhankelijkheidde humane epitheel cellijn CCL-23. Voor gebruik in de assay, werden pneumococcen isolaten onderzocht op hechting mogelijkheden, zoals groei en hechting eigenschappen hoofdzaak onder isolaten 10,14 variëren. Groeicurven van pneumokokken en S. salivarius uitgevoerd om mid-log fase en schatting concentratie (kolonie vormende eenheden of CFU / ml) bepaald door optische dichtheid (OD figuur 1). Het wordt aanbevolen om de groei onderzocht door kiemgetal en OD voor elk isolaat voor gebruik in de assay. Deze test kan worden uitgevoerd in elk laboratorium met standaard weefselkweek faciliteiten en apparatuur. In dit protocol, de effecten van de drie doses van S. salivarius toegediend 1 uur voorafgaande aan de toevoeging van pneumokokken op de hechting van S. pneumoniae PMP843, een serotype 19F wagen isolaat afkomstig van een nasofarynxuitstrijk, worden onderzocht. Twee verschillende manieren om aanhangend pneumokokken kwantificeren worden gepresenteerd: plating op bloed agar om af te schrikkenmijn rendabel telt, en DNA-extractie en detectie van de pneumokokken lytA gen door qPCR 15. De basis hechting assay protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende doses of het tijdstip van toediening van probiotica testen en kunnen ook worden gebruikt met andere bacteriële stammen of soorten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van epitheliale cellen en bacteriële

  1. Ontdooien van CCL-23 epitheelcellen
    1. Voorverwarmen Minimum Essential Media (MEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) in een 37 ° C waterbad gedurende ~ 30 minuten.
    2. Steriliseer de weefselkweek goedgekeurd bioveiligheid kast met UV-licht gedurende ten minste 10 minuten voor gebruik, en vegen van de werkruimte met 70% ethanol. Veeg de verwarmde media fles met 70% ethanol en plaats in bioveiligheid kast.
    3. Met behulp van een pipet 25 ml, breng 14 ml van de media in een T-75 kolf. Plaats kolf in 37 ° C incubator terwijl cellen ontdooien (paragraaf 1.1.4).
    4. Verwijder een flacon van CCL-23 cellen van vloeibare stikstof opslag met behulp van passende veiligheidsmaatregelen en warm in een 37 ° C waterbad tot ~ 80% ontdooid.
    5. De terugkeer van de bereide in punt 1.1.3 van de bioveiligheid kast kolf. Veeg buitenoppervlak van injectieflacon CCL-23 cellen met 70% ethanol en inhoud overdracht (1 ml) in het T-75 Kolf met een P1000 pipet.
    6. Incubeer de kolf zijn kant in een 37 ° C, 5% CO2, 95% relatieve vochtigheid weefselkweek incubator overnacht (16-20 uur).
    7. Controleer de cellen onder een microscoop om een ​​gezonde morfologie bevestigen, verwijder media, en te vervangen door 15 ml verse, voorverwarmde MEM + 10% FBS.
  2. Onderhoud van CCL-23 epitheelcellen
    1. Zodra cellen ~ 80% confluent (1-2 dagen), passage door het verwijderen van media met een pipet 25 ml en voorzichtig was de cellen tweemaal met 8-10 ml voorverwarmde met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een 10 ml pipet.
    2. Verwijder de PBS en voeg 1 ml steriel 0,25% trypsine-EDTA (0,25% (gew / vol) trypsine, 0,1 mM EDTA). Schakel fles op zijn kant draaien zorgen trypsine omvat de confluente laag cellen en incubeer de kolf gedurende 2-3 min in 37 ° C, 5% CO2 incubator.
    3. Terug kolf met het bioveiligheid kast, voeg 9 ml voorverwarmd MEM + 10% FBS en pipet op en neer 6 -8x om de cellen opnieuw in suspensie, het uitwerpen van vloeistof langs de zijkant van de kolf om cellen te verwijderen.
    4. Split cellen 01:15 (1 ml + 14 ml MEM + 10% FBS) of 1:30 (0,5 ml + 14,5 ml MEM + 10% FBS), gooi overtollige cellen en terug kolf met het 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
    5. Passage van de cellen ten minste tweemaal voor gebruik met de hechting assay. Typisch cellen worden gesplitst om de 3-4 dagen.
  3. Zaaien van CCL-23 epitheelcellen (een dag voor assay, Protocol 2 therapietrouw)
    1. Split confluente cellen zoals beschreven in paragrafen 1.2.1-1.2.3, opnieuw suspenderen in voorverwarmde MEM + 5% FBS (FBS-concentratie wordt verlaagd tot de waarschijnlijkheid van serum bestanddelen te mengen in de test te verminderen). Verwijder 20 pi cellen en tel met trypan blauw kleuring en een hemocytometer.
    2. Verdun cellen voorverwarmd MEM + 5% FBS tot een concentratie van 1,5 x 10 5 cellen / ml in een steriele buis van 50 ml.
    3. Zaad 1 ml cellen / putje in een weefsel-Cultuur behandelde 24-well plaat.
  4. Bereiding van bacteriën
    Deze procedure kan worden gevolgd voor de voorbereiding van pneumokokken en S. salivarius. Bacteriegroei media wordt meestal gehouden in een 37 ° C incubator 's nachts tot voorverwarmen en test voor steriliteit (algemeen wordt troebel als verontreinigd).
    1. Twee dagen vóór de test strook bacteriën op paardenbloed agar (HBA) platen hechting en incuberen bij 35-37 ° C en 5% CO2 gedurende 18-24 uur. Schapen agar kan worden gebruikt als alternatief.
    2. De volgende dag, bereiden een overnachting cultuur voor elke bacteriesoort door pipetteren 10 ml Todd-Hewitt bouillon met 0,5% gistextract (THB + YE) medium in een steriele 30 ml buis. Met behulp van een 10 ul lus, te enten ongeveer 10-12 goed gescheiden kolonies. Kort vortex en incubeer bij 35-37 ° C en 5% CO2 gedurende 14-16 uur. Merk op dat pneumokokken zal autolyze als links te lang in bouillon cultuur.

    2 Hechting Assay:. Toevoeging van bacterie tot celmonolagen epitheliale

    1. Voorbereiding van de mid-log bacterieculturen van pneumokokken en S. salivarius
      1. Pipetteer 10 ml van de voorverwarmde THB + YE in elk van de twee steriele 30 ml buizen, een label pneumokokken en de andere S. salivarius.
      2. Tot mid-log-fase te bereiken, pneumokokken vereisen ~ 3 uur en S. salivarius vereisen ~ 2 uur incubatie (zie figuur 1). Begin beide culturen tegelijk. Vortex (3-5 sec) overnacht bacterieculturen en voeg 100 ul pneumokokken en 100 pl S. salivarius in overeenkomstige buizen.
      3. Kort vortex en incubeer de kweken bij 37 ° C gedurende ongeveer 2 uur voor S. salivarius en 3 uur voor pneumokokken.
    2. Voorbereiding van de CCL-23 cellen voor de naleving assay
      1. Met behulp van een omgekeerde microscoop, controleer dan de 24-wells plaat voor confluent monolagen met gezonde celmorfologie. Monolagen moet> 80% confluent zijn, zonder bewijs van cellen klonteren of cytopathische effecten zoals celronding of verlies van hechting (zie figuur 2).
      2. Verwijder de media in elk putje met behulp van een overdracht pipet, het kantelen van de plaat iets te verstoren de cel monolaag.
      3. Om voorzichtig wassen van de cellen, voegt ~ 500 ul voorverwarmde PBS in elk putje met behulp van een serologische pipet en verwijder het met een transfer pipet, het kantelen van de plaat lichtjes. Gooi de PBS. Herhaal eenmaal wasstap.
      4. Voeg 500 ul voorverwarmde MEM + 5% FBS in elk putje. De terugkeer van de 24-wells plaat met de CO 2 incubator, terwijl de voorbereiding van de bacterieculturen.
        Opmerking: Om de exacte CCL-23 cel nummer bepalen voor multipliciteit van infectie (MOI), kunnen twee putten worden getrypsineerd en geteld op de dag van de infectie.

    3. Hechting Assay

    1. Pneumokokken Toevoegen aanCCL-23 cellen bij een MOI ~ 10:01. Test de in tabel 1 opgesomd in duplo omstandigheden.
      1. Meet de optische dichtheid bij 600 A (OD) van 1 ml S. salivarius cultuur. OD moet tussen 0,3-0,6.
      2. Transfer 5 ml van S. salivarius cultuur in een 10 ml buis en centrifugeer bij 1870 xg gedurende 4 minuten.
      3. Verwijder het supernatant en gebaseerd op de OD lezen in paragraaf 3.1.1, resuspendeer S. salivarius in 200-1000 ui 0,85% NaCl (eindconcentratie ~ 1,5 x 10 9 CFU / ml). Als een algemene richtlijn, zal een OD van 0,375 worden gesuspendeerd in 260 pl. Bereid 1:10 en 1:100 verdunningen van S. salivarius met 0,85% NaCl.
        Opmerking: In totaal drie concentraties (die hoge, middelmatige en lage doses) van S. salivarius worden getest in de assay. De hoge dosis is een verhouding van ~ 10 S. salivarius: 1 pneumokokken, het medium is ~ 1 S. salivarius: 1 pneumokokken, en de lage is ~ 1 S. salivarius: 10 pneumokokken.
      4. Neem de 24-wells plaat uit de incubator.
      5. Van de heparine controleputjes, verwijderen 40 pl media en voeg 50 ul heparine (1000 U / ml voorraad concentratie) voor een eindconcentratie van 100 U / ml.
      6. Voeg 10 ul van 0,85% NaCl aan putjes die slechts CCL-23 cellen en putjes die CCL-23 cellen en pneumococcen (geen S. salivarius).
      7. Voeg 10 ul van onverdunde, 1:10 en 1:100 van S. salivarius respectievelijke putjes.
        Opmerking: S. salivarius kan ook worden toegevoegd op hetzelfde tijdstip als pneumokokken (coaddition) of 1 uur na pneumococcen (na toevoeging) het effect van tijdstip van probiotische toediening onderzoeken.
      8. Centrifugeer de 24-well plaat bij 114 xg gedurende 3 min bacteriële contact met de cellaag bevorderen en incubeer 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
      9. Voer seriële verdunning van S. salivarius voorraad in 0,85% NaCl en plaat op dubbele HBAplaten voor kiemgetal. Eerste, voeg 50 ul van voorraad tot 450 ul van 0,85% NaCl om een 10 -1 verdunning maken, dan pols vortex (5 sec), verandering tips, en voeg 50 ul van de 10 -1 verdunning tot 450 ul van 0,85% NaCl een 10 -2 verdunning enzovoort tot 10 -7.
      10. Plaat 100 ul van de 10 -5, 10 -6 en 10 -7 verdunningen in tweevoud op HBA wordt verdeeld en met een steriele spreider. Incubeer HBA plaatjes gedurende een nacht omgekeerd bij 37 ° C, 5% CO 2.
      11. Tegen het einde van de 1 uur incubatie, herhaal secties 3.1.1-3.1.3 voor pneumokokken. ODs moet tussen 0,2-0,7. Verminderde snelheid 1 ml pneumokokken cultuur en resuspendeer de pellet in 300-2,000 ui 0,85% NaCl (gebaseerd op de OD lezing) tot een concentratie van ~ 1,5 x 10 8 CFU / ml. Als een algemene richtlijn, zal een buitendiameter van 0.3 worden gesuspendeerd in 500 pi.
      12. Na 1 uur incubatie met S. salivarius, voeg 10 μ; L onverdunde pneumococcen alle putjes behalve negatieve controle putjes (cellen die alleen).
      13. Centrifugeer de 24-well plaat bij 114 xg gedurende 3 minuten en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 3 uur. Voer seriële verdunning van de pneumokokken voorraad in 0,85% NaCl zoals beschreven in paragraaf 3.1.9 en plaat verdunningen 10 -4, 10 -5 en 10 -6 op duplicate HBA platen voor kiemgetal.
    2. Na 3 uur, controleer dan de cellen onder een microscoop om ervoor te zorgen dat monolagen zien er gezond uit (zie figuur 2). Verwijder de media uit elk putje en voorzichtig was de cellen 3x zoals beschreven in paragraaf 2.2.3. met een andere pipet voor elke conditie. Deze stap is essentieel voor hechtende pneumokokken verwijderen. De monolagen mag niet loskomen tijdens het wasproces; dit kan worden bevestigd door opnieuw controle onder een microscoop.

    Opmerking: Media verwijderd tijdens deze stap kan worden opgeslagen bij -20 ° C voor aanvullende analyses (<em> bijv. meting van cytokine niveaus).

    1. Voeg 200 ul van 0,1% digitonine (a mild reinigingsmiddel) aan elk putje en incubeer gedurende 7 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.
    2. Voeg 800 ul van THB medium aan elk putje. Lyse cellen door en neer te pipetteren, en, indien nodig, schraap putten 3-4x met de pipet tip om ervoor te zorgen dat de cel monolaag wordt volledig verwijderd. Wijzig tips tussen putten.
    3. Verwijder de inhoud van elk putje met een P1000 pipet overgebracht in gelabelde microfuge buizen.

    4. Kwantificering van Adherente Pneumokokken

    Aanhangend pneumokokken kan worden gekwantificeerd door het bepalen van levensvatbare tellingen (seriële verdunning en plating op agar) of met behulp van kwantitatieve real-time PCR.

    1. Kiemgetal methode
      Deze methode moet onmiddellijk na stap 3.5 van de naleving test worden uitgevoerd.
      1. Voor elke test goed, bereiden seriële verdunningen van monsters verzameldstap 3.5 van de hechting test door toevoeging van 50 pl monsters 450 ul 0.85% NaCl, pols vortexen en serieel verdunnen zoals beschreven in paragraaf 3.1.9 van de 10 -6 verdunning.
      2. Plaat 100 pl van 10 -3, 10 -4, -5 10 en 10 -6 verdunningen in duplo met bloed agar, gespreid met een steriele spreider en incubeer omgekeerde platen overnacht bij 37 ° C, 5% CO2. Merk op dat de putjes die CCL-23 cellen alleen geen bacteriën bevat en kunnen worden uitgeplaat nette (100 ul onverdund) als steriliteit controle.
      3. De volgende dag, bepalen de pneumococcen inocula door optelling van de kolonies op de juiste verdunning platen (bevattende 30-300 kolonies) bereid in paragraaf 3.1.13 van de hechting assay. Bereken de CFU / ml van de inocula met de gemiddelde waarde van twee platen. Evenzo bepaalt de S. salivarius inocula door optelling van de kolonies op de platen bereidin paragraaf 3.1.10.
        Opmerking: De platen moeten pneumokokken uitsluitend bevatten; de aanwezigheid van andere soorten geeft aan dat de test werd besmet en resultaat ongeldig.
      4. Om de pneumokokken hechting te bepalen, tel de juiste verdunning plaat (met 30-300 pneumokokken kolonies) voor elk opgesteld in paragraaf 4.1.1 monster. Merk op dat S. salivarius kolonies klein en wit, terwijl pneumokokken vlak en groenachtig door α-hemolyse wordt, zie figuur 3. om pneumococcen hechting berekening normaliseert het aantal hechtende pneumokokken uit toestand b. CCL-23 cellen + pneumokokken tot 100%, en vergelijk aanhangend pneumokokken van andere aandoeningen aan deze voorwaarde.
    2. qPCR methode
      Monsters in Therapietrouw Assay verzamelde stap 3.5 kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot DNA-extractie. DNA-extractie wordt uitgevoerd met behulp van een commerciële kit en zijn beschreven in delen 4.2.1-4.2.9 en de qPCR alszeggen in secties 4.2.10-4.2.20.
      1. Bereid Enzymatische Lysis Buffer (50 mM fosfaatbuffer pH 6,7 bevattende 1 mg / ml lysozym, 0,075 mg / ml mutanolysine en 2 mg / ml proteinase K). Het volgende recept kan gebruikt worden maken 10 ml (genoeg voor 50 extracties). Enzymatische lysis buffer moet vers worden bereid voor gebruik.

        7,25 ml van 50 mM fosfaatbuffer (pH 6,7)
        1,00 ml 10 mg / ml lysozym voorraad voor een definitieve [1 mg / ml]
        0,75 ml van 1 mg / ml mutanolysine voorraad voor een laatste [0,075 mg / ml]
        1,00 ml 20 mg / ml Proteinase K voorraad voor een laatste [2 mg / ml]
      2. Ontdooi de monsters op ijs of bij 4 ° C. Vortex en overdracht 100 ul aliquots van elk monster in gelabelde microfuge buizen. Terug originele monsters terug in de -20 ° C vriezer.
      3. Centrifugeer de monsters bij 6.700 g gedurende 10 minuten.
      4. Verwijder de bovenstaande vloeistof. Voeg 200 ul van enzymatische lysis buffer om het pellet te resuspenderen en vortex. Incubat de monsters bij 56 ° C gedurende 30 minuten. Centrifugeer kort (5 seconden) bij 6.700 xg vloeistof verzamelen op de bodem van de buis.
      5. Voeg 10 ul van 20% SDS om de cellyse voltooien en meng voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
      6. Voeg 4 pi RNase A (100 mg / ml voorraad) en meng voorzichtig (op een rocker of omkeren van de buizen) bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
      7. Voeg 200 ul buffer AL (vanaf kit) en vortex gedurende 15 seconden. Incubeer monsters bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Centrifugeer kort (5 seconden) bij 6.700 xg vloeistof verzamelen op de bodem van de buis.
      8. Voeg 200 ul 100% EtOH en vortex gedurende 15 seconden. Spin kort de vloeistof verzamelen op de bodem van de buis, vervolgens over het mengsel (inclusief neerslag) aan de spin kolom (in een 2 ml verzamelbuis) zonder bevochtiging de velg. Volg wassen stappen, afhankelijk van protocol van de fabrikant (hier niet afgebeeld).
      9. DNA elueren, kolom over in een gemerkte microcentrifugebuis, voeg 50 ul buffer AE (frOM kit) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Centrifugeer bij 4.300 xg gedurende 1 minuut. Herhaal dit een keer voor een laatste elutie volume van 100 pl. DNA kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik.
      10. Om qPCR uitvoeren, steriliseren de kappen met UV-licht gedurende 15 minuten voor de start. Het voorbereiden van een 96-well plaat kaart werkblad goed locaties voor elk monster te nemen wordt aanbevolen.
      11. Bereid standaard curve met behulp van een 10 ng / ul voorraad van genomische pneumokokken DNA (geëxtraheerd uit referentie stam ATCC 6305).
        1. Ontdooi pneumokokken voorraad DNA en kort spin down (5 sec) in een tafelblad centrifuge.
        2. Voer 01:10 seriële verdunningen in 6 prelabeled microcentrifugebuizen door toevoeging van 3 pi DNA 27 ul nuclease-vrij H2O, veranderen uiteinden en vortexen tussen elke verdunning. De uiteindelijke verdunning serie bestaat uit 6 buizen: 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, en 0,00001 ng / ul.
          Opmerking: Deze kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
      12. Prepare lytA Mastermix als volgt een steriele 15 ml conische buis in een steriele PCR kap. Ontdooi componenten op ijs en vortex onmiddellijk vóór gebruik. et al..15 en worden getoond in de lijst van materialen.
      13. Vortex en load 23 ul / putje van de lytA mengen in de juiste putten. Raadpleeg plaat kaart.
      14. Transportplaat toevoeging gebied (bij voorkeur een steriele kast in een aparte ruimte) sjabloon voor monster laden.
      15. Gebruik een P2 pipet om monsters te laden, het veranderen tips voor elk putje. Alle monsters worden in duplo uitgevoerd. Raadpleeg plaat kaart voor de locatie.
      16. Voor standaard kromme putten, voeg 1 pl / putje van de juiste verdunning van standaardcurve DNA plus 1 ui / putje H2O het uiteindelijke volume op 25 ui te brengen.Want geen template controle putten, voeg 2 pl H 2 O.
      17. Voeg 2 ul / putje van DNA-monster in geschikte putjes.
      18. Cap alle putjes gebruikt. Zorg dat caps zijn stevig gesloten. Snel draai de PCR-plaat (5 sec) voordat de plaat in een real-time PCR machine.
      19. Weegblad in PCR machine en run qPCR volgens de instructies van de fabrikant van de machine. De volgende hydrolyseprobe fietsen voorwaarden worden aanbevolen:
        20. bestanddeel per reactie x 102 (volledige plaat)
        lytA F 0,25 pi van 10 uM voorraad 25.5 pi
        lytA R 0,25 pi van 10 uM voorraad 25.5 pi
        lytA sonde 0,5 ul van 10 uM voorraad 51 pl
        H2O 9.5 pl 969 pl
        Master mix 12.5 pi 1275 pi
        Het eindvolume 23 pl 2346 pi
        Stap 1 (1x): 3 min bij 95 ° C
        Stap 2 (40x): 20 sec bij 95 ° C
        20 sec bij 60 ° C
      20. Gegevens verzamelen en te kwantificeren pneumokokken DNA met behulp van de standaard curve. Bacteriële belastingen worden berekend zoals eerder beschreven 17 schat dat 1 ug genomisch DNA is gelijk aan 447,4 cellen, en gerapporteerd als CFU / ml (uitgaande one genoom per CFU, en een kopie van lytA per genoom; zie Figuur 4). Voor een succesvolle analyse moet de R2 waarde moet ≥ 0,98 en alle positieve resultaten binnen het bereik van de standaardkromme (Ct-waarden lager dan die verkregen voor de 0.00001 ng / ul standaardcurve bijzondere geacht achtergrond / lytA negatief).
        Opmerking: Sommige real-time PCR-systemen worden geleverd met analyse software die kan worden gebruikt om standaard curves construeren en berekenen onbekenden. Anders kan deze berekeningen worden uitgevoerd in Excel of soortgelijke programma's. Een voorbeeld standaardkromme wordt getoond in figuur 4.
      21. Om pneumokokken aanhankelijkheid te berekenen, normaliseren het aantal adherente pneumokokken uit voorwaarde b. CCL-23 cellen + pneumokokken tot 100%, en vergelijk aanhangend pneumokokken van andere aandoeningen aan deze voorwaarde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaten van een representatief experiment waarbij pneumococcen (S. pneumoniae PMP843, een koloniseert 19F isolaat) werden toegevoegd aan CCL-23-cellen 1 uur na toevoeging van S. salivarius en pneumococcal hechting werd gekwantificeerd door zowel kiemgetal en lytA qPCR worden getoond in Tabel 2. resultaten waren consistent tussen de twee methoden voor zowel het absolute aantal bacteriën (gepresenteerd als CFU / ml) en de% hechting, genormaliseerd naar het aantal hechtende pneumokokken in de putjes alleen met pneumokokken. Heparine wordt gebruikt als controle aangezien het bekend is pneumokokken hechting remmen en dus de verminderde hechting van de pneumococcen + heparine staat (typisch <40% in vergelijking met pneumokokken alleen) wijst op een succesvolle test. S. salivarius remt pneumococcen hechting op een dosis-afhankelijke wijze, zoals getoond in tabel 2, waarbij de hoge concentratie van S. salivarius (bij benaderingly 10 S. salivarius: 1 pneumokokken) resulteerde in de laagste pneumokokken therapietrouw.

Figuur 5 toont de hechting van pneumococcen CCL-23 cellen wanneer S. salivarius wordt toegevoegd 1 uur voor pneumokokken (preaddition), gelijktijdig (coaddition), of 1 uur na pneumokokken (post-toevoeging). S. salivarius is effectiever bij het ​​remmen van pneumococcen hechting wanneer toegevoegd vóór pneumokokken, omdat zowel de hoge en gemiddelde doses S. salivarius aanzienlijk verminderd pneumokokken hechting in de preaddition assay (figuur 5A), terwijl alleen de hoge dosis van S. salivarius geremd pneumokokken hechting in de coaddition en post-toevoeging assays (Figuren 5B en 5C).

De in tabel 2 en de figuren 4 en 5 gegevens werden verkregen met een eerdere versie van de lytA qPCR primers en sonde 17. Het huidige protocol beschrijft de bijgewerkte qPCR assay.

Figuur 1
Figuur 1. Vertegenwoordiger groeicurven van S. PMP843 pneumoniae (A) en S. salivarius K12 (B). Voor elke soort, CFU / ml zoals bepaald door levensvatbare telling is zwart (linker y-as), en optische dichtheid (OD) bij 600 nm in het grijs weergegeven (rechter y-as). Mid-log fase werd geschat door levensvatbare tellen tot 3 uur voor S. zijn pneumoniae PMP843 en 2 uur voor S. salivarius K12. Klik hier voor grotere afbeelding .

fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51069/51069fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 2. Voorbeelden van gezonde CCL-23 cellen en CCL-23 cellen met cytopathische effecten (CPE). A) Voorbeeld van een gezonde, confluente monolaag van CCL-23 cellen. B) CCL-23 cellen met cytopathische effecten. Opmerking afronding van cellen, heldere intracellulaire regio's en gebieden verstoord monolaag waar de cellen hebben getild de plaat. Beelden werden genomen met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop bij 200X vergroting. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3
Figuur 3. S. salivarius en pneumokokken kolonies op paard bloedagar. S. salivarius kolonies klein en wit, zoals aangegeven door de wittepijl en de letter A. Pneumokokken (S. pneumoniae) kolonies zijn meestal groter, platter, en groenachtig van kleur, zoals aangegeven door de witte pijl en de letter B. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 4
Figuur 4. Voorbeeld S. pneumoniae standaard curve voor qPCR. worden Genomic DNA berekeningen getoond samen met Ct-waarden (* gemiddelde van duplo standaardcurve putten uit een vertegenwoordiger qPCR assay), met de daaruit voortkomende norm curve, vergelijking, en R2 waarde weergegeven in de grafiek. Klik hier om te Bekijk grotere afbeelding .

Figuur 5 content-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" width = "600" />
Figuur 5. Effect van S. salivarius op pneumococcen naleving CCL-23 cellen Pneumokokken naleving CCL-23 cel monolagen wanneer cellen werden geïncubeerd met alleen pneumokokken. (Pnc, genormaliseerd tot 100%), met pneumokokken en 100 U / ml heparine (heparine), of met pneumokokken en S. salivarius toegevoegd in een verhouding van ~ 10: S. salivarius: 1 pneumokokken (hoog), ~ 1 S. salivarius: 1 pneumokokken (gemiddeld), of ~ 1 S. salivarius:. 10 pneumokokken (laag) S. salivarius werd 1 uur toegevoegd vóór (A), op hetzelfde moment als (B), of 1 uur na pneumococcen (C). n ≥ 3, * geeft P <0,05 in vergelijking met pneumokokken alleen (Student's t-test). Klik hier voor grotere afbeelding .

"Fo: keep-together.within-page =" altijd ">

Groep Test conditie Notes
Een CCL-23 cellen alleen
B CCL-23 cellen + pneumokokken
C CCL-23 cellen + pneumokokken + heparine Heparine blokken pneumokokken naleving celoppervlak glycosylaminoglycans 16 en wordt gebruikt als controle
D CCL-23 cellen + pneumokokken + S. salivarius [hoge] Ongeveer 1 pneumokokken: 10 S. salivarius
E CCL-23 cellen + pneumokokken + S. salivarius [med] Ongeveer 1 pneumokokken: 1 S. salivarius
F CCL-23 cellen + pneumokokken + S. salivarius [laag] Ongeveer 10 pneumokokken: 1 S. salivarius


Tabel 1. Omstandigheden getest pneumokokken hechting assay. De zes basis testomstandigheden worden beschreven.

6
Assay voorwaarde * CFU / ml Pnc (qPCR) % Therapietrouw (qPCR) CFU / ml Pnc (kiemgetal) % Therapietrouw (kiemgetal)
Pnc alleen 1,1 x 10 7 100 9,1 x 10 6 100
Pnc + heparine 1,5 x 10 6 14 7,6 x 10 5 8
Pnc + Sal [hoge] 6,1 x 10 5 6 3.2 x 10 5 4
Pnc + Sal [med] 3,6 x 10 6 33 2,7 x 10 6 29
Pnc + Sal 9,8 x 10 6 92 90

Tabel 2: Pneumokokken naleving CCL-23-cellen na toevoeging van S. salivarius zoals bepaald door lytA qPCR en levensvatbare telmethode * Pnc = pneumokokken.; Sal = S. salivarius; [Hoge] = ongeveer 10 Sal: 1 Pnc; [Med] = ongeveer 1 Sal: 1 Pnc; [Laag] = ongeveer 1 Sal: 10 Pnc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een kritische deel van deze test is het passende concentraties van S. salivarius en pneumokokken in de paragrafen 3.1.7 en 3.1.12. Concentraties worden geschat middels OD maar de exacte inocula zijn niet bepaald tot platen worden geteld de volgende dag. Om deze reden raden wij u aan groeicurven voor OD en levensvatbare tellingen (CFU / ml) na verloop van tijd voor alle bacteriestammen die in de test van de mid-log fase identificeren en te helpen bij de bepaling van de concentratie door de OD te meten. Bovendien kan pneumococcusstammen aanzienlijk verschillen in hun aanhankelijkheid eigenschappen. Stammen met goede hechting (> 10% van inocula vastzit aan epitheliale cellen na een incubatie van 3 uur) worden aanbevolen voor assays onderzoek het vermogen van probiotica pneumokokken hechting te remmen. Zelfs wanneer uitgevoerd door een ervaren operator, kan hechting niveaus assay variëren assay, zoals blijkt uit de relatief grote foutbalken zien in figuur 5. ForDaarom adviseren wij een minimum van drie herhalingen voor elk experiment, met duplo voor elke test conditie. Vergelijkbare variabiliteit is gemeld bij de naleving testen met behulp van Escherichia coli 18. In dit protocol worden cellen geïncubeerd gedurende 3 uur na toevoeging van pneumokokken. De incubatietijd kan worden ingekort indien de naleving tijdsverloop experimenten worden uitgevoerd en laten zien dat de meerderheid van de bacteriën hechten tijdens het eerste uur van de incubatie.

Dit protocol stelt twee methoden voor het kwantificeren van pneumokokken aanhankelijkheid, qPCR en levensvatbare tellen. Beide methoden zijn geschikt, en de keuze is afhankelijk van de voorkeur en de beschikbare lab-apparatuur van de operator (bijv. toegang tot een real-time PCR-machine). Kwantificering van levensvatbare telling is een goedkope methode die aanvullende reagentia of real-time PCR machine vereist. Echter gebruikt veel platen (typisch 80 platen voor een 12-well assay) en moet onmiddellijk worden uitgevoerdly aan het einde van de test, en het tellen van kolonies pneumococcen kan moeilijk zijn op platen die een grote hoeveelheid S. bevatten salivarius. Kwantificering door qPCR is duurder en vereist een langdurige DNA extractiestap, maar monsters ingevroren en verwerkte batches opgeslagen efficiëntie te verhogen. Het geëxtraheerde DNA kan ook worden gebruikt voor andere doeleinden, zoals qPCR detectie van hechtende S. salivarius. Als onderzoekt S. salivarius hechting, is het raadzaam om putten met CCL-23 cellen plus S. omvatten salivarius (zonder pneumokokken) en putten met CCL-23 cellen plus S. salivarius en heparine als bijkomende controles.

De basis test kan ook worden aangepast aan andere wetenschappelijke aspecten van kolonisatie onderzoeken. Zo kan het effect van probiotica op cytokineproductie worden beoordeeld door het opslaan en testen celsupernatanten. De test kan ook worden gemodificeerd om bacteriële invasie onderzoeken plaats toetreding doorincuberen van cellen met celmembraan ondoordringbaar antibiotica om extracellulaire bacteriën voorafgaand aan het oogsten en lyseren cellen te doden. Zoals hier beschreven, heeft de test geen onderscheid tussen adherente en invasieve (geïnternaliseerd) pneumokokken. Echter, eerdere studies vonden de niveaus van geïnternaliseerde pneumococcen zeer klein (typisch ≤ 0,01% entmateriaal) 10 dus voor de meeste isolaten (inclusief PMP843), de meeste cel-geassocieerd zijn pneumococcen aanhangend plaats geïnternaliseerd. Bijkomende toepassingen omvatten het testen van andere probiotische soorten op het vermogen om kolonisatie remmen en / of kijken naar mutante bacteriestammen om de rol van specifieke genen van belang te onderzoeken.

Een duidelijke beperking van deze in vitro assay is dat het bevat geen gevestigde epitheel, immuuncellen, normale flora of andere factoren die waarschijnlijk van invloed pneumokokken kolonisatie in vivo. Over de vraag of probiotica cou volledig te evaluerenld nuttig bij het ​​voorkomen van kolonisatie van pathogenen in de ademhalingswegen, in vivo studies met diermodellen en menselijke klinische proeven zijn gerechtvaardigd. Niettemin, in vitro hechting assays bruikbaar zijn als scherm voor het identificeren probiotica met mogelijk pneumokokken hechting remmen en kan informatie over preferentiële doseerstrategieën, alsmede het verschaffen van een experimenteel model dat kan worden gebruikt voor mechanistische studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Murdoch Childrens Research Institute en operationele infrastructuur Support Program de Victoriaanse regering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

Tags

Immunologie Gram-positieve bacteriële infecties longontsteking bacteriële Longziekten luchtweginfecties, Therapietrouw kolonisatie probiotica,
Onderzoek naar de effecten van probiotica op Pneumococcal Kolonisatie Met behulp van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Hechting Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter