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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l'aide d'un Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Les essais in vitro d'adhérence peuvent être utilisés pour étudier la fixation de Streptococcus pneumoniae à des monocouches de cellules épithéliales et d'enquêter sur les interventions possibles tels que l'utilisation des probiotiques pour inhiber la colonisation pneumococcique.

Abstract

L'adhésion de Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) à la épithélium du nasopharynx peut entraîner la colonisation et est considéré comme une condition préalable pour les infections à pneumocoques, comme la pneumonie et l'otite moyenne. Tests in vitro d'adhérence peuvent être utilisées pour étudier l'attachement des pneumocoques à des cellules épithéliales monocouches et d'enquêter sur les interventions possibles, comme l'utilisation de probiotiques, d'inhiber la colonisation pneumococcique. Le protocole décrit ici est utilisé pour étudier les effets de la probiotique Streptococcus salivarius sur l'adhésion des pneumocoques à la lignée cellulaire epitheliale humaine CCL-23 (parfois dénommé cellules HEp-2). L'essai comporte trois étapes principales: 1) la préparation des cellules épithéliales et bactériennes, 2) plus de bactéries épithéliales des monocouches de cellules, et 3) la détection des pneumocoques adhérent par les numérations viables (dilution en série et placage) ou quantitative PCR en temps réel (qPCR ). Cette technique est relativement simple et ne nécessite pas d'équipement spécialisé autre qu'une installation de culture de tissu. Le test peut être utilisé pour tester d'autres espèces probiotiques et / ou des inhibiteurs potentiels de la colonisation pneumococcique et peut être facilement modifié pour répondre à d'autres questions scientifiques concernant le respect pneumocoque et l'invasion.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) est une bactérie à Gram positif qui peut causer des infections comme la pneumonie, l'otite moyenne et la méningite. Il est une cause majeure de maladie chez les enfants dans les pays à faible revenu et responsables d'environ 800 000 décès d'enfants de moins de cinq ans chaque année 1. Les pneumocoques sont souvent effectuée dans le nasopharynx de jeunes enfants. Bien que cette colonisation est généralement considéré comme asymptomatique, elle précède infection pneumococcique et sert de réservoir pour les bactéries dans les populations humaines 2. Vaccination antipneumococcique conjugué réduit efficacement le transport des sérotypes contenus dans le vaccin. Cependant, il ya plus de 90 sérotypes de pneumocoques, et la vaccination peuvent conduire au remplacement de sérotype, dans lequel l'élimination des sérotypes vaccinaux est suivie par une hausse dans le transport et les maladies causées par des sérotypes non vaccinaux 3. En outre, dans certaines populations à haut risque, le pneumocoquecolonisation se produit souvent très tôt dans la vie, avant l'administration de la première dose de vaccin de 4,5. Récemment, l'utilisation de probiotiques a été proposée comme une stratégie supplémentaire pour inhiber la colonisation pneumococcique 6,7. Tests in vitro d'adhérence ont été utilisées pour examiner l'adhésion à pneumocoques 8,9. Ces essais ont été adaptés pour étudier l'impact du probiotique Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) sur l'adhésion à pneumocoques 10.

En plus de LGG et autres bactéries d'acide lactique, Streptococcus salivarius, un habitant courant de la cavité orale, a été étudiée en tant que probiotique potentiel pour les voies respiratoires en raison de son potentiel et aptitude à inhiber les pneumocoques et d'autres agents pathogènes respiratoires in vitro 11 colonisation - 13. Le protocole présenté ici décrit un essai d'adhérence utilisée pour étudier les effets de la S. salivarius K12 sur l'adhésion à pneumocoquespour la lignée de cellules épithéliales humaines CCL-23. Avant d'utiliser dans l'essai, isolats de pneumocoques ont été évalués pour les capacités d'adhérence, la croissance et les propriétés d'adhérence peuvent varier considérablement parmi les isolats 10,14. Courbes de croissance des pneumocoques et S. salivarius ont été réalisées afin de déterminer la phase semi-logarithmique et la concentration de l'estimation (unités formant des colonies ou CFU / ml) par la densité optique (DO, figure 1). Il est recommandé d'examiner la croissance en compte viable et OD pour chaque isolat avant l'utilisation dans le dosage. Ce test peut être effectué dans un laboratoire avec des équipements standard et de l'équipement de culture de tissus. Dans ce protocole, les effets de trois doses de S. salivarius administré 1 heure avant l'addition des pneumocoques sur l'adhérence de S. pneumoniae PMP843, un sérotype 19F transport isolat provenant d'un écouvillon nasopharyngé, sont examinés. Deux façons de quantifier les pneumocoques adhérent sont présentés: étalement sur gélose au sang pour dissuaderle mien comptes viables, et l'extraction de l'ADN et la détection du gène lytA pneumocoque par qPCR 15. Le protocole de l'essai d'adhérence de base peut être facilement modifié pour tester différentes doses ou le moment d'administration de probiotiques et peut également être utilisé avec d'autres souches de bactéries ou d'espèces.

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Protocol

1. Préparation des cellules épithéliales et bactériennes

  1. Le dégel du CCL-23 cellules épithéliales
    1. Préchauffer milieu essentiel minimum (MEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant environ 30 min.
    2. Stériliser la culture de tissus approuvé enceinte de sécurité biologique à la lumière UV pendant au moins 10 min avant de l'utiliser, et essuyez la zone de travail avec 70% d'éthanol. Essuyer la bouteille de médias réchauffé avec 70% d'éthanol et le lieu dans le cabinet de biosécurité.
    3. L'utilisation d'un pipette de 25 ml, transférer 14 ml de milieu dans un flacon T-75. Placez ballon dans 37 ° C incubateur pendant cellules sont en train de fondre (section 1.1.4).
    4. Retirer un flacon de CCL-23 cellules de stockage d'azote liquide à l'aide de mesures de sécurité appropriées et chaud dans un bain d'eau à 37 ° C jusqu'à ce que ~ 80% décongelé.
    5. Retourner le flacon préparé à la section 1.1.3 de l'enceinte de sécurité biologique. Essuyez la surface extérieure du flacon de CCL-23 cellules avec 70% d'éthanol et le contenu de transfert (1 ml) dans le T-75 Ballon à l'aide d'une pipette P1000.
    6. Incuber le flacon de son côté dans un 37 ° C, 5% CO 2, 95% d'humidité relative incubateur de culture tissulaire pendant une nuit (16-20 h).
    7. Vérifiez les cellules sous un microscope pour confirmer une morphologie saine, retirer les supports, et les remplacer par 15 ml fraîches, préchauffé MEM + 10% FBS.
  2. Entretien de CCL-23 cellules épithéliales
    1. Une fois que les cellules sont confluentes à environ 80% (1 à 2 jours), le passage en supprimant média en utilisant une pipette de 25 ml et laver doucement les cellules deux fois avec 8-10 ml préchauffé saline tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant une pipette de 10 ml.
    2. Retirer du PBS et ajouter 1 ml de solution stérile à 0,25% de trypsine-EDTA (0,25% (w / v) de trypsine, 0,1 mM d'EDTA). Tourner ballon sur son côté, pivoter pour assurer la trypsine recouvre la couche confluente de cellules et incuber la fiole pendant 2-3 min dans les 37 ° C, 5% CO 2 incubateur.
    3. Ballon revenir à l'enceinte de sécurité biologique, ajouter 9 ml préchauffé MEM + 10% de FBS, et pipette de haut en bas 6 -8x pour remettre en suspension les cellules, à éjecter un liquide sur le côté de la fiole pour déloger les cellules.
    4. cellules fractionnées 01:15 (1 ml + 14 ml de MEM + 10% de FBS) ou 1:30 (0,5 ml + 14,5 ml de MEM + 10% de FBS), éliminer les cellules excédentaires, et renvoient le ballon à 37 ° C, 5% CO 2 incubateur.
    5. Passage des cellules d'au moins deux fois avant de l'utiliser dans l'essai d'adhérence. Typiquement cellules sont divisées tous les 3-4 jours.
  3. Semis de CCL-23 cellules épithéliales (un jour avant à l'adhésion dosage, protocole n ° 2)
    1. Fractionner les cellules confluentes, comme décrit dans les sections 1.2.1-1.2.3, remise en suspension dans du MEM + préchauffé FBS à 5% (FBS concentration est abaissée pour réduire la probabilité des composants du sérum qui interfèrent dans le dosage). Retirer 20 pi de cellules et de compter en utilisant une coloration au bleu trypan et un hémocytomètre.
    2. Diluer les cellules dans préchauffé MEM + 5% FBS à une concentration de 1,5 x 10 5 cellules / ml dans un tube stérile de 50 ml.
    3. Graine 1 ml de cellules / puits dans un tissuCulture traitée plaque de 24 puits.
  4. Préparation de bactéries
    Cette procédure peut être suivie pour la préparation des pneumocoques et S. salivarius. Médias de la croissance bactérienne est généralement conservé dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit pour préchauffer et essai de stérilité (généralement paraître trouble en cas de contamination).
    1. Deux jours avant l'adhésion analyse, les bactéries à balayage à cheval sang agar (HBA) plaques et incuber à 35-37 ° C et 5% de CO 2 pendant 18-24 h. gélose au sang de mouton peut être utilisé comme une alternative.
    2. Le jour suivant, préparer une culture d'une nuit de chaque espèce bactérienne à la pipette 10 ml du bouillon Todd-Hewitt avec 0,5% d'extrait de levure (THB + YE) de milieu dans un tube de 30 ml stérile. En utilisant une boucle de 10 pi, inoculer environ 10-12 colonies bien séparées. Brièvement vortex et incuber à 35-37 ° C et 5% de CO2 pendant 14 à 16 h. Notez que les pneumocoques se autolyze si elle reste trop longtemps dans un bouillon de culture.

    2 Respect dosage:. Ajout de bactéries à des monocouches de cellules épithéliales

    1. Préparation de la mi-log cultures bactériennes de pneumocoques et S. salivarius
      1. Ajouter 10 ml d'préchauffé THB + YE dans chacun des deux tubes de 30 ml stériles, un pneumocoques marqué et l'autre S. salivarius.
      2. Pour atteindre la phase semi-logarithmique, les pneumocoques nécessite ~ 3 heures et S. salivarius nécessite ~ 2 heures d'incubation (voir la figure 1). Démarrer les deux cultures en même temps. Vortex (3-5 sec) des cultures bactériennes au jour le jour et ajouter 100 pneumocoques pi et 100 pi S. salivarius dans des tubes correspondants.
      3. En bref vortex et incuber les cultures à 37 ° C pendant environ 2 heures pour S. salivarius et 3 heures pour les pneumocoques.
    2. Préparation de CCL-23 cellules pour le dosage de l'adhésion
      1. En utilisant un microscope inversé, consultez la plaque de 24 puits pour confluent monocouches avec la morphologie des cellules saines. Monocouches doivent être> 80% de confluence, sans preuve d'agglutination des cellules ou des effets cytopathiques tels que l'arrondissement des cellules ou perte d'adhérence (voir la figure 2).
      2. Retirez le support dans chaque puits en utilisant une pipette de transfert, en inclinant légèrement la plaque pour éviter de perturber la monocouche cellulaire.
      3. Pour laver en douceur les cellules, ajouter ~ 500 ul de PBS préchauffé dans chaque puits à l'aide d'une pipette sérologique et l'enlever avec une pipette de transfert, en inclinant légèrement la plaque. Rejeter le PBS. Répétez l'étape de lavage une fois.
      4. Ajouter 500 ul de MEM préchauffé + FBS à 5% dans chaque puits. Retour de la plaque de 24 puits à l'incubateur à CO 2 pendant la préparation des cultures bactériennes.
        Remarque: Pour déterminer le nombre exact de cellules CCL-23 pour la multiplicité d'infection (MOI), deux puits peuvent être traitées à la trypsine et comptées le jour de l'infection.

    3. Respect Assay

    1. Ajouter à pneumocoquesles CCL-23 cellules à une MOI ~ 10h01. Testez les conditions énumérées dans le tableau 1 dans les puits en double.
      1. Mesurer la densité optique à 600 A (OD) de 1 ml de S. culture salivarius. OD doit être comprise entre 0,3-0,6.
      2. Transférer 5 ml de S. salivarius culture dans un tube de 10 ml et centrifuger à 1870 g pendant 4 min.
      3. Jeter le surnageant et basé sur la lecture de DO dans la section 3.1.1, remettre en suspension S. salivarius dans 200-1000 ul de NaCl à 0,85% (concentration finale d'environ 1,5 x 10 9 CFU / ml). En règle générale, une DO de 0,375 sera remis en suspension dans 260 ul. Préparer 1:10 et 1:100 dilutions de S. salivarius en utilisant 0,85% de NaCl.
        Note: Au total, trois concentrations (représentant haute, moyenne et faible dose) de S. salivarius sera testé dans le dosage. La dose élevée est un rapport de ~ 10 S. salivarius: 1 pneumocoques, le milieu est ~ 1 S. salivarius: 1 pneumocoques, et le bas est ~ 1 S. salivarius: 10 pneumocoques.
      4. Sortez la plaque de 24 puits de l'incubateur.
      5. Des puits de contrôle de l'héparine, retirez 40 pi de milieu et ajouter 50 ul d'héparine (1000 U / ml de concentration d'actions) pour une concentration finale de 100 U / ml.
      6. Ajouter 10 ul de NaCl à 0,85% pour les puits contenant CCL-23 cellules seulement et puits contenant CCL-23 cellules et les pneumocoques (pas S. salivarius).
      7. Ajouter 10 ul de non dilué, 1:10 et 1:100 de S. salivarius aux puits respectifs.
        Remarque: S. salivarius peut également être ajouté en même temps que les pneumocoques (coaddition) ou 1 heure après les pneumocoques (post-addition) d'examiner l'effet du temps de l'administration de probiotiques.
      8. Centrifuger la plaque à 24 puits à 114 x g pendant 3 min pour favoriser le contact des bactéries avec la couche de cellules et incuber pendant 1 heure à 37 ° C, 5% CO 2.
      9. Effectuer une dilution en série de la S. salivarius stock en NaCl à 0,85% et la plaque sur double HBAplaques pour les numérations viables. Tout d'abord, ajouter 50 ul d'actions à 450 pi de NaCl à 0,85% pour faire une dilution 10 -1, alors impulsion vortex (5 sec), le changement de conseil, et ajouter 50 ul de la dilution 10 -1 à 450 pi de NaCl à 0,85% de faire une dilution 10 -2 et ainsi de suite jusqu'à 10 -7.
      10. Plaque 100 pi de la 10 -5, 10 -6 et 10 -7 dilutions en double sur des plaques HBA et répartis avec une spatule stérile. Incuber les plaques HBA inversées nuit à 37 ° C, 5% de CO 2.
      11. Vers la fin de l'incubation de 1 heure, répétez les sections 3.1.1-3.1.3 pour les pneumocoques. DO devrait être comprise entre 0,2-0,7. Centrifuger 1 ml de la culture à pneumocoques et remettre en suspension le culot dans 300-2,000 ul de NaCl à 0,85% (sur la base de la lecture de DO) à une concentration de 1,5 x 10 ~ 8 CFU / ml. En règle générale, une DO de 0,3 sera remis en suspension dans 500 ul.
      12. Après 1 heure d'incubation avec S. salivarius, ajouter 10 μ; L pneumocoques non diluée dans tous les puits sauf les puits témoins négatifs (cellules contenant seulement).
      13. Centrifuger la plaque à 24 puits à 114 x g pendant 3 min et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 3 heures. Effectuer une dilution en série de la pneumocoques stock en NaCl à 0,85% comme décrit dans la section 3.1.9 et des dilutions de plaque 10 -4, 10 -5 et 10 -6 sur des plaques HBA double pour les numérations viables.
    2. Après 3 heures, vérifier les cellules sous un microscope afin de s'assurer que les monocouches air en bonne santé (voir la figure 2). Retirez le support de chaque puits et laver délicatement les cellules 3x comme décrit dans la section 2.2.3. à l'aide d'une pipette différente pour chaque condition. Cette étape est essentielle pour éliminer les pneumocoques non adhérente. Les monocouches ne doivent pas se séparer pendant le processus de lavage; ce peut être confirmée en vérifiant à nouveau sous un microscope.

    Remarque: Les médias enlevés au cours de cette étape peut être conservé à -20 ° C pour des analyses supplémentaires (<em> par exemple la mesure des niveaux de cytokines).

    1. Ajouter 200 ul de 0,1% de digitonine (un détergent doux) à chaque puits et incuber pendant 7 minutes à 37 ° C, 5% CO 2.
    2. Ajouter 800 pi de THB médias à chaque puits. Lyse des cellules par aspiration et refoulement, et, si nécessaire, gratter les puits 3-4x avec la pointe de la pipette pour s'assurer que la monocouche cellulaire est complètement enlevé. Changer de conseils entre les puits.
    3. Enlevez le contenu de chaque puits en utilisant une pipette P1000 et transférer dans des tubes à centrifuger marqués.

    4. Quantification des adhérentes pneumocoques

    Pneumocoques adhérente peut être quantifiée en déterminant les numérations viables (dilution en série et étalement sur gélose au sang), soit par PCR quantitative en temps réel.

    1. Méthode de comptage viable
      Cette méthode doit être effectué immédiatement après l'étape 3.5 de l'essai d'adhérence.
      1. Pour chaque puits d'essai, préparer des dilutions en série d'échantillons prélevés dansl'étape 3.5 de l'essai d'adhérence en ajoutant 50 ul d'échantillons de 450 ul de NaCl à 0,85%, le pouls vortex, et dilution en série comme décrit dans la section 3.1.9 à la dilution 10 -6.
      2. Plate 100 pi de la 10 -3, 10 -4, -5 10, et 10 -6 dilutions en double sur gélose au sang, réparties avec une spatule stérile et incuber les plaques inversées nuit à 37 ° C, 5% de CO 2. Notez que les puits contenant CCL-23 cellules seules ne doivent pas contenir de bactéries et peuvent être plaqué pur (non dilué 100 ul) en tant que contrôle de stérilité.
      3. Le jour suivant, déterminer les inoculums pneumococcique par comptage des colonies sur les plaques de dilution appropriés (contenant de 30 à 300 colonies) préparés dans la section 1.3.13 de l'essai d'adhérence. Calculer la CFU / ml de l'inoculum en utilisant la valeur moyenne à partir de deux plaques. De même, déterminer la S. salivarius inocula par comptage des colonies sur les plaques préparéesà la section 3.1.10.
        Remarque: Les plaques doivent contenir des pneumocoques seulement; la présence d'autres espèces indique que l'essai a été contaminé et les résultats ne sont pas valides.
      4. Pour déterminer les niveaux d'adhérence à pneumocoque, compter la plaque de dilution appropriée (contenant 30-300 colonies pneumocoque) pour chaque échantillon préparé dans la section 4.1.1. A noter que S. colonies salivarius seront petits et blanc, tandis que les pneumocoques seront dus plat et verdâtre à α-hémolyse, comme le montre la figure 3. Pour calculer l'adhésion à pneumocoques, normaliser le nombre de pneumocoques adhérent de la condition b. CCL-23 cellules + pneumocoques à 100%, et de comparer les pneumocoques adhérent d'autres conditions à cette condition.
    2. méthode qPCR
      Les échantillons prélevés en respect Essai étape 3.5 peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'extraction de l'ADN. extraction de l'ADN est effectuée en utilisant un kit commercial et décrit dans les sections 4.2.1-4.2.9 et la qPCR commedire dans les sections 4.2.10-4.2.20.
      1. Préparer un tampon de lyse enzymatique (50 mM de tampon phosphate pH 6,7 contenant 1 mg / ml de lysozyme, 0,075 mg / ml mutanolysine, et 2 mg / ml de protéinase K). La recette suivante peut être utilisée faire 10 ml (suffisamment pour 50 extractions). Tampon de lyse enzymatique doit être fraîchement préparée avant utilisation.

        7,25 ml de solution tampon phosphate 50 mM (pH 6,7)
        1,00 ml de 10 mg / ml de lysozyme actions pour une finale [1 mg / ml]
        0,75 ml de 1 mg / ml mutanolysine stock pour une finale [0,075 mg / ml]
        1,00 ml de 20 mg / ml protéinase K stock pour une finale [2 mg / ml]
      2. Décongeler les échantillons sur la glace ou à 4 ° C. Vortex et le transfert de 100 aliquotes de chaque échantillon dans des tubes à centrifuger marqués. Remettre les échantillons originaux de nouveau dans le congélateur à -20 ° C.
      3. Centrifuger les échantillons à 6700 g pendant 10 min.
      4. Retirer et jeter le surnageant. Ajouter 200 ul de tampon de lyse enzymatique de la pastille et vortex pour remettre en suspension. Incubmangé les échantillons à 56 ° C pendant 30 min. Centrifuger brièvement (5 sec) à 6700 x g pour recueillir le liquide au fond du tube.
      5. Ajouter 10 pl de SDS à 20% pour terminer la lyse des cellules et mélanger doucement à la température ambiante pendant 2 min.
      6. Ajouter 4 pi de RNase A (100 mg / stock ml) et mélanger doucement (sur une bascule ou en inversant les tubes) à la température ambiante pendant 2 min.
      7. Ajouter 200 pi de tampon AL (dans le kit) et vortex pendant 15 secondes. Incuber les échantillons à 70 ° C pendant 10 min. Centrifuger brièvement (5 sec) à 6700 x g pour recueillir le liquide au fond du tube.
      8. Ajouter 200 pi d'EtOH à 100% et vortex pendant 15 s. Centrifuger brièvement pour collecter le liquide au fond du tube, puis transférer le mélange (y compris tout précipité) à la colonne de rotation (dans un tube de collecte de 2 ml) sans mouiller le bord. Suivez les étapes de lavage selon de protocole du fabricant (non représenté ici).
      9. Pour éluer l'ADN, transférer la colonne dans un tube de micro marqué, ajouter 50 ul de tampon AE (frKit om), et incuber à température ambiante pendant 2 min. Centrifuger à 4300 g pendant 1 min. Répéter une fois pour un volume d'élution final de 100 pi. L'ADN peut être conservé à -20 ° C jusqu'à utilisation.
      10. Pour effectuer qPCR, stériliser les hottes avec la lumière UV pendant 15 min avant de commencer. Préparer une plaque de 96 puits carte feuille de calcul pour enregistrer les emplacements de puits pour chaque échantillon est recommandé.
      11. Préparer la courbe standard en utilisant un 10 ng / stock pl de l'ADN génomique à pneumocoque (extrait de la souche de référence ATCC 6305).
        1. Décongeler l'ADN d'actions contre le pneumocoque et centrifuger brièvement (5 sec) dans une centrifugeuse de table.
        2. Effectuer 01:10 dilutions en série en 6 microtubes de préalablement marquées par l'ajout d'ADN 3 pi à 27 pi sans nucléase H 2 O, en changeant des conseils et des vortex entre chaque dilution. Les séries de dilution finale est constituée de six tubes: 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 et 0,00001 ng / ul.
          Note: Ceux-ci peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine.
      12. Prepare lytA mastermix comme suit dans un tube conique de 15 ml stérile dans une hotte stérile PCR. Décongeler les composants sur la glace et vortex immédiatement avant l'utilisation. et al.15 et sont affichés dans la liste des matériaux.
      13. Vortex et charge 23 pl / puits de la lytA mélangent dans les puits appropriés. Reportez-vous à la plaque carte.
      14. plaque de transport pour modèle la zone de plus (de préférence une armoire stérile dans une pièce séparée) pour le chargement des échantillons.
      15. Utiliser une pipette de P2 pour charger des échantillons, la modification des conseils pour chaque puits. Tous les échantillons sont analysés en double. Reportez-vous à la plaque de carte pour l'emplacement.
      16. Pour des puits de courbes standard, ajouter 1 pl / puits d'une dilution appropriée de l'ADN de la courbe de référence plus une pl / puits de H 2 O pour amener le volume final à 25 pi.Pour aucun puits de contrôle de modèle, ajoutez 2 pl H 2 O.
      17. Ajouter 2 ul / puits d'ADN de l'échantillon dans les puits appropriés.
      18. Cap tous les puits en service. Assurez-vous que les bouchons sont fermés parfaitement. Tourner rapidement la plaque PCR (5 sec) avant de charger la plaque dans une machine PCR en temps réel.
      19. plaque de charge dans la machine et PCR terme qPCR selon les instructions fournies par le fabricant de la machine. Les sondes des conditions de cycle d'hydrolyse suivantes sont recommandées:
        20. composant par réaction x 102 (plaque pleine)
        lytA F 0,25 ul de 10 uM actions 25,5 pi
        lytA R 0,25 ul de 10 uM actions 25,5 pi
        sonde lytA 0,5 pi de 10 uM actions 51 pi
        H 2 O 9,5 pl 969 pi
        Master Mix 12,5 pi 1275 pi
        Le volume final 23 pi 2346 pi
        Étape 1 (1x): 3 min à 95 ° C
        Étape 2 (40x): 20 sec à 95 ° C
        20 sec à 60 ° C
      20. Recueillir des données et de quantifier l'ADN pneumococcique en utilisant la courbe standard. Charges bactériennes sont calculés comme décrit précédemment 17, estimant que 1 pg d'ADN génomique est équivalent à 447,4 cellules, et rapporté comme UFC / ml (en supposant one génome par UFC, et une copie de lytA par génome; voir figure 4). Pour un essai réussi, la valeur de R 2 doit être ≥ 0,98 et tous les résultats positifs au sein de la gamme de la courbe standard (CT valeurs inférieure à celle obtenue pour le ng de 0,00001 / ul point de courbe standard sont considérés comme fond / lytA négatif).
        Remarque: Certains systèmes de PCR en temps réel sont livrés avec un logiciel d'analyse qui peut être utilisé pour construire des courbes standard et calculer inconnues. Sinon, ces calculs peuvent être effectués dans Excel ou des programmes similaires. Une courbe standard d'exemple est représenté sur la figure 4.
      21. Pour calculer l'adhésion à pneumocoques, normaliser le nombre de pneumocoques adhérent de la condition b. CCL-23 cellules + pneumocoques à 100%, et de comparer les pneumocoques adhérent d'autres conditions à cette condition.

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Representative Results

Les résultats d'une expérience représentative dans laquelle les pneumocoques (Streptococcus pneumoniae PMP843, un isolat coloniser 19F) ont été ajoutés à CCL-23 cellules 1 h après l'addition de S. salivarius, et l'adhésion pneumococcique a été quantifiée par comptage à la fois viable et lytA qPCR sont montrés dans le tableau 2. résultats étaient en accord entre les deux procédés à la fois pour le nombre absolu de bactéries (comme présenté UFC / ml) et le% d'adhésion, normalisée pour le nombre pneumocoques de adhérente dans les puits contenant les pneumocoques seul. L'héparine est utilisée comme contrôle comme il est connu pour inhiber l'adhésion pneumococcique et par conséquent l'adhérence réduite dans la condition de pneumocoques + héparine (typiquement <40% par rapport à pneumocoques seul) est indicatif d'un essai réussi. S. salivarius inhibe l'adhésion pneumococcique d'une manière dépendante de la dose, comme le montre le tableau 2, où la concentration élevée de S. salivarius (approximatifment 10 S. salivarius: 1 pneumocoques) a donné lieu à la plus faible adhésion à pneumocoques.

La figure 5 montre l'adhésion des pneumocoques à CCL-23 cellules quand S. salivarius est ajouté 1 heure avant pneumocoques (preaddition), en même temps (coaddition), ou 1 heure après les pneumocoques (post-addition). S. salivarius est plus efficace dans l'inhibition de l'adhésion pneumococcique lorsqu'ils sont ajoutés avant les pneumocoques, les deux doses les hautes et moyennes de S. salivarius réduit de manière significative l'adhésion à pneumocoques dans le dosage de preaddition (figure 5A), alors que seulement la dose élevée de S. salivarius inhibée adhésion à pneumocoques dans le coaddition et analyses post-addition (figures 5B et 5C).

Les données présentées dans le tableau 2 et les figures 4 et 5 ont été obtenus en utilisant une version antérieure d'amorces lytA qPCR et sonder 17. Le protocole actuel décrit l'essai qPCR jour.

Figure 1
Figure 1. Des courbes de croissance représentatifs de S. pneumoniae PMP843 (A) et S. salivarius K12 (B). Pour chaque espèce, UFC / ml, tel que déterminé par comptage viable est en noir (axe de gauche), et la densité optique (DO) à 600 nm est représentée (axe des ordonnées à droite) gris. Mi-log phase a été estimée par comptage viable pour être 3 h pour S. pneumoniae PMP843 et 2 h pour S. salivarius K12. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 2. Exemples de santé CCL-23 cellules et CCL-23 cellules avec des effets cytopathiques (CPE). A) Exemple de, une monocouche confluente sain de CCL-23 cellules. B) CCL-23 cellules avec des effets cytopathiques. Remarque arrondissement des cellules, des régions intracellulaires lumineuses et les zones de monocouche perturbé où les cellules ont enlevé la plaque. Les images ont été prises à l'aide d'un microscope inversé à la lumière 200X. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3
Figure 3. S. salivarius et colonies pneumocoque sur gélose au sang de cheval. S. salivarius colonies sont petites et blanches, comme indiqué par le blancflèche et la lettre A. pneumocoque (Streptococcus pneumoniae) colonies sont généralement plus grandes, plus plat, et de couleur verdâtre, comme indiqué par la flèche et blanc lettre B. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 4
Figure 4. Exemple S. pneumoniae courbe standard pour qPCR. calculs d'ADN génomique sont présentées avec les valeurs de Ct (* moyenne de double puits de la courbe standard d'un test qPCR représentant), avec la 2 valeur courbe, équation, et R norme résultante indiqué sur le graphique. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 5. Effet de S. salivarius sur le respect des pneumocoques à la CCL-23 cellules adhérentes des pneumocoques aux CCL-23 monocouches de cellules lorsque les cellules ont été incubées avec des pneumocoques seul. (Pnc, normalisée à 100%), par des pneumocoques et 100 U / ml d'héparine (héparine), ou par des pneumocoques et S. salivarius ajouté à un rapport d'environ 10: S. salivarius: 1 pneumocoques (haut), ~ 1 S. salivarius: 1 pneumocoques (moyen), ou ~ 1 S. salivarius: 10. pneumocoques (faible) S. salivarius a été ajouté 1 heure avant (A), en même temps que (B), ou 1 heure après les pneumocoques (C). n ≥ 3, * indique P <0,05 par rapport à pneumocoques seul (test t de Student). Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Groupe état de dosage Remarques
A CCL-23 cellules seules
B CCL-23 cellules + pneumocoques
C CCL-23 cellules + pneumocoques + héparine des blocs d'héparine adhérence pneumococcique à la surface cellulaire glycosylaminoglycanes 16 et est utilisé en tant que contrôle
Ré CCL-23 cellules + pneumocoques + S. salivarius [haut] Environ 1 pneumocoque: 10 S. salivarius
E CCL-23 cellules + pneumocoques + S. salivarius [MED] Environ 1 pneumocoque: 1 S. salivarius
Fa CCL-23 cellules + pneumocoques + S. salivarius [faible] Environ 10 pneumocoque: 1 S. salivarius


Tableau 1. Conditions testées dans l'essai d'adhérence à pneumocoques. Les six conditions d'essai de base sont décrites ici.

6
condition de test * UFC / ml Pnc (qPCR) % D'adhésion (qPCR) UFC / ml Pnc (nombre viable) % D'adhésion (nombre viable)
Pnc seul 1,1 x 10 7 100 9,1 x 10 6 100
Pnc + héparine 1,5 x 10 6 14 7,6 x 10 5 8
Pnc + Sal [haut] 6,1 x 10 5 6 3,2 x 10 5 4
Pnc + Sal [MED] 3,6 x 10 6 33 2,7 x 10 6 29
Pnc + Sal 9,8 x 10 6 92 90

Tableau 2: respect des pneumocoques aux CCL-23 cellules suite à l'ajout de S. salivarius tel que déterminé par lytA qPCR et la méthode de comptage viable * Pnc = pneumocoques.; Sal = S. salivarius; [Haut] = environ 10 Sal: 1 Pnc; [Med] = environ 1 Sal: 1 Pnc; [Faible] = environ 1 Sal: 10 Pnc.

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Discussion

Une partie essentielle de ce test est d'ajouter les concentrations appropriées de S. salivarius et les pneumocoques dans les sections 3.1.7 et 3.1.12. Les concentrations sont estimées en utilisant les lectures de DO mais l'inoculum exacte ne sont pas déterminés jusqu'à plaques sont comptés le jour suivant. Pour cette raison, nous recommandons d'effectuer des courbes de croissance pour mesurer OD et les numérations viables (UFC / ml) au fil du temps pour toutes les souches bactériennes utilisées dans l'essai d'identifier la phase semi-logarithmique et aider à estimer la concentration en OD. En outre, les souches de pneumocoques peuvent différer sensiblement dans leurs propriétés d'adhérence. Les souches présentant une bonne adhérence (> 10% des inoculums adhérer aux cellules épithéliales après une incubation de 3 h) sont recommandés pour les essais de l'enquête de la capacité des probiotiques à inhiber l'adhésion à pneumocoques. Même lorsqu'elle est effectuée par un opérateur expérimenté, les niveaux d'adhérence peuvent varier dosage pour doser, comme en témoignent les relativement grandes barres d'erreur observés sur la figure 5. PourC'est pourquoi nous recommandons un minimum de trois répétitions pour chaque expérience, avec des puits en double pour chaque condition d'essai. Variabilité similaire a été rapporté dans des essais d'adhérence en utilisant Escherichia coli 18. Dans ce protocole, les cellules sont incubées pendant 3 heures après l'addition de pneumocoques. Le temps d'incubation peut être réduite si des expériences de décours temporel de l'adhérence sont effectués et montrent que la majorité des bactéries adhèrent au cours de la première heure d'incubation.

Ce protocole présente deux méthodes pour quantifier l'adhésion à pneumocoques, qPCR et comptage viable. Les deux méthodes sont appropriées, et le choix dépend de l'équipement des préférences et disponible laboratoire de l'opérateur (par exemple, l'accès à une machine de PCR en temps réel). La quantification par comptage viable est un procédé à faible coût qui ne nécessite pas de réactifs supplémentaires ou une machine de PCR en temps réel. Cependant, il utilise de nombreuses plaques (généralement 80 plaques pour un essai de 12 puits) et doit être exécuté immédiatemently à la fin de l'essai, et le comptage des colonies de pneumocoques peut être difficile sur des plaques qui contiennent une grande quantité de S. salivarius. Quantification par qPCR est plus cher et nécessite une étape d'extraction d'ADN long, mais les échantillons congelés peuvent être stockés et traités par lots, ce qui augmente l'efficacité. L'ADN extrait peut aussi être utilisé à d'autres fins, telles que la détection de qPCR adhérente S. salivarius. Si l'enquête S. salivarius adhésion, il est recommandé d'inclure les puits avec CCL-23 cellules plus S. salivarius (sans pneumocoques) et les puits avec CCL-23 cellules plus S. salivarius et héparine contrôles supplémentaires.

Le test de base peut également être adapté pour étudier d'autres aspects scientifiques de la colonisation. Par exemple, l'effet des probiotiques sur la production de cytokine peut être évaluée par le stockage et le dosage des surnageants cellulaires. Le test peut également être modifié pour examiner l'invasion bactérienne plutôt que le respect parincubation des cellules avec la membrane cellulaire des antibiotiques imperméables pour tuer les bactéries extracellulaires avant la récolte et lyse des cellules. Comme décrit ici, l'analyse ne distingue pas entre (intériorisé) pneumocoques adhérente et invasive. Toutefois, des études antérieures ont montré les niveaux de pneumocoques intériorisé à être très faible (≤ généralement 0,01% des inoculums) 10 ainsi pour la plupart des isolats (y compris PMP843), la grande majorité des pneumocoques associé aux cellules adhérentes sont plutôt intériorisé. D'autres applications comprennent l'essai d'autres espèces probiotiques pour la capacité d'inhiber la colonisation, et / ou à la recherche de souches bactériennes mutantes pour étudier le rôle des gènes d'intérêt spécifiques.

Une limitation évidente de cet essai in vitro est qu'il ne comprend pas un épithélium mis en place, les cellules immunitaires, la flore normale, ou d'autres facteurs susceptibles d'influer sur la colonisation pneumococcique in vivo. Pour évaluer pleinement si les probiotiques could être utile dans la prévention de la colonisation pathogène dans les voies respiratoires, des études in vivo sur des modèles animaux et des essais cliniques humains sont garanties. Néanmoins, des essais in vitro d'adhérence servent un écran utile pour identifier les probiotiques avec le potentiel d'inhiber l'adhésion à pneumocoques et peuvent fournir des informations sur les stratégies de dosage préférentiels, ainsi que de fournir un modèle expérimental qui peut être utilisé pour des études mécanistiques.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par un financement du Programme opérationnel de soutien de l'infrastructure du gouvernement victorien Institut de recherche et enfants Murdoch.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

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References

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Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

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