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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

In-vitro-Assays können verwendet werden, um die Einhaltung der Befestigung von Streptococcus pneumoniae zu untersuchen, um die Zellmonoschichten epithelialen und mögliche Maßnahmen wie der Einsatz von Probiotika zur Hemmung Pneumokokken-Kolonisierung zu untersuchen.

Abstract

Anhaften von Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) an die epitheliale Auskleidung der Nasenrachenraum kann in Kolonisierung führen und wird als eine Voraussetzung für Pneumokokken-Infektionen wie Lungenentzündung und Mittelohrentzündung. In vitro Adhärenz-Assays können verwendet werden, um die Befestigung von Pneumokokken studieren zu Zelle epithelialen werden Monoschichten und mögliche Maßnahmen, wie der Einsatz von Probiotika untersuchen, um Pneumokokken-Kolonisierung zu verhindern. Das hier beschriebene Protokoll verwendet wird, um die Auswirkungen des probiotischen Streptococcus salivarius auf die Einhaltung von Pneumokokken an menschlichen Zelllinie CCL-23 zu untersuchen (manchmal als HEp-2-Zellen). Der Test besteht aus drei Stufen: 1) Vorbereitung der Epithel-und Bakterienzellen, 2) Zugabe von Bakterien epithelialen Zellmonoschichten, und 3) Detektion von anhaftenden Pneumokokken durch Keimzahl (serielle Verdünnung und Beschichtung) oder quantitative Echtzeit-PCR (qPCR ). Diese technique ist relativ einfach und keine Spezialgeräte außer einer Gewebekultur-Setup benötigen. Der Test kann verwendet werden, um andere probiotische Spezies und / oder potentiellen Inhibitoren der Pneumokokken-Kolonisation zu testen und können leicht geändert werden, um andere wissenschaftliche Fragen zur Pneumokokken-Adhärenz und Invasion zu adressieren.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist ein Gram-positive Bakterien, die Infektionen, einschließlich Lungenentzündung, Mittelohrentzündung und Hirnhautentzündung führen kann. Es ist eine der Hauptursachen der Erkrankung bei Kindern in Ländern mit niedrigem Einkommen und für geschätzte 800.000 Todesfälle von Kindern unter fünf Jahren jährlich 1 verantwortlich. Pneumokokken sind häufig in den Nasenrachenraum von Kindern durchgeführt. Obwohl dieser Kolonisation ist allgemein als asymptomatisch, sie Pneumokokkeninfektion voran und dient als Reservoir für die Bakterien in menschlichen Populationen 2. Pneumokokken-Konjugat-Impfung verringert effektiv die Beförderung der im Impfstoff enthaltenen Serotypen. Allerdings gibt es über 90 Pneumokokken-Serotypen, und die Impfung kann Serotyp Ersatz, wobei die Beseitigung der Impfstoff-Serotypen wird von einem Anstieg der Wagen und Krankheit, die durch nonvaccine Serotypen 3 verursacht, gefolgt führen. Auch in einigen Hochrisikogruppen, PneumokokkenKolonisierung tritt oft sehr früh im Leben, vor der Verabreichung der ersten Impfstoffdosis 4,5. Kürzlich wurde die Verwendung von Probiotika als zusätzliche Strategie, um Pneumokokken-Kolonisierung 6,7 hemmen, vorgeschlagen. In vitro Adhärenz-Assays wurden verwendet, um Pneumokokken Einhaltung 8,9 untersuchen. Diese Tests wurden angepasst, um die Auswirkungen des probiotischen Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) auf die Einhaltung Pneumokokken 10 zu untersuchen.

Zusätzlich zu LGG und anderen Milchsäurebakterien, Streptococcus salivarius, eine gemeinsame Bewohner der Mundhöhle, wurde als potenzielle Probiotikum für die Atemwege aufgrund seiner Besiedelung Potential und die Fähigkeit, Pneumokokken und anderen respiratorischen Pathogenen in vitro hemmen, untersucht 11 - 13. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt ein Festhalten Assay verwendet, um die Effekte von S. untersuchen salivarius K12 auf Pneumokokken-Einhaltungauf den menschlichen Zelllinie CCL-23. Vor der Verwendung im Test wurden die Pneumokokken-Isolate für die Einhaltung Fähigkeiten ausgewertet, da Wachstum und Hafteigenschaften kann im Wesentlichen zwischen den Isolaten 10,14 variieren. Wachstumskurven von Pneumokokken und S. salivarius geführt wurden bis zur mittleren log-Phase und Schätzung Konzentration (koloniebildende Einheiten oder CFU / ml) durch die optische Dichte zu bestimmen (OD, Fig. 1). Es wird empfohlen, das Wachstum von Keimzahl und OD untersuchen für jedes Isolat vor der Verwendung im Test. Dieser Test kann in jedem Labor mit Standardgewebekultureinrichtungen und Anlagen durchgeführt werden. In diesem Protokoll werden die Wirkungen von drei Dosen von S. salivarius, verabreicht 1 Stunde vor der Zugabe von Pneumokokken auf die Einhaltung von S. pneumoniae PMP843 ein Serotyp 19F Wagen Isolat aus einem Nasen-Rachen-Abstrich gewonnen werden, untersucht. Zwei verschiedene Wege, um anhaftende Pneumokokken quantifizieren vorgestellt: Plattierung auf Blut-Agar zur AbschreckungMine Keimzahl und DNA-Extraktion und Nachweis von Pneumokokken lytA Gens durch qPCR 15. Die Grund Einhaltung Assayprotokoll können leicht modifiziert werden, um verschiedene Dosen oder Zeit der Verabreichung von Probiotika testen und kann auch mit anderen bakteriellen Stämmen oder Spezies verwendet werden.

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Protocol

1. Vorbereitung der Epithelial-und Bakterienzellen

  1. Auftauen von CCL-23 Epithelzellen
    1. Vorwärmen Minimum Essential Medium (MEM), enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS) in einem 37 ° C Wasserbad für ~ 30 min.
    2. Sterilisieren Sie die Gewebekultur-zugelassenen biologischen Sicherheitsschrank mit UV-Licht für mindestens 10 min vor der Verwendung, und wischen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Flasche erwärmt Medien mit 70% Ethanol und in Biosicherheitswerkbank.
    3. Mit einer 25 ml Pipette 14 ml Medium in eine T-75-Kolben. Zeigen Kolben in 37 ° C-Inkubator, während Zellen Auftauen (Abschnitt 1.1.4).
    4. Entfernen Sie ein Fläschchen mit CCL-23-Zellen, die aus Lagerung in flüssigem Stickstoff mit entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen und warm in einem 37 ° C Wasserbad, bis ~ 80% aufgetaut.
    5. Bringen Sie den Kolben in Abschnitt 1.1.3 auf die Biosicherheitswerkbank vorbereitet. Wischaußenfläche Fläschchen CCL-23-Zellen mit 70% Ethanol und Transferinhalte (1 ml) in die T-75 Kolben mit einem P1000 Pipette.
    6. Der Kolben auf der Seite in einem 37 ° C, 5% CO 2, 95% relative Luftfeuchtigkeit Gewebekultur-Inkubator über Nacht (16-20 Stunden) inkubiert.
    7. Überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um eine gesunde Morphologie bestätigen, entfernen Medien, und ersetzen mit 15 ml frisches, vorgewärmtes MEM + 10% FBS.
  2. Wartung von CCL-23 Epithelzellen
    1. Sobald Zellen sind ~ 80% Konfluenz (1-2 Tage), Passage durch Entfernen von Medien unter Verwendung einer 25 ml Pipette und sanft die Zellen werden zweimal mit je 8-10 ml vorgewärmter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter Verwendung einer 10 ml Pipette.
    2. Entfernen PBS und 1 ml steriler 0,25% Trypsin-EDTA (0,25% (w / v) Trypsin, 0,1 mM EDTA). Drehen Kolben liegend, zu drehen, um sicherzustellen, Trypsin behandelt die konfluente Zellschicht und der Kolben für 2-3 min Inkubation in 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
    3. Zurück Kolben an die Biosicherheitswerkbank, fügen 9 ml vorgewärmten MEM + 10% FBS und Pipette auf und ab 6 -8x, um die Zellen zu resuspendieren, Ausstoßen von Flüssigkeit an der Seite des Kolbens, um Zellen zu entfernen.
    4. Split Zellen 1.15 (1 ml + 14 ml MEM + 10% FBS) oder 01.30 Uhr (0,5 ml + 14,5 ml MEM + 10% FBS), entsorgen Sie überschüssigen Zellen, und kehren Kolben an die 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
    5. Passage die Zellen mindestens zweimal vor dem Einsatz im Assay Einhaltung. Typischerweise Zellen alle 3-4 Tage aufgeteilt.
  3. Seeding von CCL-23 Epithelzellen (ein Tag vor dem Test, Protokoll Nr. 2 Einhaltung)
    1. Aufgeteilt konfluenten Zellen wie in den Abschnitten 1.2.1-1.2.3 beschrieben, Resuspendieren in vorgewärmtem MEM + 5% FBS (FBS-Konzentration gesenkt wird, um die Wahrscheinlichkeit von Serumkomponenten stören im Assay zu verringern). Entfernen Sie 20 ul Zellen und zählen mit Trypanblau-Färbung und einer Zählkammer.
    2. Verdünnte Zellen in vorgewärmtes MEM + 5% FBS in einer Konzentration von 1,5 x 10 5 Zellen / ml in ein steriles 50 ml-Röhrchen.
    3. Samen 1 ml Zellen / Vertiefung in einer GewebeKultur-behandelten 24-Well-Platte.
  4. Vorbereitung von Bakterien
    Dieses Verfahren kann zur Herstellung von Pneumokokken und S. folgen salivarius. Bakterielle Wachstumsmedien wird in der Regel in einem 37 ° C-Inkubator über Nacht auf vorgewärmte und Test auf Sterilität gehalten (in der Regel trübe erscheinen, wenn verschmutzt).
    1. Zwei Tage vor dem Test, streifen Bakterien auf Pferdeblut-Agar (HBA)-Platten Einhaltung und Inkubation bei 35-37 ° C und 5% CO 2 für 18-24 Std. Schafblut-Agar können als Alternative verwendet werden.
    2. Am folgenden Tag bereiten ein Nacht-Kultur für jeden Bakterienarten durch Pipettieren von 10 ml Todd-Hewitt-Bouillon mit 0,5% Hefeextrakt (THB + YE) Medium in ein steriles 30-ml-Tube. Mit einem 10 ul-Schleife, impfen ca. 10-12 gut getrennt Kolonien. Vortexen und Inkubation bei 35-37 ° C und 5% CO 2 für 14-16 Stunden. Beachten Sie, dass Pneumokokken wird autolysieren, wenn man zu lange in der Brühe Kultur.

    2 Die Einhaltung Assay:. Zugabe von Bakterien zu epithelialen Zellmonoschichten

    1. Vorbereitung der Mitte-log Bakterienkulturen von Pneumokokken und S. salivarius
      1. Je 10 ml vorgewärmten THB + YE in jeweils zwei sterile 30-ml-Röhrchen, eine markierte Pneumokokken und anderen S. salivarius.
      2. Um mid-log-Phase erreichen, Pneumokokken erfordern ~ 3 Stunden und S. salivarius erfordern ~ 2 h Inkubation (siehe Abbildung 1). Starten Sie beide Kulturen in der gleichen Zeit. Vortex (3-5 sec) über Nacht Bakterienkulturen und 100 ul und 100 ul Pneumokokken S. salivarius in entsprechende Röhrchen.
      3. Vortexen und Inkubation der Kulturen bei 37 ° C für ca. 2 Stunden für S. salivarius und 3 h für Pneumokokken.
    2. Vorbereitung der CCL-23-Zellen, die für die Einhaltung Assay
      1. Mit einem inversen Mikroskop, überprüfen Sie die 24-Well-Platte für confluent-Monoschichten mit gesunden Zellmorphologie. Monoschichten sollte> 80% konfluent sein, ohne Anzeichen von Zellklumpen bzw. zytopathischen Effekte wie Zellabrundung oder ein Verlust an Haftung (siehe Abbildung 2).
      2. Entfernen Sie die Medien in jede Vertiefung mit einer Transferpipette, Kippen der Platte leicht zu vermeiden, die Zellschicht zu stören.
      3. Um die Zellen vorsichtig waschen, fügen ~ 500 ul vorgewärmtes PBS in jede Vertiefung mit einer serologischen Pipette und entfernen Sie sie mit einer Transferpipette, Kippen der Platte leicht. Entsorgen Sie die PBS. Wiederholen Waschschritt einmal.
      4. Add 500 ul der vorgewärmten MEM + 5% FBS in jede Vertiefung. Geben die 24-Well-Platte zu der CO 2-Inkubator während der Herstellung der Bakterienkulturen.
        Hinweis: Um Multiplizität der Infektion (MOI) bestimmen die genaue CCL-23-Zellzahl, zwei Vertiefungen mit Trypsin behandelt und am Tag der Infektion gezählt.

    3. Adherence Assay

    1. In Pneumokokken zudie CCL-23-Zellen bei einer MOI ~ 10:1. Testen Sie die in Tabelle 1 in zwei Vertiefungen aufgeführten Bedingungen.
      1. Messung der optischen Dichte bei A 600 (OD) von 1 ml von S. salivarius Kultur. OD sollte zwischen 0,3-0,6 sein.
      2. Übertragen 5 ml S. salivarius Kultur in einen 10-ml-Röhrchen und Zentrifugieren bei 1.870 × g für 4 min.
      3. Überstand verwerfen und auf der Grundlage der OD-Wert in Abschnitt 3.1.1, S. resuspendieren salivarius in 200-1.000 &mgr; l 0,85% NaCl (Endkonzentration ~ 1,5 × 10 9 CFU / ml). Als allgemeine Richtlinie wird eine OD von 0,375 in 260 ul resuspendiert werden. Bereiten 1:10 und 1:100 Verdünnungen von S. salivarius mit 0,85% NaCl.
        Hinweis: Insgesamt drei Konzentrationen (die hohe, mittlere und niedrige Dosen) von S. salivarius in dem Assay getestet werden. Die hohe Dosis ein Verhältnis von ~ 10 S. salivarius: 1 Pneumokokken, das Medium ca. 1 S. salivarius: 1 Pneumokokken, und die niedrig ist ~ 1 S. salivarius: 10 Pneumokokken.
      4. Nehmen Sie die 24-Well-Platte aus dem Inkubator.
      5. Von den Heparin Kontrollvertiefungen, entfernen 40 ul Medium und 50 ul von Heparin (1.000 U / ml Stammkonzentration) für eine endgültige Konzentration von 100 U / ml.
      6. In 10 ul von 0,85% NaCl auf Vertiefungen, die CCL-23-Zellen, die nur und Vertiefungen, die CCL-23-Zellen und Pneumokokken (keine S. salivarius).
      7. In 10 ul unverdünnt, 1:10 und 1:100 von S. salivarius in die jeweiligen Vertiefungen.
        Hinweis: S. salivarius kann auch gleichzeitig als Pneumokokken (Koaddition) oder 1 h zugegeben werden, nachdem Pneumokokken (nachträgliche Zugabe), um die Wirkung der Zeit des probiotischen Verabreichung zu untersuchen.
      8. Zentrifugieren der 24-Well-Platte bei 114 × g für 3 min auf Bakterienkontakt mit der Zellschicht zu fördern und Inkubation für 1 h bei 37 ° C, 5% CO 2.
      9. Führen serielle Verdünnung des S. salivarius Lager in 0,85% NaCl und Platte auf doppelte HBAPlatten für die Keimzahl. Fügen Sie zuerst 50 ul Lager auf 450 ul von 0,85% NaCl, eine 10 -1 Verdünnung zu machen, dann Impulswirbel (5 sec), ändern Tipps, und 50 ul der 10 -1 Verdünnung auf 450 ul von 0,85% NaCl um eine 10 -2 Verdünnung zu machen und so weiter bis zu 10 -7.
      10. Platte 100 ul der 10 -5, 10 -6 und 10 -7 Verdünnungen in zweifacher Ausfertigung auf HBA-Platten und verbreiten mit einer sterilen Treuer. Inkubieren HBA Platten über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 invertiert.
      11. Gegen Ende der 1-stündigen Inkubation wiederholen Abschnitte 3.1.1-3.1.3 für Pneumokokken. OD sollte zwischen 0,2-0,7 sein. Zentrifugieren Sie 1 ml Pneumokokken Kultur und das Pellet in 300-2.000 &mgr; l 0,85% NaCl (bezogen auf das OD-Wert) auf eine Konzentration von ca. 1,5 x 10 8 CFU / ml. Als allgemeine Richtlinie wird eine OD von 0,3 in 500 ul resuspendiert werden.
      12. Nach 1 Stunde Inkubation mit S. salivarius, mit 10 μ, (Nur die Zellen enthalten) l unverdünnt Pneumokokken in alle Wells außer Negativkontrollen.
      13. Zentrifugieren der 24-Well-Platte bei 114 × g für 3 min und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 3 Stunden. Führen serielle Verdünnung der Pneumokokken Lager in 0,85% NaCl, wie in Abschnitt 3.1.9 und Platten Verdünnungen 10 -4, 10 -5, -6 und 10 auf doppelte HBA Platten für Keimzahl beschrieben.
    2. Nach 3 Stunden, überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass Monoschichten gesund (siehe Abbildung 2) zu suchen. Entfernen Sie die Medien aus jeder Vertiefung und vorsichtig waschen die Zellen 3x, wie in Abschnitt 2.2.3 beschrieben. mit einer anderen Pipette für jede Bedingung. Dieser Schritt ist wichtig, um nicht anhaftende Pneumokokken entfernen. Die Monoschichten sollten während des Waschprozesses nicht zerfällt; Dies kann durch erneutes Prüfen unter einem Mikroskop bestätigt werden.

    Hinweis: Medien während dieses Schrittes entfernt werden bei -20 ° C für weitere Analysen aufbewahrt werden (<em> zB Messung der Zytokin-Ebenen).

    1. Geben Sie 200 ul 0,1% Digitonin (eine sanfte Reinigungsmittel) in jede Vertiefung und Inkubation für 7 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
    2. In 800 ul von THB Medien in jede Vertiefung. Lyse Zellen durch Pipettieren von oben und unten, und, wenn nötig, kratzen Wells 3-4x mit der Pipettenspitze um sicherzustellen, dass die Zellschicht vollständig entfernt wird. Ändern Sie Tipps, zwischen Brunnen.
    3. Entfernen Sie die Inhalte aus jede Vertiefung mit einer Pipette P1000 und übertragen in markierte Mikrozentrifugenröhrchen.

    4. Quantifizierung von adhärenten Pneumokokken

    Adherent Pneumokokken kann durch die Bestimmung Keimzahl (serielle Verdünnung und Plattierung auf Blut-Agar) oder durch quantitative Echtzeit-PCR quantifiziert werden.

    1. Lebendkeimzahl-Methode
      Diese Methode muss unmittelbar nach Schritt 3.5 der Einhaltung Test durchgeführt werden.
      1. Für jeden Test gut vorbereiten serielle Verdünnungen der Proben gesammeltSchritt 3.5 der Adhärenz-Assay durch Zugabe von 50 &mgr; l-Proben zu 450 ul 0,85% NaCl, Impuls Vortexen und seriell verdünnt, wie in Abschnitt 3.1.9 bis 10 -6-Verdünnung beschrieben.
      2. Platte 100 ul der 10 -3, 10 -4, 10 -5, und 10 -6 Verdünnungen in zweifacher Ausfertigung auf Blut-Agar, verbreiten mit einer sterilen Spreizer, und Inkubation umgekehrten Platten über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. Beachten Sie, dass die Vertiefungen, die CCL-23-Zellen allein sollten keine Bakterien enthalten und kann plattiert werden ordentlich (100 ul unverwässert) als Sterilitätskontrolle.
      3. Der folgende Tag, bestimmen die Pneumokokken-Inokula durch Zählen der Kolonien auf den entsprechenden Verdünnungsplatten (mit 30 bis 300 Kolonien) in Abschnitt 3.1.13 der Einhaltung Assay vorbereitet. Berechnen der CFU / ml des Inokulums mit dem Mittelwert von zwei Platten. Ebenso bestimmen die S. salivarius Inokula durch Auszählen der Kolonien auf den Platten vorbereitetin Abschnitt 3.1.10.
        Hinweis: Die Platten sollten nur Pneumokokken enthalten; das Vorhandensein von anderen Arten gibt an, dass der Test kontaminiert und die Ergebnisse ungültig sind.
      4. Um die Einhaltung Pneumokokken-Ebenen bestimmen, zählen die entsprechenden Verdünnungsplatte (mit 30-300 Pneumokokken-Kolonien) für jede Probe in Abschnitt 4.1.1 vorbereitet. Beachten Sie, dass S. salivarius Kolonien klein und weiß sein, während Pneumokokken wird flach und grünlich durch α-Hämolyse, wie in Abbildung 3 dargestellt. Zur Berechnung Pneumokokken-Adhärenz, normalisieren die Anzahl der adhärenten Pneumokokken aus Bedingung b. CCL-23-Zellen + Pneumokokken bis 100%, und vergleichen haft Pneumokokken von anderen Bedingungen für diese Bedingung.
    2. qPCR-Methode
      Proben, die in Einhaltung Assay gesammelt Schritt 3.5 kann bei -20 ° C bis zur DNA-Extraktion gelagert werden. DNA-Extraktion unter Verwendung eines kommerziellen Kits durchgeführt und in den Abschnitten 4.2.1-4.2.9 und der qPCR alssagen, in den Abschnitten 4.2.10-4.2.20.
      1. Das enzymatische Lyse-Puffer (50 mM Phosphatpuffer pH 6,7, enthaltend 1 mg / ml Lysozym, 0,075 mg / ml Mutanolysin und 2 mg / ml Proteinase K). Das folgende Rezept kann verwendet werden, machen 10 ml (ausreichend für 50 Extraktionen). Die enzymatische Lyse-Puffer sollte frisch zubereitet vor Gebrauch.

        7,25 ml 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,7)
        1,00 ml 10 mg / ml Lysozym Lager für eine endgültige [1 mg / ml]
        0,75 ml 1 mg / ml Lager für eine endgültige [0,075 mg / ml] Mutanolysin
        1,00 ml 20 mg / ml Proteinase K Lager für eine endgültige [2 mg / ml]
      2. Tauen Sie die Proben auf Eis oder bei 4 ° C Wirbel-und Transfer 100 ul Aliquots jeder Probe in markierte Mikrozentrifugenröhrchen. Zurück Originalmuster zurück in die -20 ° C Gefrierschrank.
      3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 6700 g für 10 min.
      4. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. In 200 ul der enzymatischen Lyse-Puffer zum Pellet-und Wirbel zu resuspendieren. Incubaß die Proben bei 56 ° C für 30 min. Kurz zentrifugieren (5 sec) bei 6.700 xg Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln.
      5. Werden 10 ul 20% SDS, die Zell-Lyse zu vervollständigen und vorsichtig bei Raumtemperatur für 2 min.
      6. In 4 ul RNase A (100 mg / ml Stamm) und vorsichtig mischen (auf einer Wippe oder durch Umdrehen der Röhrchen) bei Raumtemperatur für 2 min.
      7. Geben Sie 200 ul Puffer AL (aus dem Kit) und Vortex für 15 Sekunden. Proben inkubieren bei 70 ° C für 10 min. Kurz zentrifugieren (5 sec) bei 6.700 xg Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln.
      8. In 200 ul von 100% EtOH und Vortex für 15 Sekunden. Spin kurz, um die Flüssigkeit auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln, übertragen Sie dann die Mischung (einschließlich Niederschlag) an die Spin-Säule (in einem 2-ml-Tube) ohne Benetzung der Felge. Folgen Waschschritte nach der Protokoll des Herstellers (hier nicht gezeigt).
      9. Zum Eluieren der DNA übertragen Säule in einem markierten Mikrozentrifugenröhrchen, 50 &mgr; l Puffer AE (from Kit), und bei Raumtemperatur für 2 min. Zentrifuge bei 4300 g für 1 min. Einmal wiederholt für eine endgültige Elutionsvolumen von 100 ul. DNA bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
      10. Um qPCR durchzuführen, sterilisieren die Hauben mit UV-Licht für 15 Minuten vor dem Start. Vorbereiten einer 96-Well-Platte Karte Arbeitsblatt, um auch Standorte für jede Probe aufzeichnen wird empfohlen.
      11. Bereiten Standardkurve mit einer 10 ng / ul Lager von genomischer DNA Pneumokokken (von Referenzstamm ATCC 6305 entnommen).
        1. Auftauen Pneumokokken-Lager DNA und kurz abzentrifugieren (5 sec) in einer Tischzentrifuge.
        2. Führen 01.10 serielle Verdünnungen in 6 vormarkiert Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 3 ul DNA auf 27 ul Nuklease-freiem H 2 O, Tipps und Wechsel zwischen den einzelnen Wirbeln Verdünnung. Die endgültige Verdünnungsreihe besteht aus 6 Röhren: 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 und 0,00001 ng / ul.
          Anmerkung: Dies kann bei 4 ° C für bis zu einer Woche gelagert werden.
      12. PreparE lytA Mastermix wie in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen in einem sterilen PCR Haube folgt. Komponenten auf Eis auftauen und Wirbel unmittelbar vor der Verwendung. et al. Veröffentlicht und 15 sind in der Liste der Materialien gezeigt.
      13. Vortex und Last 23 ul / der lytA mischen in die Vertiefungen. Siehe Karte Platte.
      14. Transport Platte zusätzlich Bereich (vorzugsweise eine sterile Schrank in einem separaten Raum) für die Probenlade Vorlage.
      15. Verwenden Sie eine P2-Pipette, um Proben zu laden, ändern Tipps für jeden gut. Alle Proben werden doppelt durchgeführt. Siehe Karte Platte für die Lage.
      16. Für Standardkurve Brunnen, fügen Sie 1 ul / Vertiefung Die geeignete Verdünnung des Standardkurve DNA plus 1 ul / H 2 O, um das endgültige Volumen auf 25 ul zu bringen.Für Nicht-Template-Kontrollvertiefungen, fügen Sie 2 ul H 2 O.
      17. Add 2 ul / Vertiefung DNA-Probe in die entsprechenden Wells.
      18. Verschließen Sie alle Brunnen im Einsatz. Stellen Sie sicher, Kappen sind eng geschlossen. Drehen Sie schnell die PCR-Platte (5 sec) vor dem Einlegen der Platte in einer Echtzeit-PCR-Maschine.
      19. Lastplatte in PCR-Maschine und Lauf qPCR nach den Anweisungen des Maschinenherstellers. Die folgenden Hydrolyse Sonde Zyklusbedingungen werden empfohlen:
        20. Komponente pro Reaktion x 102 (Vollplatte)
        lytA F 0,25 ul 10 uM Lager 25,5 ul
        lytA R 0,25 ul 10 uM Lager 25,5 ul
        lytA Sonde 0,5 ul 10 uM Lager 51 ul
        H 2 O 9,5 ul 969 ul
        Master-Mix 12,5 ul 1275 ul
        Das endgültige Volumen 23 ul 2346 ul
        Schritt 1 (1x): 3 min bei 95 ° C
        Schritt 2 (40x): 20 sec bei 95 ° C
        20 sec bei 60 ° C
      20. Daten sammeln und zu quantifizieren Pneumokokken-DNA anhand der Standardkurve. Bakterielle Belastungen berechnet werden, wie zuvor beschrieben 17, Schätzen, dass 1 &mgr; g genomische DNA ist äquivalent zu 447,4 Zellen und als KBE / ml (unter der Annahme, one Genom pro CFU, und eine Kopie des lytA pro Genom; siehe Abbildung 4). Für einen erfolgreichen Test sollte der R 2-Wert ≥ 0,98 und alle positive Ergebnisse im Bereich der Standardkurve (CT-Werte von weniger als für die 0,00001 ng erhalten / ul Standardkurve Punkt werden als Hintergrund / lytA negativ).
        Hinweis: Einige Echtzeit-PCR-Systeme kommen mit Analyse-Software, die verwendet werden können, um Standardkurven konstruieren und berechnen Unbekannten. Andernfalls können diese Berechnungen in Excel oder ähnlichen Programmen durchgeführt werden. Ein Beispiel für Standardkurve ist in Fig. 4 gezeigt.
      21. Um die Einhaltung Pneumokokken zu berechnen, normalisieren die Anzahl der adhärenten Pneumokokken aus Bedingung b. CCL-23-Zellen + Pneumokokken bis 100%, und vergleichen haft Pneumokokken von anderen Bedingungen für diese Bedingung.

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Representative Results

Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, bei dem Pneumokokken (S. pneumoniae PMP843 eine Kolonisierung 19F Isolat) wurden in CCL-23-Zellen 1 h nach der Zugabe von S. hinzugefügt salivarius und Pneumokokken-Adhärenz wurde sowohl Keimzahl und lytA qPCR quantifiziert werden in Tabelle 2 gezeigt. Ergebnisse waren konsistent zwischen den beiden Methoden für sowohl die absolute Anzahl von Bakterien (wie CFU / ml dargestellt) und die Einhaltung%, normiert auf die Anzahl adhärenter Pneumokokken in den Vertiefungen Pneumokokken allein enthält. Heparin wird als Kontrolle verwendet, da es bekannt ist, Pneumokokken Einhaltung hemmen und somit die reduzierte Einhaltung der Pneumokokken + Heparin Zustand (typischerweise <40% gegenüber Pneumokokken allein) ist bezeichnend für einen erfolgreichen Test. S. salivarius hemmt Pneumokokken Halten in einer Dosis-abhängigen Weise, wie in Tabelle 2, wo die hohe Konzentration von S. gezeigten salivarius (ungefährly 10 S. salivarius: 1 Pneumokokken) ergab die niedrigsten Pneumokokken Haftung.

Figur 5 zeigt das Anhaften von Pneumokokken an CCL-23-Zellen, als S. salivarius wird 1 Stunde vor Pneumokokken (Vorauszusatz), gleichzeitig (Koaddition) oder 1 Stunde nach Pneumokokken (post-Zusatz). S. salivarius ist effektiver bei der Hemmung der Pneumokokken-Einhaltung, wenn vor Pneumokokken hinzugefügt, da sowohl der hohen und mittleren Dosen von S. salivarius deutlich reduziert Pneumokokken-Einhaltung in der Vorauszusatz Assay (5A), während nur der hohen Dosis von S. salivarius gehemmt Pneumokokken-Einhaltung in der Koaddition und Post-Tests hinaus (5B und 5C).

Die in Tabelle 2 und 4 und 5 Daten wurden mit einer früheren Version der lytA qPCR-Primer und Sonde 17. Das aktuelle Protokoll beschreibt die aktualisierte qPCR-Assays.

Figur 1
Fig. 1 ist. Repräsentative Wachstumskurven von S. pneumoniae PMP843 (A) und S. salivarius K12 (B). Für jede Art CFU / ml, wie durch die Lebendkeimzahl bestimmt wird, in schwarz (linke y-Achse) gezeigt, und die optische Dichte (OD) bei 600 nm ist in grau (rechte y-Achse) gezeigt. Mid-log-Phase wurde durch die Lebendkeimzahl schätzungsweise 3 Stunden für S. sein pneumoniae PMP843 und 2 Stunden für S. salivarius K12. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Abbildung 2. Beispiele für gesunde CCL-23-Zellen und CCL-23-Zellen mit zytopathischen Effekte (CPE). A) Beispiel für eine gesunde, Monolayer von CCL-23-Zellen. B) CCL-23-Zellen mit zytopathischen Effekte. Hinweis Abrundung der Zellen, hell intrazellulären Regionen und Bereichen der Monoschicht gestört, wo Zellen von der Platte gehoben. Die Bilder wurden mit einem inversen Lichtmikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 3
3. S. salivarius und Pneumokokken-Kolonien auf Pferdeblut-Agar. S. salivarius Kolonien sind klein und weiß, wie sie in der weißen angegebenPfeil und Buchstaben A. Pneumokokken (S. pneumoniae) Kolonien sind in der Regel größer, flacher, und grünlich in der Farbe, wie durch den weißen Pfeil und Buchstaben B angezeigt Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 4
4. Beispiel S. pneumoniae Standardkurve für qPCR. Genomic DNA Berechnungen werden zusammen mit Ct-Werte gezeigt (* Mittelwert von Doppelstandardkurve Brunnen aus einer repräsentativen qPCR-Assay), mit der resultierenden Standardkurve, eine Formel und R 2 in der Grafik gezeigten Wert. Klicken Sie hier, um größeres Bild zu betrachten .

Figur 5 content-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" width = "600" />
5. Wirkung von S. salivarius auf Pneumokokken Einhaltung CCL-23-Zellen Pneumokokken Einhaltung CCL-23-Zellen-Monoschichten, wenn die Zellen mit Pneumokokken allein inkubiert. (PNC, normiert auf 100%), Pneumokokken und mit 100 U / ml Heparin (Heparin) oder mit Pneumokokken und S. salivarius zugegeben in einem Verhältnis von ~ 10: S. salivarius: 1 Pneumokokken (hoch), ~ 1 S. salivarius: 1 Pneumokokken (mittel) oder ~ 1 S. salivarius:. Pneumokokken 10 (niedrig) S. salivarius wurde 1 h vor (A) zugegeben, gleichzeitig als (B) oder 1 h nach der Pneumokokken (C). n ≥ 3, * zeigt P <0,05 im Vergleich zu Pneumokokken allein (Student-t-Test). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Gruppe Assay Zustand Aufzeichnungen
A CCL-23-Zellen allein
B CCL-23-Zellen + Pneumokokken
C CCL-23-Zellen + + Pneumokokken Heparin Heparin Blöcke Pneumokokken Einhaltung Zelloberfläche glycosylaminoglycans 16 und wird als Kontrolle verwendet
D CCL-23-Zellen + Pneumokokken + S. salivarius [high] Etwa 1 Pneumokokken: S. 10 salivarius
E CCL-23-Zellen + Pneumokokken + S. salivarius [med.] Etwa 1 Pneumokokken: 1 S. salivarius
F CCL-23-Zellen + Pneumokokken + S. salivarius [low] Etwa 10 Pneumokokken: 1 S. salivarius


Tabelle 1. Bedingungen in Pneumokokken Einhaltung Assay getestet. Die sechs Grundassaybedingungen werden hier beschrieben.

6
Testanlage * CFU / ml Pnc (qPCR) % Adhärenz (qPCR) CFU / ml Pnc (Keimzahl) % Adhärenz (Keimzahl)
Allein Pnc 1,1 x 10 7 100 9,1 x 10 6 100
Pnc + Heparin 1,5 x 10 6 14 7,6 x 10 5 8
Pnc + Sal [high] 6,1 x 10 5 6 3,2 x 10 5 4
Pnc + Sal [med.] 3,6 x 10 6 33 2,7 x 10 6 29
Pnc + Sal 9,8 x 10 6 92 90

Tabelle 2: Pneumokokken Einhaltung CCL-23-Zellen nach der Zugabe von S. salivarius wie lytA qPCR und Keimzahl-Methode bestimmt Pnc * = Pneumokokken. Sal = S. salivarius; [High] = ca. 10 Sal: 1 Pnc; [Med.] = ca. 1 Sal: 1 Pnc; [Low] = ca. 1 Sal: 10 Pnc.

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Discussion

Ein wichtiger Teil dieses Assays wird um die entsprechende Konzentrationen von S. salivarius und Pneumokokken in den Abschnitten 3.1.7 und 3.1.12. Die Konzentrationen werden mit OD-Werten geschätzt, aber die genaue Inokula sind nicht bestimmt, bis Platten gezählt werden am folgenden Tag. Aus diesem Grund empfehlen wir die Durchführung von Wachstumskurven auf OD und Keimzahl (CFU / ml) über die Zeit für alle Bakterienstämme im Assay verwendet, um den mittleren log-Phase zu identifizieren und helfen bei der Schätzung der Konzentration von OD messen. Zusätzlich können Pneumokokken-Stämme im Wesentlichen in ihren Hafteigenschaften unterscheiden. Stämme mit guter Haftung (> 10% der Inokula nach einer 3-stündigen Inkubation an Epithelzellen haften) werden für Tests der Untersuchung der Fähigkeit von Probiotika auf die Einhaltung hemmen Pneumokokken empfohlen. Selbst wenn von einer erfahrenen Bedienungsperson durchgeführt, kann die Einhaltung Ebenen Test zu Test variieren, wie durch die relativ große Fehlerbalken in Figur 5 gesehen zeigt. FürAus diesem Grund empfehlen wir ein Minimum von drei Wiederholungen für jedes Experiment, mit zwei Vertiefungen für jeden Assay Zustand. Ähnliche Variabilität in Einhaltung Tests unter Verwendung von Escherichia coli 18 berichtet. In diesem Protokoll werden die Zellen für 3 h nach der Zugabe von Pneumokokken inkubiert. Die Inkubationszeit kann verkürzt werden, wenn die Einhaltung Zeitverlaufsexperimente werden durchgeführt, und zeigen, dass die Mehrzahl der Bakterien während der ersten Stunde der Inkubation haften werden.

Dieses Protokoll stellt zwei Methoden zur Quantifizierung Pneumokokken-Adhärenz, qPCR und lebensfähigen Zählen. Beide Methoden sind geeignet, und die Wahl hängt von der Präferenz und verfügbare Laborgeräte des Betreibers (zB Zugang zu einem Echtzeit-PCR-Maschine). Quantifizierung von lebensfähigen Zählen ist ein Low-Cost-Methode, die keine zusätzlichen Reagenzien oder ein Echtzeit-PCR-Maschine erfordert. Jedoch verwendet es viele Platten (typischerweise 80 Platten für eine 12-Well-Assay) und muss sofort durchgeführt werdenly am Ende des Tests, und Zählen Pneumokokken Kolonien schwierig auf Platten, die eine große Menge an S enthalten sein salivarius. Quantifizierung von qPCR ist teurer und erfordert einen langen DNA-Extraktionsschritt, aber Proben sind eingefroren und in Chargen verarbeitet werden, die Effizienz steigern. Die extrahierte DNA kann auch für andere Zwecke, wie qPCR Detektion von anhaftenden S verwendet werden salivarius. Wenn die Untersuchung S. salivarius Haftung, ist es empfehlenswert, Brunnen mit CCL-23-Zellen plus S. umfassen salivarius (ohne Pneumokokken) und Brunnen mit CCL-23-Zellen plus S. salivarius und Heparin als zusätzliche Kontrollen.

Die Grund Assay kann auch angepasst, um andere wissenschaftliche Aspekte der Kolonisation zu untersuchen. Zum Beispiel kann die Wirkung von Probiotika auf die Cytokin-Produktion durch Speichern und Analysieren Zellüberstände bewertet. Der Test kann auch geändert werden, um das Eindringen von Bakterien zu untersuchen, anstatt die Einhaltung vonInkubation Zellen mit Zellmembran undurchlässig Antibiotika, um extrazelluläre Bakterien vor der Ernte und Lyse von Zellen zu töten. Wie hier beschrieben, ist der Test nicht zwischen Anhänger und invasive (verinnerlicht) Pneumokokken unterscheiden. Jedoch waren frühere Studien haben gezeigt, das Niveau der internalisierten Pneumokokken sehr klein (typischerweise ≤ 0,01% Inokulum) 10 so für die meisten Isolate (einschließlich PMP843), die überwiegende Mehrzahl der Zell-assoziierten Pneumokokken sind adhärente und nicht internalisiert. Zusätzliche Anwendungen umfassen Testen anderen probiotischen Spezies für die Fähigkeit zur Kolonisierung zu inhibieren und / oder das Betrachten von mutierten Bakterienstämme, die Rolle spezifischer Gene von Interesse zu untersuchen.

Eine offensichtliche Einschränkung dieser in-vitro-Test ist, dass es enthält keine etablierten Epithel, Immunzellen, die normale Flora oder andere Faktoren, die wahrscheinlich Einfluss auf Pneumokokken-Kolonisierung in vivo. Um vollständig zu bewerten, ob Probiotika could hilfreich bei der Verhinderung Erreger Besiedlung der Atemwege, in vivo-Studien mit Tiermodellen und klinischen Studien am Menschen garantiert sind. Dennoch dienen in vitro-Assays Einhaltung als nützliche Bildschirm zur Identifizierung Probiotika mit dem Potenzial, Pneumokokken Einhaltung hemmen und Informationen zu Vorzugsdosierungsstrategien sowie zur experimentellen Modell, das für mechanistische Untersuchungen verwendet werden kann.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Murdoch Childrens Research Institute und betriebliche Infrastruktur-Support-Programm der Regierung von Victoria unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

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Immunologie Grampositive bakterielle Infektionen Lungenentzündung bakterielle Lungenkrankheiten Atemwegsinfektionen, Adhärenz Kolonisation Probiotika,
Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay
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Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

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