Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

במבחנה יכולים לשמש מבחני דבקות ללמוד את הקובץ המצורף של Streptococcus pneumoniae לאפיתל monolayers תא ולחקור התערבויות פוטנציאליות כגון השימוש בפרוביוטיקה לעיכוב קולוניזציה ריאות.

Abstract

היצמדות של Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) לאפיתל רירית לוע האף יכולה לגרום לקולוניזציה, והוא נחשב תנאי לדלקות ריאות כגון דלקת ריאות ודלקת אוזן תיכונה. ניתן להשתמש במבחני חוץ גופית דבקות ללמוד את הקובץ המצורף של pneumococci לאפיתל תא monolayers ולחקור התערבויות פוטנציאליות, כגון השימוש בפרוביוטיקה, לעכב קולוניזציה ריאות. הפרוטוקול המתואר כאן משמש כדי לחקור את ההשפעות של salivarius סטרפטוקוקוס פרוביוטיים על הדבקות של pneumococci לשורת תאי אפיתל האנושי CCL-23 (המכונה לעתים הפ-2 תאים). Assay כרוך בשלושה שלבים עיקריים: 1) הכנה של תאי האפיתל וחיידקים, 2) תוספת של חיידקים לאפיתל monolayers תא, ו3) זיהוי של pneumococci חסיד ידי ספירת קיימא (דילול סדרתי וציפוי) או כמוני בזמן אמת PCR (qPCR ). טק זוhnique הוא פשוט יחסית ולא דורש ציוד מיוחד מלבד התקנה בתרבית רקמה. Assay יכול לשמש כדי לבדוק את המינים פרוביוטיים אחרים ו / או מעכבים פוטנציאליים של קולוניזציה דלקת ריאות וניתן לשנות בקלות כדי לענות על שאלות מדעיות אחרות בנוגע לדבקות ופלישת ריאות.

Introduction

pneumoniae Streptococcus (pneumococcus) הוא חיידק גראם חיובי שיכול לגרום לזיהומים כוללים דלקת ריאות, דלקת אוזן תיכונה, ודלקת קרום מוח. זה גורם עיקרי למחלות אצל ילדים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ואחראים למותם משוער של 800,000 ילדים מתחת לגיל חמש בשנה 1. Pneumococci לעתים קרובות נשא בלוע אפם של ילדים צעירים. למרות התישבות זו נחשבת בדרך כלל ללא תסמינים, הוא מקדים את זיהום pneumococcal ומשמש כמאגר לחיידקים באוכלוסיות אנושיות 2. חיסון המצומד דלקת ריאות ביעילות מפחית את הכרכרה של קפסיד הכלולים בתוך החיסון. עם זאת, ישנם מעל 90 זנים אל ריאות, וחיסון יכול להוביל להחלפת סרוטיפ, לפיה החיסול של זנים אל חיסון ואחריו עלייה בכרכרה ומחלה הנגרמת על ידי זנים אל nonvaccine 3. כמו כן, בחלק מאוכלוסיות בסיכון גבוה, דלקת ריאותהתישבות מתרחשת לעתים קרובות בשלב מוקדם מאוד בחיים, לפני מתן מנת החיסון הראשונה 4,5. לאחרונה, השימוש בפרוביוטיקה הוצע כאסטרטגיה נוספת כדי לעכב 6,7 קולוניזציה pneumococcal. במבחני חוץ גופית דבקות שנוצלו כדי לבחון דבקות pneumococcal 8,9. מבחני אלה הותאמו כדי לחקור את ההשפעה של לקטובצילוס GG rhamnosus פרוביוטיים (LGG) על דבקות pneumococcal 10.

בנוסף לLGG וחיידקים חומצה לקטית אחרים, סטרפטוקוקוס salivarius, תושב נפוץ של חלל הפה, נחקר כפרוביוטיים פוטנציאל לדרכי הנשימה עקב קולוניזציה את הפוטנציאל שלה והיכולת לעכב pneumococci ופתוגנים אחרים בדרכי הנשימה במבחנה 11 - 13. הפרוטוקול המובא כאן מתאר assay דבקות בשימוש כדי לחקור את השפעותיו של ס ' salivarius K12 על דבקות pneumococcalלשורת תאי אפיתל האנושית CCL-23. לפני השימוש בassay, מבודד pneumococcal הוערכו על יכולות דבקות, כמו צמיחה ודבקות מאפיינים יכולים להשתנות באופן משמעותי בין מבודד 10,14. עקומות גדילה של pneumococci וס salivarius בוצע כדי לקבוע שלב אמצע יומן וריכוז אומדן (יחידות מושבה להרכיב או CFU / מיליליטר) על ידי צפיפות אופטית (OD, איור 1). מומלץ לבחון את הצמיחה על ידי ספירה וOD קיימא עבור כל בודד לפני השימוש בassay. assay זה יכול להתבצע בכל מעבדה עם מתקני תרבות תקן רקמות וציוד. בפרוטוקול זה, את ההשפעות של שלוש מנות של ס salivarius מנוהל 1 שעות לפני התוספת של pneumococci על דבקותו של ס ' pneumoniae PMP843, 19F בודד מרכבת סרוטיפ נגזר מספוגית האף והלוע, נבחנים. שתי דרכים שונות כדי לכמת pneumococci חסיד מוצגות: ציפוי על אגר דם כדי להרתיעשלי ספירות קיימא, ומיצוי DNA וזיהוי של גן lytA pneumococcal ידי 15 qPCR. פרוטוקול assay הדבקות הבסיסי ניתן לשנות בקלות כדי לבדוק מינונים או זמן של ממשל של פרוביוטיקה שונים ויכול לשמש גם עם זני חיידקים אחרים או מין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת אפיתל ותאים חיידקיים

  1. הפשרת CCL-23 תאי אפיתל
    1. מדיה Prewarm המינימום הכרחית (MEM) המכילה 10% שור סרום עוברי (FBS) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 30 ~ דקות.
    2. לעקר את ארון בטיחות הביולוגית שאושר בתרבית הרקמה עם אור UV במשך דקות לפחות 10 לפני השימוש, ולנגב את אזור העבודה עם 70% אתנול. נגב את בקבוק התקשורת חימם עם אתנול 70% ומקום בארון בטיחות ביולוגי.
    3. בעזרת פיפטה 25 מיליליטר, להעביר 14 מיליליטר של מדיה לתוך בקבוק T-75. הנח בקבוק ב37 ° C בחממה תוך תאי הפשרה (סעיף 1.1.4).
    4. הסר את בקבוקון של CCL-23 תאי אחסון חנקן נוזלי באמצעות אמצעי זהירות מתאימה וחם באמבט מים 37 ° C עד ~ 80% מופשרים.
    5. להחזיר את הבקבוק שהוכן בסעיף 1.1.3 לארון הבטיחות הביולוגי. נגב פני השטח חיצוניים של בקבוקון של CCL-23 תאים עם 70% אתנול ותכני העברה (1 מיליליטר) לתוך T-75 בקבוק בעזרת פיפטה P1000.
    6. דגירה את הבקבוק על צידו ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לילה (16-20 hr) 95% בתרבית רקמת חממת לחות יחסית.
    7. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר מורפולוגיה בריאה, להסיר תקשורת, ולהחליף עם 15 מיליליטר טרי, prewarmed MEM +10 FBS%.
  2. תחזוקה של CCL-23 תאים אפיתל
    1. ברגע שתאים ~ מחוברות 80% (1-2 ימים), מעבר על ידי הסרת תקשורת באמצעות פיפטה 25 מ"ל ולשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם 8-10 מיליליטר prewarmed פוספט שנאגרו מלוח (PBS) באמצעות פיפטה מיליליטר 10.
    2. הסר PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA סטרילי (0.25% (טריפסין w / v), 0.1 mM EDTA). הפעל בקבוק בצד שלה, לסובב כדי להבטיח טריפסין מכסה את השכבה ומחוברות של תאים, ודגירת הבקבוק במשך 2-3 דקות במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור.
    3. להחזיר בקבוק לארון הבטיחות הביולוגי, להוסיף 9 מיליליטר prewarmed MEM +10 FBS%, ופיפטה מעלה ומטה - 68x לresuspend התאים, ולהוציא נוזל למטה בצד של הבקבוק כדי לסלק תאים.
    4. פיצול תאים 01:15 (MEM מיליליטר 1 מיליליטר + 14 +10% FBS) או 1:30 (0.5 מיליליטר + 14.5 מיליליטר MEM +10% FBS), להשליך תאים עודפים, ולהחזיר את הבקבוק כדי מעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור.
    5. מעבר התאים לפחות פעמיים לפני השימוש בassay הדבקות. בדרך כלל תאים מפוצלים כל 3-4 ימים.
  3. זריעה של CCL-23 תאי אפיתל (יום אחד לפני לדבקות assay, פרוטוקול 2)
    1. פיצול תאים ומחוברות כמתואר בסעיפים 1.2.1-1.2.3, resuspending בMEM prewarmed + 5% FBS (ריכוז FBS הוא הוריד כדי להקטין את הסיכוי של רכיבים בסרום להתערב בassay). הסר 20 μl של תאים ולספור באמצעות מכתים trypan כחול וhemocytometer.
    2. לדלל תאים בממ + 5% FBS prewarmed לריכוז של 1.5 x 10 5 תאים / מיליליטר בצינור מיליליטר סטרילי 50.
    3. זרעי 1 מיליליטר של תאים / גם ברקמותהתרבות טופלה 24 גם צלחת.
  4. הכנה של חיידקים
    הליך זה יכול להיות אחרי להכנת pneumococci וס salivarius. תקשורת צמיחת חיידקים נשמרת בדרך כלל בחממה 37 מעלות צלזיוס הלילה לprewarm ומבחן לעקרות (בדרך כלל תופיע מעונן אם מזוהם).
    1. יומיים לפני לדבקות assay, חיידקי פס על אגר דם סוס צלחות (HBA) ו לדגור על 35-37 ° C ו 5% CO 2 למשך 18-24 שעות. אגר דם כבשים יכול לשמש כחלופה.
    2. למחרת, להכין תרבות לילה לכל מיני חיידקים על ידי pipetting 10 מיליליטר טוד יואיט מרק עם 0.5% תמצית שמרים בינוניים (THB + YE) לתוך צינור מיליליטר סטרילי 30. באמצעות לולאת 10 μl, לחסן כ 10-12 מושבות מופרדות היטב. בקצרה מערבולת ולדגור על 35-37 ° C ו 5% CO 2 למשך 14-16 שעה. שים לב שpneumococci יהיה autolyze אם נותרו זמן רב מדי בתרבות במרק.

    2 דבקות Assay:. תוספת של חיידקים לאפיתל Monolayers הסלולרי

    1. הכנת תרבויות חיידקי אמצע יומן של pneumococci וס salivarius
      1. פיפטה 10 מיליליטר של THB + YE prewarmed לכל אחד משני 30 צינורות מיליליטר סטרילי, pneumococci כותרת אחד וס האחר salivarius.
      2. כדי להגיע לשלב אמצע יומן, pneumococci דורש ~ 3 שעות וס salivarius דורש ~ 2 דגירה שעה (ראה איור 1). התחל שני התרבויות באותו הזמן. ורטקס (3-5 שניות) תרבויות חיידקי לילה ולהוסיף pneumococci μl 100 ו100 μl ס salivarius לתוך צינורות מקביל.
      3. בקצרה מערבולת ודגירת התרבויות ב37 מעלות צלזיוס למשך כ 2 שעות לס salivarius ו3 שעות לpneumococci.
    2. הכנת CCL-23 תאים עבור assay הדבקות
      1. באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, בדוק את צלחת 24 גם לconfluenmonolayers לא עם מורפולוגיה של תאים בריאים. Monolayers צריך להיות> מחוברות 80%, ללא עדות להתקבצות תא או השפעות cytopathic כגון עיגול תא או אובדן של דבקות (ראו איור 2).
      2. הסר את המדיה בכל טוב בעזרת פיפטה העברה, מטה את הצלחת מעט כדי להימנע מלהפריע לmonolayer התא.
      3. לשטוף בעדינות את התאים, להוסיף ~ 500 μl PBS prewarmed לבאר כל באמצעות פיפטה סרולוגיות ולהסיר אותו עם טפטפת העברה, מטה את הצלחת במקצת. מחק את PBS. חזור על שלב לשטוף פעם אחת.
      4. הוסף 500 μl של MEM prewarmed + 5% FBS לתוך כל טוב. להחזיר את צלחת 24 גם לחממת CO 2 בעת הכנת תרבויות חיידקים.
        הערה: כדי לקבוע את מספר התא המדויק CCL-23 לריבוי של זיהום (משרד הפנים), ניתן trypsinized שתי בארות וספר ביום של זיהום.

    3. Assay דבקות

    1. להוסיף לpneumococciCCL-23 התאים במשרד הפנים ~ 10:1. בדוק את התנאים המפורטים בטבלה 1 בבארות כפולות.
      1. מדוד את הצפיפות האופטית ב600 (OD) של 1 מיליליטר של ס תרבות salivarius. OD צריך להיות בין 0.3-0.6.
      2. להעביר 5 מיליליטר של ס תרבות salivarius לתוך צינור 10 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 1,870 XG במשך 4 דקות.
      3. בטל supernatant ומבוסס על קריאת OD בסעיף 3.1.1, resuspend ס salivarius ב200-1,000 μl של 0.85% NaCl (ריכוז סופי ~ 1.5 x 10 9 CFU / מיליליטר). כקו מנחה כללי, OD של 0.375 יהיה מושעה ב260 μl. הכן 1:10 ו 1:100 דילולים של ס salivarius באמצעות 0.85% NaCl.
        הערה: בסך הכל, שלושה ריכוזים (המייצגים גבוה, בינוני ומינונים נמוכים) של ס ' salivarius ייבחן בassay. במינון הגבוה הוא יחס ~ 10 ס salivarius: pneumococci 1, המדיום הוא ~ 1 ס salivarius: pneumococci 1, והנמוך הוא ~ 1 S. salivarius: 10 pneumococci.
      4. קח את צלחת 24 גם מן החממה.
      5. מהבארות שליטת הפרין, להסיר 40 μl של תקשורת ולהוסיף 50 μl של הפרין (1,000 U / ריכוז מניית מיליליטר) לריכוז סופי של 100 U / ml.
      6. הוסף 10 μl של 0.85% NaCl לבארות המכילות CCL-23 תאים בלבד ובארות המכילות CCL-23 תאים וpneumococci (אין ס salivarius).
      7. הוסף 10 ul של דילול מלא, 1:10 ו 1:100 של ס ' salivarius לבארות, בהתאמה.
        הערה: ס ניתן גם להוסיף salivarius באותו הזמן כpneumococci (coaddition) או 1 שעות לאחר pneumococci (הודעה בנוסף-) כדי לבחון את ההשפעה של זמן של ממשל פרוביוטיים.
      8. צנטריפוגה את הצלחת 24 גם ב114 XG במשך 3 דקות כדי לקדם את הקשר בקטריאלי עם שכבת תאי דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
      9. לבצע דילול סדרתי של ס מניית salivarius ב0.85% NaCl וצלחת על HBA הכפולצלחות לספירה ובת קיימא. ראשית, להוסיף 50 μl של המניה ל450 μl של 0.85% NaCl לעשות 10 -1 דילול, ולאחר מכן דופק המערבולת (5 שניות), טיפים לשינוי, ולהוסיף 50 μl של דילול 10 -1 ל450 μl של 0.85% NaCl לעשות דילול 10 -2 וכן הלאה עד 10 -7.
      10. של 10 -5 פלייט 100 μl, 10 -6, ו10 -7 דילולים בשני עותקים על צלחות HBA והתפשטו עם מפזר סטרילי. דגירה צלחות HBA ההפוכה לילה בשעה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
      11. לקראת סוף הדגירה 1 שעות, חזרו על סעיפים 3.1.1-3.1.3 לpneumococci. מכנסי הש"כ צריך להיות בין 0.2-.7. ספין למטה 1 מיליליטר של תרבות pneumococcal וresuspend את הכדור ב300-2,000 μl של 0.85% NaCl (המבוסס על קריאת OD) לריכוז של ~ 1.5 x 10 8 CFU / מיליליטר. כקו מנחה כללי, OD של 0.3 יהיה מושעה ב500 μl.
      12. לאחר דגירה 1 שעות עם ס ' salivarius, להוסיף 10 μ; Pneumococci חי ליטר לכל הבארות מלבד בארות בקרה שליליות (המכילות תאים בלבד).
      13. צנטריפוגה את צלחת 24 גם ב114 XG במשך 3 דקות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 שעות. לבצע דילול סדרתי של מניות pneumococci ב0.85% NaCl כפי שתואר בסעיף 3.1.9 ודילולי צלחת 10 -4, 10 -5, ו10 -6 על צלחות HBA כפולות לספירה ובת קיימא.
    2. אחרי 3 שעות, בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי monolayers נראה בריא (ראה איור 2). הסר את המדיה מכל טוב ולשטוף בעדינות את התאים 3x כמפורט בסעיף 2.2.3. באמצעות פיפטה שונה לכל מצב. צעד זה הוא חיוני כדי להסיר pneumococci nonadherent. Monolayers לא צריך להתפרק במהלך תהליך הכביסה; זה יכול להיות מאושר על ידי בדיקה שוב תחת מיקרוסקופ.

    הערה: ניתן לאחסן מדיה הוסרה במהלך שלב זה ב -20 ° C עבור ניתוח נוסף (<em> לדוגמא מדידה של רמות ציטוקינים).

    1. הוסף 200 μl של digitonin 0.1% (חומר ניקוי עדין) לכל היטב דגירה במשך 7 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    2. הוספת 800 μl של תקשורת THB היטב כל אחד. תאי Lyse ידי pipetting למעלה ולמטה, ואם יש צורך, לגרד בארות 3-4x עם קצה פיפטה לוודא monolayer התא נמחק לחלוטין. שינוי עצות בין בארות.
    3. הסר את התוכן מכל הטוב בעזרת פיפטה P1000 ולהעביר לתוך צינורות microfuge שכותרתו.

    4. כימות של החסיד Pneumococci

    pneumococci חסיד ניתן לכמת על ידי קביעת ספירת קיימא (דילול סדרתי וציפוי על אגר דם) או על ידי בזמן אמת PCR כמוני.

    1. שיטת ספירת קיימא
      שיטה זו חייבת להתבצע מייד לאחר שלב 3.5 של assay הדבקות.
      1. לכל אחד גם assay, להכין דילולים סדרתי של דגימות שנאספו בצעד 3.5 של assay הדבקות על ידי הוספת 50 μl של דגימות ל450 μl של 0.85% NaCl, vortexing דופק, וסדר דילול כמפורט בסעיף 3.1.9 עד 10 -6 הדילול.
      2. צלחת של 10 -3 100 μl, 10 -4, 10 -5, ו 10 -6 דילולים בשני עותקים על אגר דם, התפשטו עם מפזר סטרילי, ודגירת צלחות הפוכות לילה בשעה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. שימו לב שהבארות המכילות CCL-23 תאים לבד לא צריכים לכלול את כל חיידקים ויכולות להיות מצופים מסודר כ( 100 μl חי) שליטה על סטריליות.
      3. למחרת, לקבוע את inocula pneumococcal על ידי ספירת המושבות על הצלחות המתאימות דילול (המכילות 30-300 מושבות) שהוכנו בסעיף 3.1.13 של assay הדבקות. לחשב את CFU / מיליליטר של inocula באמצעות הערך הממוצע משתי צלחות. בדומה לכך, לקבוע את ס salivarius inocula ידי ספירת המושבות על הצלחות שהוכנובסעיף 3.1.10.
        הערה: צלחות צריכה להכיל pneumococci בלבד; נוכחותם של מינים אחרים מציינת כי assay היה מזוהם והתוצאות הן לא חוקיות.
      4. כדי לקבוע את רמות דבקות pneumococcal, לספור את הצלחת המתאימה דילול (המכילה 30-300 מושבות pneumococcal) עבור כל דגימה שהוכנה בסעיף 4.1.1. שימו לב שס מושבות salivarius תהיה קטנות ולבנה, ואילו pneumococci תהיה בשל שטוח וירקרק לα-המוליזה, כפי שמוצג באיור 3. כדי לחשב דבקות pneumococcal, לנרמל את מספר pneumococci חסיד ממצב ב. CCL-23 תאים + pneumococci 100%, ולהשוות pneumococci חסיד מהתנאים אחרים למצב זה.
    2. שיטת qPCR
      דגימות שנאספו בדבקות Assay שלב 3.5 ניתן לאחסן ב-20 ° C עד מיצוי DNA. מיצוי DNA מתבצע באמצעות ערכה מסחרית ומתואר בסעיפים 4.2.1-4.2.9 וqPCR כלומר בסעיפים 4.2.10-4.2.20.
      1. הכן אנזימתי תמוגה חוצץ (pH 50 מ"מ פוספט חיץ 6.7 המכיל 1 מ"ג / מיליליטר ליזוזים, 0.075 מ"ג / מיליליטר mutanolysin, ו -2 מ"ג / מיליליטר proteinase K). המתכון הבא יכול לשמש להפוך 10 מיליליטר (מספיק ל 50 עקירות). מאגר תמוגה אנזימתי צריך להיות מוכן לפני השימוש טרי.

        7.25 מיליליטר של 50 פתרון mM פוספט חיץ (pH 6.7)
        1.00 מיליליטר של 10 מ"ג / מיליליטר מניות ליזוזים ל[ 1 מ"ג / מיליליטר] סופי
        0.75 מיליליטר של 1 מ"ג / מיליליטר mutanolysin המניה ל[ 0.075 מ"ג / מיליליטר] סופי
        1.00 מיליליטר של 20 מ"ג / מיליליטר מניות proteinase K ל[ 2 מ"ג / מיליליטר] סופי
      2. הפשירו דגימות על קרח או על 4 ° C. ורטקס והעברה 100 aliquots μl של כל דגימה לתוך צינורות microfuge שכותרתו. לחזור דגימות מקוריות בחזרה ל-20 ° C במקפיא.
      3. צנטריפוגה הדגימות ב6,700 XG 10 דקות.
      4. להסיר ולסלק את supernatant. הוסף 200 μl של חיץ תמוגה האנזימטית של הגלולה והמערבולת כדי resuspend. Incubאכלתי את הדגימות ב56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בקצרה צנטריפוגה (5 שניות) בשעה 6,700 XG לאסוף נוזל בחלק התחתון של צינור.
      5. הוסף 10 μl של 20% SDS כדי להשלים את תמוגה התא ומערבבים בעדינות בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות.
      6. הוסף 4 μl של RNase (100 מ"ג / מיליליטר מניות) ומערבבים בעדינות (על כיסא נדנדה או על ידי היפוך הצינורות) בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות.
      7. הוסף 200 μl של החיץ AL (מערכה) ו מערבולת במשך 15 שניות. דגירה דגימות ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בקצרה צנטריפוגה (5 שניות) בשעה 6,700 XG לאסוף נוזל בחלק התחתון של צינור.
      8. הוסף 200 μl של EtOH 100% ומערבולת 15 שניות. ספין בקצרה לאסוף את הנוזל בתחתית הצינור, ולאחר מכן להעביר את התערובת (כולל כל משקע) לעמודת הספין (בצינור 2 אוסף מיליליטר) בלי להרטיב את השפה. בצע את הפעולות לשטוף פי הפרוטוקול של היצרן (לא מוצג כאן).
      9. לelute DNA, להעביר עמודה לתוך צינור microfuge שכותרתו, להוסיף 50 μl של הצפת AE (frערכת אום), ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. צנטריפוגה ב 4,300 XG דקות 1. חזור פעם אחת לגמר elution נפח 100 μl. ה-DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      10. כדי לבצע qPCR, לעקר את הברדסים עם אור UV במשך 15 דקות לפני להתחיל. הכנת גיליון עבודה מפת צלחת 96 היטב כדי להקליט מקומות גם עבור כל דגימה מומלצת.
      11. הכן את עקומת סטנדרט באמצעות 10 ng / μl מניות של הדנ"א הגנומי ריאות (המופק מזן ATCC התייחסות 6305).
        1. להפשיר DNA מניית pneumococcal וספין למטה בקצרה (5 שניות) בצנטריפוגה שולחן.
        2. לבצע דילולים 1:10 סידוריים ב6 צינורות microfuge prelabeled ידי הוספת דנ"א 3 μl לH nuclease ללא 27 μl 2 O, שינוי טיפים וvortexing בין כל דילול. סדרת הדילול הסופית כוללת 6 צינורות: 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, ו0.00001 ng / μl.
          הערה: אלה יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
      12. Preparדואר lytA mastermix כדלקמן בצינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי במכסת מנוע PCR סטרילי. להפשיר רכיבים על קרח ומערבולת מייד לפני השימוש. et al.15 ומוצגים ברשימת חומרים.
      13. ורטקס ועומס 23 μl / טוב של lytA לערבב לתוך הבארות המתאימות. עיין במפת הצלחת.
      14. צלחת תחבורה לתבנית באזור בנוסף (רצוי קבינט סטריליים בחדר נפרד) לטעינת מדגם.
      15. השתמש פיפטה P2 לטעון דגימות, שינוי טיפים לכל אחד. כל הדגימות מנוהלות בשני עותקים. עיין במפת הצלחת למיקום.
      16. לבארות עקומת סטנדרט, להוסיף 1 μl / טוב של הדילול המתאים של ה-DNA עקומה סטנדרטית בתוספת μl 1 / גם H 2 O כדי להביא את הנפח הסופי 25 μl.ללא בארות שליטת תבנית, להוסיף 2 μl H 2 O.
      17. הוסף 2 μl / טוב של ה-DNA מדגם לתוך בארות מתאימות.
      18. מכסה את כל הבארות בשימוש. כובעים בטוחים הפוך סגורים בנוחות. מהירות לסובב את צלחת ה-PCR (5 שניות) לפני טעינת הצלחת למכונה ה-PCR בזמן אמת.
      19. צלחת טען לPCR מכונה ולהפעיל qPCR בהתאם להוראות הניתנות על ידי היצרן המכונה. תנאי רכיבה על אופניים הבאים הידרוליזה בדיקה מומלצים:
        20. רכיב לכל תגובה x 102 (צלחת מלאה)
        lytA F 0.25 μl של 10 מניית מיקרומטר 25.5 μl
        lytA R 0.25 μl של 10 מניית מיקרומטר 25.5 μl
        בדיקה lytA 0.5 μl של 10 מניית מיקרומטר 51 μl
        H 2 O 9.5 μl 969 μl
        מיקס מאסטר 12.5 μl 1,275 μl
        נפח סופי 23 μl 2,346 μl
        שלב 1 (1x): 3 דקות על 95 מעלות צלזיוס
        שלב 2 (40X): 20 שניות ב 95 מעלות צלזיוס
        20 שניות ב 60 ° C
      20. איסוף נתונים ולכמת DNA pneumococcal באמצעות עקומת הסטנדרט. המון חיידקים מחושבים כפי שתואר לעיל 17, שהעריך כי pg 1 של הדנ"א הגנומי הוא שווה ערך ל447.4 תאים, וכפי שדווח o CFU / מיליליטר (בהנחההגנום ne לCFU, ועותק אחד של lytA לגנום; ראה איור 4). עבור assay מוצלח, ערך 2 R יש ≥ 0.98 וכל התוצאות החיוביות בטווח של העקומה סטנדרטית (CT ערכים פחות מזה המתקבל עבור ng 0.00001 / μl נקודת עקומה סטנדרטית נחשבים רקע / lytA שלילי).
        הערה: מערכות ה-PCR בזמן אמת חלקם באים עם תוכנת ניתוח שיכול לשמש לבניית עקומות סטנדרטיות ולחשב נעלמים. אחרת, ניתן לבצע חישובים אלה ב-Excel או תוכניות דומות. עקומת סטנדרט למשל מוצגת באיור 4.
      21. כדי לחשב את דבקות pneumococcal, לנרמל את מספר pneumococci חסיד ממצב ב. CCL-23 תאים + pneumococci 100%, ולהשוות pneumococci חסיד מהתנאים אחרים למצב זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות מניסוי נציג שבי pneumococci (ס דלקת ריאות PMP843, בודד מיישבים 19F) נוספו לCCL-23 תאים 1 שעות לאחר התוספת של ס ' salivarius, ודבקות pneumococcal הייתה לכמת ידי שתי ספירת קיימא וlytA qPCR מוצגים בטבלה 2. תוצאות היו עקביות בין שתי השיטות הן למספר המוחלט של חיידקים (שהוצג כCFU / מיליליטר) ואת דבקות%, מנורמל למספר pneumococci של חסיד בבארות המכילות pneumococci לבד. הפארין משמש כביקורת כפי שהוא ידוע לעכב היצמדות לדלקת ריאות ולכן העמידה מופחתת בpneumococci + מצב הפרין (בדרך כלל <40% בהשוואה לpneumococci לבד) מעידה על assay מוצלח. ס salivarius מעכב היצמדות pneumococcal באופן תלוי מינון, כפי שמוצג בטבלה 2, שבו הריכוז הגבוה של ס salivarius (בקירובly 10 ס salivarius: pneumococci 1) הביא לדבקות pneumococcal הנמוכה ביותר.

איור 5 מראה את הדבקות של pneumococci לCCL-23 תאים כאשר ס salivarius הוא הוסיף 1 שעות לפני pneumococci (preaddition), במקביל (coaddition), או 1 שעות לאחר pneumococci (הודעה בנוסף-). ס salivarius הוא יעיל יותר בעיכוב היצמדות pneumococcal כאשר הוסיף לפני pneumococci, כמו גם את המינון הגבוה ובינוני של ס ' salivarius מופחת באופן משמעותי דבקות pneumococcal בassay preaddition (איור 5 א), ואילו במינון הגבוה רק של ס ' salivarius עכבות דבקות pneumococcal בcoaddition ומבחני הודעה בנוסף-(5B דמויות ו5C).

הנתונים מוצגים בטבלה 2 ואיורים 4 ו -5 התקבלו באמצעות גרסה קודמת של פריימרים lytA qPCR ו לחקור 17. הפרוטוקול הנוכחי מתאר assay qPCR המעודכן.

איור 1
איור 1. עקומות גדילת נציגו של ס ' pneumoniae PMP843 () וס salivarius K12 (ב '). לכל מין, CFU / מיליליטר, כפי שנקבע על ידי ספירת קיימא מוצג ב( ציר y שמאל) שחור, וצפיפות אופטית (OD) ב600 ננומטר מוצגת ב( ציר y מימין) אפור. אמצע יומן השלב הוערך על ידי ספירת קיימא להיות 3 שעות לס pneumoniae PMP843 ושעה 2 לס salivarius K12. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

"Width =" fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51069/51069fig2.jpg "/> 500px
איור 2. דוגמאות לCCL-23 תאים בריאים וCCL-23 תאים עם אפקטי cytopathic (CPE). א) דוגמא של monolayer בריא, ומחוברות של CCL-23 תאים. B) תאי CCL-23 עם אפקטי cytopathic. שים לב עיגול של תאים, אזורים תאיים בהירים, ובאזורים של monolayer שיבש בו תאים שהרימו את הצלחת. תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך בהגדלה 200X. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. ס salivarius ומושבות pneumococcal על אגר דם סוס. ס מושבות salivarius הם קטנות ולבנים, כפי שצוינו על ידי לבניםחץ ומושבות מכתב א 'דלקת ריאות (ס דלקת ריאות) הן בדרך כלל גדולות יותר, שטוח יותר, וירקרקים בצבע, כפי שצוינו על ידי ב' חץ ומכתב הלבן לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
איור 4. דוגמא ס עקומת סטנדרט pneumoniae לqPCR. חישובי הדנ"א הגנומי מוצגים יחד עם ערכי ה-CT (* ממוצע של בארות עקומת סטנדרט כפולות מassay qPCR נציג), עם הערך כתוצאה הסטנדרטי עקום, משוואה, ו-R 2 המוצג על הגרף. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

איור 5 רוחב תוכן-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" = "600" />
איור 5. השפעת ס salivarius על דבקות pneumococcal לCCL-23 תאי דבקות דלקת ריאות לCCL-23 monolayers תא כאשר תאים הודגרו עם pneumococci לבד. (PNC; מנורמלת ל100%), עם pneumococci ו100 U / ml הפרין (heparin), או עם pneumococci ו ס salivarius הוסיף ביחס של ~ 10: ס salivarius: pneumococci 1 (גבוה), ~ 1 ס salivarius: pneumococci 1 (בינוני), או ~ 1 ס salivarius:. 10 pneumococci (נמוך) ס salivarius נוספה 1 שעות לפני (א '), באותו הזמן כ( ב'), או 1 שעות לאחר pneumococci (C). n ≥ 3, * מציין P <0.05 בהשוואה לpneumococci לבד (של סטודנטים מבחן t). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

"עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד ">

קבוצה מצב assay הערות
CCL-23 תאים לבד
ב ' CCL-23 תאים + pneumococci
C CCL-23 תאים + pneumococci + הפרין דבקות pneumococcal לוקי הפרין לתא שטח glycosylaminoglycans 16, והוא משמש כביקורת
D CCL-23 תאים + pneumococci + S. salivarius [גבוה] כ 1 pneumococcus: 10 ס salivarius
E CCL-23 תאים + pneumococci + S. salivarius [מד] כ 1 pneumococcus: 1 ס salivarius
F CCL-23 תאים + pneumococci + S. salivarius [נמוך] כ 10 pneumococcus: 1 ס salivarius


טבלת 1. תנאים שנבדקו בassay דבקות pneumococcal. שישה תנאי assay בסיסיים שתוארו כאן.

6
מצב assay * CFU / מיליליטר PNC (qPCR) % דבקות (qPCR) CFU / מיליליטר PNC (ספירת קיימא) % דבקות (ספירת קיימא)
PNC לבד 1.1 x 10 7 100 9.1 x 10 6 100
PNC + הפרין 1.5 x 10 6 14 7.6 x 10 5 8
PNC + סאל [גבוה] 6.1 x 10 5 6 3.2 x 10 5 4
PNC + סאל [מד] 3.6 x 10 6 33 2.7 x 10 6 29
PNC + סאל 9.8 x 10 6 92 90

טבלה 2: דבקות דלקת ריאות לCCL-23 תאים בעקבות התוספת של ס ' salivarius כפי שנקבע על ידי lytA qPCR ושיטת ספירת קיימא * PNC = pneumococci.; סאל = ס salivarius; [גבוה] = כ 10 סאל: 1 PNC; = סאל [מד] כ 1: 1 PNC; [נמוך] = כ 1 סאל: 10 PNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חלק קריטי של assay זה הוא הוספת הריכוזים המתאימים של ס salivarius וpneumococci בסעיפי 3.1.7 ו3.1.12. ריכוזים מחושבים באמצעות קריאות OD אבל inocula המדויק לא נקבעו עד צלחות נספרות ביום המחרת. מסיבה זו, אנו ממליצים על ביצוע עקומות גדילה למדידת OD וספירת קיימא (CFU / מיליליטר) לאורך זמן עבור כל זני החיידקים משמשים assay כדי לזהות את שלב אמצע היומן ולסייע בהערכת ריכוז על ידי OD. בנוסף, זני ריאות יכולים להיות שונים באופן משמעותי בדבקות המאפיינים שלהם. זנים עם דבקות טובה (> 10% מinocula הקפדה על תאי האפיתל לאחר דגירה 3 שעות) מומלצים למבחנים חוקרים את היכולת של פרוביוטיקה לעכב היצמדות ריאות. גם כאשר היא מבוצעת על ידי מפעיל מנוסה, רמות הדבקות יכולות להשתנות assay לassay, כפי שמעידה על ידי הברים שגיאה הגדולים יחסית ניתן לראות באיור 5. למסיבה זו אנו ממליצים על מינימום של שלוש חזרות לכל ניסוי, עם בארות כפולות עבור כל תנאי assay. השתנות דומה דווחה במבחני דבקות באמצעות חיידקי Escherichia 18. בפרוטוקול זה, תאים טופחו במשך 3 שעות הבאות התוספת של pneumococci. זמן הדגירה עשוי להתקצר אם ניסויים כמובן זמן דבקות מבוצעים ומראים כי רוב החיידקים לדבוק בשעה הראשונה של דגירה.

פרוטוקול זה מציג שתי שיטות לכימות דבקות pneumococcal, qPCR וספירה בת קיימא. שני השיטות מתאימות, והבחירה תלויה בציוד של מפעיל העדפה ומעבדה זמינה (למשל גישה למכונה ה-PCR בזמן אמת). כימות על ידי ספירת קיימא היא שיטת עלות נמוכה שאינו דורשת חומרים כימיים נוספים או מכונה ה-PCR בזמן אמת. עם זאת, הוא משתמש בצלחות רבות (בדרך כלל 80 צלחות עבור assay 12 גם) וחייבת להתבצע באופן מיידיly בסוף assay, וספירת מושבות ריאות יכולה להיות קשה על צלחות המכילות כמות גדולה של ס salivarius. כימות על ידי qPCR היא יקרות יותר ודורשת צעד מיצוי DNA ארוך, אבל יכולות להיות מאוחסנות דגימות קפואות ומעובד בקבוצות, הגברת יעילות. ה-DNA שחולץ יכול לשמש גם למטרות אחרות, כגון זיהוי qPCR של ס 'חסיד salivarius. אם חוקר ס דבקות salivarius, מומלץ לכלול בארות עם CCL-23 תאים בתוספת ס salivarius (ללא pneumococci) ובארות עם CCL-23 תאים בתוספת ס פקדים נוספים כsalivarius והפרין.

Assay הבסיסי גם יכול להיות מותאם כדי לחקור היבטים מדעיים אחרים של קולוניזציה. לדוגמא, ההשפעה של פרוביוטיקה על ייצור ציטוקינים יכולה להיות מוערכת על ידי אחסון ומנסה לאמוד supernatants תא. Assay יכול גם להיות שונה כדי לבחון פלישת חיידקים ולא על ידי דבקותדוגרים תאים עם אנטיביוטיקה בלתי חדירה קרום תא כדי להרוג חיידקים תאיים לפני קצירה ותאי lysing. כפי שתואר כאן, assay אינו מבחין בין pneumococci חסיד ופולשנית (מופנם). עם זאת, מחקרים קודמים מצאו הרמות של pneumococci הפנים להיות קטנות מאוד (בדרך כלל ≤ 0.01% מinocula) 10 לכן עבור רוב מבודד (כולל PMP843), רובם המכריע של pneumococci הקשורים הסלולרי הם חסיד ולא הפנים. יישומים נוספים כוללים בדיקת זנים פרוביוטיים אחרים ליכולת לעכב קולוניזציה, ו / או מסתכל על זני חיידקים שעברו מוטציה כדי לחקור את תפקידם של גנים ספציפיים של עניין.

מגבלה ברורה של assay זה במבחנה היא שהיא אינה כוללת את האפיתל הוקם, תאי מערכת החיסון, צמחייה רגילה, או גורמים אחרים המשפיעים על סיכוי קולוניזציה pneumococcal in vivo. כדי להעריך באופן מלא אם cou פרוביוטיקהld להועיל במניעת קולוניזציה הפתוגן בדרכי הנשימה, במחקרי vivo תוך שימוש במודלים של בעלי חיים וניסויים קליניים בבני אדם הם ערובה. עם זאת, מבחני דבקות במבחנה לשמש כמסך שימושי לזיהוי פרוביוטיקה עם הפוטנציאל לעכב היצמדות לדלקת ריאות ויכולים לספק מידע על אסטרטגיות מינון מועדפים, כמו גם מתן מודל ניסיוני שיכול לשמש למחקרים מכניסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממרדוק הילדים מכון המחקר ותכנית התמיכה בתשתית התפעולית של הממשלה ויקטוריאני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

Tags

אימונולוגיה גיליון 86 גראם חיובי בזיהומים חיידקיים דלקת ריאות בקטריה מחלות ריאה זיהומים דרך נשימה, דבקות קולוניזציה פרוביוטיקה,
חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter