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Immunology and Infection

एक का प्रयोग न्यूमोकोकल औपनिवेशीकरण पर प्रोबायोटिक्स के प्रभाव की जांच Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

इन विट्रो में पालन assays सेल monolayers उपकला के लिए और इस तरह के न्यूमोकोकल बसाना बाधा के लिए प्रोबायोटिक्स के उपयोग के रूप में संभावित उपायों की जांच के लिए स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया की कुर्की का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

Nasopharynx के उपकला अस्तर को स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया (pneumococcus) के पालन उपनिवेशन में परिणाम कर सकते हैं और. इन विट्रो पालन assays सेल उपकला को pneumococci की कुर्की का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इस तरह के निमोनिया और ओटिटिस मीडिया के रूप में न्यूमोकोकल संक्रमण के लिए एक शर्त माना जाता है monolayers और, इस तरह प्रोबायोटिक्स के उपयोग के रूप में संभावित उपायों की जांच के लिए न्यूमोकोकल बसाना को बाधित करने के लिए. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल (कभी कभी एचईपी-2 कोशिकाओं के रूप में) मानव उपकला कोशिका लाइन सीसीएल-23 के लिए pneumococci के पालन पर प्रोबायोटिक स्ट्रेप्टोकोकस salivarius के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. परख तीन मुख्य चरण शामिल हैं: उपकला और बैक्टीरियल कोशिकाओं का 1) की तैयारी, सेल monolayers उपकला बैक्टीरिया के 2) इसके अलावा, और व्यवहार्य मायने रखता है (धारावाहिक कमजोर पड़ने और चढ़ाना) या मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR द्वारा पक्षपाती pneumococci 3) जांच ). इस टीईसीhnique अपेक्षाकृत सरल है और एक टिशू कल्चर सेटअप के अलावा अन्य विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है. परख अन्य प्रोबायोटिक प्रजातियों और / या न्यूमोकोकल उपनिवेशवाद के संभावित inhibitors परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और आसानी से न्यूमोकोकल पालन और आक्रमण के बारे में अन्य वैज्ञानिक सवालों का पता करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

Introduction

स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया (pneumococcus) निमोनिया, ओटिटिस मीडिया, और मैनिंजाइटिस सहित संक्रमण पैदा कर सकता है कि एक ग्राम पॉजिटिव जीवाणु है. यह कम आय वाले देशों में बच्चों और सालाना 1 पांच साल की उम्र के तहत बच्चों के एक अनुमान के अनुसार 800,000 लोगों की मृत्यु के लिए जिम्मेदार में बीमारी का एक प्रमुख कारण है. Pneumococci अक्सर छोटे बच्चों की nasopharynx में किया जाता है. इस बसाना आम तौर पर स्पर्शोन्मुख माना जाता है, यह न्यूमोकोकल संक्रमण पछाड़ दिया और मानव आबादी 2 में बैक्टीरिया के लिए एक जलाशय के रूप में कार्य करता है. न्यूमोकोकल संयुग्म टीकाकरण को प्रभावी ढंग से वैक्सीन के भीतर निहित सीरमप्रकारों की ढुलाई कम कर देता है. हालांकि, वहाँ 90 न्यूमोकोकल सीरमप्रकारों खत्म हो गई हैं, और टीकाकरण वैक्सीन सीरमप्रकारों के उन्मूलन nonvaccine सीरमप्रकारों 3 की वजह से गाड़ी और रोग में वृद्धि के बाद है जिसके तहत सीरोटाइप प्रतिस्थापन, करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, कुछ उच्च जोखिम आबादी में, न्यूमोकोकलउपनिवेशन अक्सर पूर्व प्रथम टीका खुराक 4,5 के प्रशासन के लिए बहुत जल्दी जीवन में होता है. हाल ही में, प्रोबायोटिक्स का उपयोग न्यूमोकोकल बसाना 6,7 बाधित करने के लिए एक अतिरिक्त रणनीति के रूप में प्रस्तावित किया गया है. इन विट्रो पालन assays न्यूमोकोकल पालन 8,9 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ये assays न्यूमोकोकल पालन 10 पर प्रोबायोटिक लैक्टोबैसिलस rhamnosus GG (LGG) के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुकूलित किया गया है.

LGG और अन्य लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया के अलावा, स्ट्रेप्टोकोकस salivarius, मौखिक गुहा का एक आम निवासी होने के कारण संभावित और इन विट्रो 11 में pneumococci और अन्य सांस रोगजनकों को बाधित करने की क्षमता अपनी बसाना को श्वसन तंत्र के लिए एक संभावित प्रोबायोटिक के रूप में जांच की गई है - 13. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एस के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल एक पालन परख का वर्णन न्यूमोकोकल पालन पर salivarius K12मानव उपकला कोशिका लाइन सीसीएल-23 के लिए. विकास और पालन गुणों आइसोलेट्स 10,14 के बीच काफी भिन्न हो सकती हैं परख में उपयोग करने से पहले, न्यूमोकोकल वियोजन, पालन क्षमताओं लिए मूल्यांकन किया गया. Pneumococci और एस के विकास घटता salivarius (आयुध डिपो, चित्रा 1) ऑप्टिकल घनत्व द्वारा मध्य लॉग चरण और अनुमान एकाग्रता (कॉलोनी बनाने इकाइयों या CFU / एमएल) निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया गया. यह प्रत्येक परख में उपयोग करने के लिए पहले अलग के लिए व्यवहार्य गिनती और आयुध डिपो द्वारा वृद्धि की जांच की सिफारिश की है. यह परख मानक टिशू कल्चर सुविधाओं और उपकरणों के साथ किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, एस के तीन खुराक का प्रभाव salivarius पूर्व एस के पालन पर pneumococci के अलावा करने के लिए 1 घंटे प्रशासित निमोनिया PMP843, एक nasopharyngeal झाड़ू से व्युत्पन्न एक सीरोटाइप 19F गाड़ी अलग, जांच कर रहे हैं. पक्षपाती pneumococci यों के लिए दो अलग अलग तरीके प्रस्तुत कर रहे हैं: रोकते रक्त अगर पर चढ़ानामेरा व्यवहार्य मायने रखता है, और डीएनए निष्कर्षण और qPCR 15 से न्यूमोकोकल lytA जीन का पता लगाने. बुनियादी पालन परख प्रोटोकॉल आसानी से विभिन्न खुराक या प्रोबायोटिक्स के प्रशासन के समय का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और भी अन्य जीवाणु उपभेदों या प्रजातियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

1. उपकला की तैयारी और बैक्टीरियल कोशिकाओं

  1. सीसीएल -23 उपकला कोशिकाओं का विगलन
    1. ~ 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त Prewarm न्यूनतम आवश्यक मीडिया (सदस्य).
    2. उपयोग करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ टिशू कल्चर को मंजूरी दी जैव सुरक्षा कैबिनेट जीवाणुरहित, और 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र नीचे पोंछे. जैव सुरक्षा कैबिनेट में 70% इथेनॉल और जगह के साथ गरम मीडिया बोतल साफ कर लें.
    3. एक 25 एमएल पिपेट का उपयोग, एक टी -75 फ्लास्क में मीडिया के 14 एमएल हस्तांतरण. कोशिकाओं (धारा 1.1.4) विगलन एक कला है 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कुप्पी रखें.
    4. ~ 80% thawed जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में उचित सुरक्षा सावधानियों और गर्म का उपयोग तरल नाइट्रोजन भंडारण से सीसीएल-23 कोशिकाओं की एक शीशी निकालें.
    5. जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए खंड 1.1.3 में तैयार कुप्पी लौटें. टी में 70% इथेनॉल और हस्तांतरण सामग्री (1 मिलीग्राम) के साथ सीसीएल-23 कोशिकाओं की शीशी की बाहरी सतह को साफ कर लेंएक P1000 विंदुक का उपयोग -75 कुप्पी.
    6. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 95% सापेक्ष आर्द्रता टिशू कल्चर इनक्यूबेटर रातोंरात (16-20 घंटे) में अपने पक्ष पर फ्लास्क सेते हैं.
    7. एक स्वस्थ आकारिकी की पुष्टि के लिए एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें, मीडिया को हटाने, और ताजा 15 मिलीलीटर के साथ की जगह, सदस्य + 10% FBS prewarmed.
  2. सीसीएल -23 उपकला कोशिकाओं के रखरखाव
    1. कोशिकाओं ~ 80% मिला हुआ (1-2 दिन), एक 25 एमएल पिपेट का उपयोग कर मीडिया को दूर करने और धीरे 8-10 के साथ दो बार धोने कोशिकाओं द्वारा पारित होने के एक बार मिलीलीटर एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग prewarmed फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस).
    2. पीबीएस निकालें और बाँझ 0.25% trypsin EDTA के 1 मिलीलीटर (0.25% (w / v) trypsin, 0.1 मिमी EDTA) जोड़ें. उसकी तरफ से कुप्पी मुड़ें, trypsin कोशिकाओं का मिला हुआ परत को शामिल किया सुनिश्चित करने, और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 2-3 मिनट के लिए फ्लास्क सेते घुमाएगी.
    3. जैव सुरक्षा कैबिनेट को कुप्पी लौटें, जोड़ 9 मिलीलीटर ऊपर और नीचे 6 सदस्य + 10% FBS, और पिपेट prewarmed -8x कोशिकाओं बेदखल कुप्पी की ओर नीचे तरल बाहर खदेड़ना, कोशिकाओं resuspend.
    4. भाजित कोशिकाओं 1:15 (1 मिलीग्राम + 14 मिलीलीटर सदस्य + 10% FBS) या 1:30 (0.5 मिलीलीटर + 14.5 मिलीलीटर सदस्य + 10% FBS), अतिरिक्त कक्षों त्यागें, और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ को कुप्पी लौटने 2 इनक्यूबेटर.
    5. पारित होने में कम से कम दो बार पालन परख में उपयोग करने से पहले कोशिकाओं. आम तौर पर कोशिकाओं 3-4 दिनों हर विभाजित कर रहे हैं.
  3. सीसीएल -23 उपकला कोशिकाओं की सीडिंग (एक दिन पूर्व परख, प्रोटोकॉल 2 पालन करने के लिए)
    1. Prewarmed सदस्य में resuspending, वर्गों 1.2.1-1.2.3 में वर्णित के रूप में मिला हुआ कोशिकाओं को विभाजित + 5% FBS (एफबीएस एकाग्रता परख में दखल सीरम घटकों की संभावना को कम करने के लिए कम है). कोशिकाओं के 20 μl निकालें और trypan नीले रंग धुंधला हो जाना और एक hemocytometer का उपयोग गिनती.
    2. एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में 1.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए prewarmed सदस्य + 5% FBS में कोशिकाओं पतला.
    3. बीज 1 कोशिकाओं की मिलीग्राम / अच्छी तरह से एक ऊतक मेंसंस्कृति 24 अच्छी तरह से थाली का इलाज किया.
  4. बैक्टीरिया की तैयारी
    यह प्रक्रिया pneumococci और एस की तैयारी के लिए पीछा किया जा सकता है salivarius. बैक्टीरियल वृद्धि मीडिया आम तौर पर (दूषित अगर आम तौर पर बादल छाए रहेंगे दिखाई देगा) prewarm और बाँझपन के लिए परीक्षण करने के लिए रात एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जाता है.
    1. घोड़े रक्त अगर (एचवीए) प्लेटों पर परख, लकीर बैक्टीरिया पालन और 35-37 डिग्री सेल्सियस और 18-24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 सेते करने से पहले दो दिन. भेड़ रक्त अगर एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
    2. अगले दिन, एक बाँझ 30 मिलीलीटर ट्यूब में 0.5% खमीर निकालने (THB + सुनो) के माध्यम से 10 मिलीलीटर टोड-हेविट शोरबा pipetting द्वारा प्रत्येक बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए एक रात में संस्कृति तैयार करते हैं. एक 10 μl पाश का प्रयोग, लगभग 10-12 अच्छी तरह से अलग कालोनियों टीका लगाना. संक्षेप में भंवर और 35-37 डिग्री सेल्सियस और 14-16 घंटे के लिए 5% सीओ 2 पर सेते हैं. शोरबा संस्कृति में भी लंबे समय छोड़ दिया है अगर pneumococci autolyze पड़ेगा.

    2 पालन परख:. सेल monolayers उपकला बैक्टीरिया की वृद्धि

    1. Pneumococci और एस के मध्य लॉग जीवाणु संस्कृति की तैयारी salivarius
      1. पिपेट दो बाँझ 30 मिलीलीटर ट्यूब, एक लेबल pneumococci और अन्य एस में से प्रत्येक में prewarmed THB + तु का 10 मिलीलीटर salivarius.
      2. मध्य लॉग चरण तक पहुंचने के लिए, pneumococci ~ 3 घंटा और एस आवश्यकता salivarius (चित्रा 1 देखें) ~ 2 घंटा ऊष्मायन की आवश्यकता होती है. एक ही समय में दोनों संस्कृतियों प्रारंभ करें. भंवर (3-5 सेकंड) रातोंरात बैक्टीरियल संस्कृतियों और जोड़ने के 100 μl pneumococci और 100 μl एस इसी ट्यूबों में salivarius.
      3. संक्षेप में भंवर और एस के लिए लगभग 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों सेते salivarius और pneumococci के लिए 3 घंटा.
    2. पालन ​​परख के लिए सीसीएल-23 कोशिकाओं की तैयारी
      1. एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, confluen के लिए 24 अच्छी तरह से थाली की जांचस्वस्थ सेल आकारिकी साथ टी monolayers. Monolayers सेल clumping या इस तरह के पालन की सेल गोलाई या हानि (देखें चित्र 2) के रूप में कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव के सबूत के बिना,> 80% मिला हुआ होना चाहिए.
      2. प्रत्येक अच्छी तरह से सेल monolayer परेशान करने से बचने के लिए थोड़ा थाली झुकने, एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करने में मीडिया निकालें.
      3. धीरे, कोशिकाओं को धोने के प्रत्येक अच्छी तरह से एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करने में ~ 500 μl prewarmed पीबीएस जोड़ने और थोड़ा थाली झुकने, एक हस्तांतरण विंदुक के साथ इसे हटाने के लिए. पीबीएस त्यागें. एक बार धोने कदम दोहराएँ.
      4. प्रत्येक कुएं में prewarmed सदस्य + 5% FBS के 500 μl जोड़ें. बैक्टीरियल संस्कृतियों की तैयारी करते हुए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली लौटें.
        नोट: संक्रमण (MOI) की बहुलता के लिए सटीक सीसीएल -23 सेल संख्या का निर्धारण करने के लिए, दो कुओं trypsinized और संक्रमण के दिन पर गिना जा सकता है.

    3. पालन परख

    1. को pneumococci जोड़ेंएक MOI ~ 10:01 पर सीसीएल-23 कोशिकाओं. डुप्लिकेट कुओं में 1 टेबल में सूचीबद्ध शर्तों का परीक्षण करें.
      1. एस के 1 एमएल की 600 (ओवर ड्राफ्ट) में ऑप्टिकल घनत्व को मापने salivarius संस्कृति. आयुध डिपो 0.3-0.6 के बीच होना चाहिए.
      2. एस के 5 एमएल स्थानांतरण 4 मिनट के लिए 1,870 XG पर एक 10 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में salivarius संस्कृति.
      3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और खंड 3.1.1 में आयुध डिपो पढ़ने के आधार पर, एस resuspend 0.85% NaCl (अंतिम एकाग्रता ~ 1.5 x 10 9 CFU / एमएल) की 200-1,000 μl में salivarius. एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में, 0.375 के एक आयुध डिपो के 260 μl में resuspended किया जाएगा. एस के 1:10 और 1:100 dilutions तैयार salivarius NaCl 0.85% का उपयोग कर.
        नोट: कुल में, एस के (उच्च, मध्यम और कम मात्रा का प्रतिनिधित्व) तीन सांद्रता salivarius परख में परीक्षण किया जाएगा. उच्च खुराक ~ 10 एस की एक अनुपात है salivarius: 1 pneumococci, मध्यम ~ 1 है एस salivarius: 1 pneumococci, और कम ~ 1 एस है. salivarius: 10 pneumococci.
      4. इनक्यूबेटर से 24 अच्छी तरह से थाली बाहर ले जाओ.
      5. हेपरिन नियंत्रण कुओं से, मीडिया के 40 μl हटाने और 100 यू / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए हेपरिन की 50 μl (1,000 यू / एमएल शेयर एकाग्रता) जोड़ें.
      6. सीसीएल -23 कोशिकाओं केवल और सीसीएल-23 कोशिकाओं और pneumococci (कोई एस salivarius) युक्त कुओं युक्त कुओं को 0.85% NaCl के 10 μl जोड़ें.
      7. 10 undiluted की उल, 1:10 और एस के 1:100 जोड़ें संबंधित कुओं salivarius.
        नोट: एस pneumococci (के बाद अतिरिक्त) प्रोबायोटिक प्रशासन के समय के प्रभाव की जांच करने के बाद salivarius भी pneumococci (coaddition) या 1 घंटे के रूप में एक ही समय में जोड़ा जा सकता है.
      8. सेल परत के साथ बैक्टीरियल संपर्क को बढ़ावा देने और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 1 घंटे के लिए सेते 3 मिनट के लिए 114 XG पर 24 अच्छी तरह से थाली अपकेंद्रित्र.
      9. एस के धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना डुप्लिकेट एचवीए पर 0.85% NaCl और प्लेट में salivarius शेयरव्यवहार्य गिनती के लिए प्लेटें. सबसे पहले, एक 10 -1 कमजोर पड़ने बनाने के लिए 0.85% NaCl के 450 μl को स्टॉक के 50 μl जोड़ने, तो भंवर (5 सेकंड), परिवर्तन सुझावों नाड़ी, और 0.85% NaCl के 450 μl के लिए 10 -1 कमजोर पड़ने की 50 μl जोड़ने इसके आगे के लिए 10 -7 एक 10 -2 कमजोर पड़ने बनाने के लिए और करने के लिए.
      10. प्लेट 100 10 -5 के μl, एचवीए प्लेटों पर दो प्रतियों में 10 -6, और 10 -7 dilutions और एक बाँझ स्प्रेडर के साथ फैल गया. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर रातोंरात उल्टे एचवीए प्लेटें सेते हैं.
      11. 1 घंटा ऊष्मायन के अंत की ओर, pneumococci के लिए वर्गों 3.1.1-3.1.3 दोहराएँ. Ods 0.2-0.7 के बीच होना चाहिए. नीचे न्यूमोकोकल संस्कृति के 1 मिलीलीटर स्पिन और ~ 1.5 x 10 8 CFU / एमएल के एक एकाग्रता के लिए (आयुध डिपो पढ़ने पर आधारित) 0.85% NaCl के 300-2,000 μl में गोली resuspend. एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में, 0.3 के एक आयुध डिपो के 500 μl में resuspended किया जाएगा.
      12. एस के साथ 1 घंटे ऊष्मायन के बाद salivarius, 10 μ जोड़; नकारात्मक नियंत्रण कुओं को छोड़कर सभी कुओं को एल undiluted pneumococci (कोशिकाओं से युक्त केवल).
      13. 3 मिनट के लिए 114 XG पर 24 अच्छी तरह से थाली अपकेंद्रित्र और 37 डिग्री सेल्सियस, 3 घंटे के लिए 5% सीओ 2 पर सेते हैं. खंड 3.1.9 और प्लेट dilutions 10 -4, व्यवहार्य गिनती के लिए डुप्लिकेट एचवीए प्लेटों पर 10 -5, और 10 -6 में वर्णित के रूप में 0.85% NaCl में pneumococci शेयर के धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना.
    2. 3 घंटा बाद, monolayers (देखें चित्र 2) स्वस्थ लग रही है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जांच. अच्छी तरह से प्रत्येक से मीडिया निकालें और धीरे खंड 2.2.3 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं 3x धो लो. हर हालत के लिए एक अलग पिपेट का उपयोग. यह कदम nonadherent pneumococci दूर करने के लिए आवश्यक है. monolayers धोने की प्रक्रिया के दौरान अलग नहीं आना चाहिए; यह एक खुर्दबीन के नीचे फिर से जाँच से इसकी पुष्टि की जा सकती है.

    नोट: इस चरण के दौरान हटा मीडिया (अतिरिक्त विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता <उन्हें> जैसे साइटोकाइन के स्तर की माप).

    1. अच्छी तरह से प्रत्येक को 0.1% digitonin (एक कोमल डिटर्जेंट) के 200 μl जोड़ें और 7 37 डिग्री सेल्सियस मिनट, 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं.
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से THB मीडिया के 800 μl जोड़ें. यदि आवश्यक हो,, ऊपर और नीचे pipetting, और द्वारा lyse कोशिकाओं यकीन है कि सेल monolayer पूरी तरह से हटा दिया जाता है बनाने के लिए पिपेट टिप के साथ कुओं 3-4x परिमार्जन. कुओं के बीच सुझावों बदलें.
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से एक P1000 विंदुक का उपयोग करने से सामग्री को निकालें और लेबल microfuge ट्यूबों में स्थानांतरण.

    पक्षपाती pneumococci के 4. मात्रा

    पक्षपाती pneumococci व्यवहार्य मायने रखता है का निर्धारण (धारावाहिक कमजोर पड़ने और रक्त अगर पर चढ़ाना) द्वारा या मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

    1. व्यवहार्य गिनती विधि
      इस विधि तुरंत पालन परख की 3.5 कदम के बाद किया जाना चाहिए.
      1. प्रत्येक परख अच्छी तरह के लिए, में एकत्र नमूनों के धारावाहिक dilutions तैयार0.85% NaCl, नाड़ी vortexing के 450 μl के लिए नमूने के 50 μl जोड़ने, और 10 -6 कमजोर पड़ने अप करने के लिए खंड 3.1.9 में वर्णित के रूप में क्रमानुसार गिराए द्वारा पालन परख की 3.5 कदम.
      2. 100 10 -3 के μl, 10 -4, 10 -5, और थाली रक्त अगर पर दो प्रतियों में 10 -6 dilutions, एक बाँझ स्प्रेडर के साथ फैल, और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात औंधा प्लेटें सेते हैं, 5% सीओ 2. अकेले सीसीएल -23 कोशिकाओं से युक्त कुओं किसी भी बैक्टीरिया शामिल नहीं होना चाहिए और चढ़ाया जा सकता है कि नोट साफ (100 μl undiluted) एक बाँझपन नियंत्रण के रूप में.
      3. अगले दिन, पालन परख की धारा 3.1.13 में तैयार (30-300 कालोनियों युक्त) उपयुक्त कमजोर पड़ने प्लेटों पर कालोनियों की गणना के द्वारा न्यूमोकोकल inocula निर्धारित करते हैं. दो प्लेटों से औसत मूल्य का उपयोग inocula के CFU / एमएल की गणना. इसी तरह, एस निर्धारित तैयार प्लेटों पर कालोनियों की गणना के द्वारा salivarius inoculaअनुभाग 3.1.10 में.
        नोट: प्लेट्स ही pneumococci शामिल करना चाहिए; अन्य प्रजातियों की उपस्थिति परख दूषित और परिणाम अमान्य हो गया था कि इंगित करता है.
      4. न्यूमोकोकल पालन का स्तर निर्धारित करने के लिए, धारा 4.1.1 में तैयार प्रत्येक नमूने के लिए (30-300 न्यूमोकोकल कालोनियों युक्त) उपयुक्त कमजोर पड़ने की थाली गिनती. ध्यान दें कि एस चित्रा 3 में दिखाया गया है pneumococci, α-hemolysis के लिए फ्लैट और हरा वजह से होगा जबकि salivarius कालोनियों, छोटे और सफेद हो जाएगा., न्यूमोकोकल पालन गणना हालत बी से पक्षपाती pneumococci की संख्या मानक के अनुसार करने के लिए. सीसीएल -23 कोशिकाओं + 100% तक pneumococci, और अन्य शर्तों से इस हालत के अनुयायी pneumococci की तुलना करें.
    2. qPCR विधि
      पालन ​​परख में एकत्र नमूनों 3.5 डीएनए निष्कर्षण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता कदम. डीएनए निष्कर्षण एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर प्रदर्शन किया और वर्गों में वर्णित 4.2.1-4.2.9 और qPCR के रूप में किया जाता हैवर्गों 4.2.10-4.2.20 में कहते हैं.
      1. एंजाइमी lysis बफर (50 मिमी फॉस्फेट युक्त बफर पीएच 6.7 1 मिलीग्राम / एमएल lysozyme, 0.075 मिलीग्राम / एमएल mutanolysin, और 2 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर) तैयार करें. निम्नलिखित नुस्खा इस्तेमाल किया जा सकता है (पर्याप्त 50 एक्सट्रेक्शन के लिए) 10 मिलीलीटर. एंजाइमी lysis बफर हौसले का उपयोग करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए.

        50 मिमी फॉस्फेट बफर समाधान के 7.25 मिलीलीटर (पीएच 6.7)
        एक अंतिम [1 मिलीग्राम / एमएल] के लिए 1.00 मिलीलीटर की 10 मिलीग्राम / एमएल lysozyme शेयर
        1 मिलीग्राम की 0.75 मिलीग्राम / एक अंतिम [0.075 मिलीग्राम / एमएल] के लिए शेयर mutanolysin मिलीलीटर
        एक अंतिम [2 मिलीग्राम / एमएल] के लिए 1.00 मिलीलीटर 20 के मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर स्टॉक
      2. बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने पिघलना भंवर और लेबल microfuge ट्यूबों में स्थानांतरण प्रत्येक नमूने के 100 μl aliquots. वापस -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में मूल नमूने लौटें.
      3. 10 मिनट के लिए 6700 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र.
      4. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. गोली और resuspend करने के भंवर एंजाइमी lysis बफर के 200 μl जोड़ें. Incub30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर नमूने खा लिया. ट्यूब के नीचे तरल इकट्ठा करने के लिए 6,700 XG पर अपकेंद्रित्र संक्षिप्त (5 सेकंड).
      5. सेल को पूरा करने और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीरे मिश्रण करने के लिए 20% एसडीएस के 10 μl जोड़ें.
      6. RNase ए (100 मिलीग्राम / एमएल शेयर) के 4 μl जोड़ें और (एक घुमाव पर या ट्यूब inverting द्वारा) 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीरे मिश्रण.
      7. 200 बफर अल के μl (किट से) और 15 सेकंड के लिए भंवर जोड़ें. 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं. ट्यूब के नीचे तरल इकट्ठा करने के लिए 6,700 XG पर अपकेंद्रित्र संक्षिप्त (5 सेकंड).
      8. 15 सेकंड के लिए 100% EtOH और भंवर के 200 μl जोड़ें. रिम गीला बिना (एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में) स्पिन स्तंभ के लिए (किसी भी वेग सहित) मिश्रण हस्तांतरण तो, ट्यूब के नीचे तरल इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में स्पिन. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार धोने चरणों का पालन करें (यहाँ दिखाया गया है).
      9. , डीएनए elute एक लेबल microfuge ट्यूब में स्तंभ स्थानांतरित करने के लिए, बफर एई के 50 μl जोड़ने (frओम किट), और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. 1 मिनट के लिए 4300 XG पर अपकेंद्रित्र. 100 μl के अंतिम क्षालन मात्रा के लिए एक बार दोहराएँ. डीएनए उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
      10. 15 मिनट पूर्व शुरू करने के लिए qPCR को करने के लिए यूवी प्रकाश के साथ डाकू बाँझ. प्रत्येक नमूने के लिए अच्छी तरह से स्थानों रिकॉर्ड करने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली का नक्शा वर्कशीट तैयारी की सिफारिश की है.
      11. (संदर्भ तनाव ATCC 6305 से निकाले) जीनोमिक न्यूमोकोकल डीएनए के एक 10 एनजी / μl स्टॉक का उपयोग कर मानक वक्र तैयार करें.
        1. न्यूमोकोकल शेयर डीएनए पिघलना और एक tabletop अपकेंद्रित्र में संक्षिप्त (5 सेकंड) नीचे स्पिन.
        2. प्रत्येक कमजोर पड़ने के बीच सुझावों और vortexing बदलते, 27 μl nuclease मुक्त एच 2 ओ 3 μl डीएनए जोड़कर 6 prelabeled microfuge ट्यूबों में 01:10 धारावाहिक dilutions प्रदर्शन. 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, और 0.00001 एनजी / μl: अंतिम कमजोर पड़ने श्रृंखला 6 ट्यूबों के होते हैं.
          नोट: ये एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
      12. Preparएक बाँझ पीसीआर हुड में एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इस प्रकार के रूप में ई lytA mastermix. बर्फ और उपयोग करने के लिए तुरंत पहले भंवर पर घटकों पिघलना. एट अल.15 द्वारा प्रकाशित किए गए थे और सामग्री की सूची में दिखाया गया.
      13. LytA के भंवर और भार 23 μl / अच्छी तरह से उचित कुओं में मिश्रण. थाली के नक्शे को देखें.
      14. नमूना लोड करने के लिए इसके अलावा क्षेत्र (एक अलग कमरे में अधिमानतः एक बाँझ कैबिनेट) टेम्पलेट के लिए परिवहन की थाली.
      15. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सुझावों को बदलने के नमूने, लोड करने के लिए एक p2 पिपेट का प्रयोग करें. सभी नमूनों को दो प्रतियों में चलाए जा रहे हैं. स्थान के लिए थाली के नक्शे को देखें.
      16. मानक वक्र कुओं के लिए, 1 μl / अच्छी तरह से मानक वक्र डीएनए प्लस 1 μl की उचित कमजोर पड़ने जोड़ने / अच्छी तरह से एच 2 हे 25 μl अंतिम मात्रा लाने के लिए.कोई टेम्पलेट नियंत्रण कुओं के लिए, 2 μl एच 2 ओ जोड़
      17. उचित कुओं में 2 μl / अच्छी तरह से नमूना डीएनए जोड़ें.
      18. प्रयोग में सभी कुओं टोपी. सुनिश्चित करें कि टोपी आराम से बंद हो जाती हैं. जल्दी से एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन में प्लेट लोड करने से पहले पीसीआर प्लेट (5 सेकंड) स्पिन.
      19. मशीन निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों के अनुसार पीसीआर मशीन और रन qPCR में लोड थाली. निम्नलिखित हाइड्रोलिसिस जांच साइकिल चालन की स्थिति सिफारिश कर रहे हैं:
        20. घटक प्रतिक्रिया प्रति एक्स 102 (फुल प्लेट)
        lytA एफ 10 माइक्रोन शेयर के 0.25 μl 25.5 μl
        lytA आर 10 माइक्रोन शेयर के 0.25 μl 25.5 μl
        lytA जांच 10 माइक्रोन शेयर के 0.5 μl 51 μl
        एच 2 हे 9.5 μl 969 μl
        मास्टर मिक्स 12.5 μl 1,275 μl
        अंतिम मात्रा 23 μl 2,346 μl
        चरण 1 (1x): 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट
        चरण 2 (40x): 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 सेकंड
        60 डिग्री सेल्सियस पर 20 सेकंड
      20. डेटा इकट्ठा करने और मानक वक्र का उपयोग न्यूमोकोकल डीएनए यों. पहले से जीनोमिक डीएनए के 1 पीजी 447.4 कोशिकाओं के बराबर है कि आकलन, 17 में वर्णित है, और CFU / एमएल (संभालने ओ के रूप में रिपोर्ट में बैक्टीरियल भार गणना कर रहे हैंपूर्वोत्तर CFU प्रति जीनोम, और जीनोम प्रति lytA की एक प्रति; देखें चित्र 4). एक सफल परख के लिए, आर 2 मूल्य 0.98 ≥ किया जाना चाहिए और मानक वक्र की सीमा के भीतर सभी सकारात्मक परिणाम (सीटी 0.00001 एनजी के लिए प्राप्त की तुलना में कम मूल्यों / मानक वक्र बिंदु μl पृष्ठभूमि / lytA नकारात्मक माना जाता है).
        नोट: कुछ वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम मानक घटता निर्माण और unknowns की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ आते हैं. अन्यथा, इन गणनाओं एक्सेल या इसी तरह के कार्यक्रमों में किया जा सकता है. एक उदाहरण मानक वक्र चित्रा 4 में दिखाया गया है.
      21. न्यूमोकोकल पालन की गणना करने के लिए, हालत बी से पक्षपाती pneumococci की संख्या मानक के अनुसार. सीसीएल -23 कोशिकाओं + 100% तक pneumococci, और अन्य शर्तों से इस हालत के अनुयायी pneumococci की तुलना करें.

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Representative Results

एक प्रतिनिधि प्रयोग से जो परिणाम pneumococci में (एस निमोनिया PMP843, एक बस्तियां 19F अलग) 1 घंटा एस के अलावा के बाद सीसीएल -23 कोशिकाओं को जोड़ा गया salivarius, और न्यूमोकोकल पालन व्यवहार्य गिनती और lytA qPCR दोनों के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था तालिका 2 में दिखाया गया. परिणाम संख्या को सामान्यीकृत बैक्टीरिया की पूर्ण संख्या (CFU / एमएल के रूप में प्रस्तुत) और% पालन, दोनों के लिए दो तरीकों के बीच संगत कर रहे थे अकेले pneumococci युक्त कुओं में से पक्षपाती pneumococci. यह न्यूमोकोकल पालन को बाधित करने के लिए जाना जाता है और इसलिए pneumococci + हेपरिन हालत में कम पालन (आमतौर <40% अकेले pneumococci की तुलना में). एस एक सफल परख का संकेत है है के रूप में हेपरिन एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है तालिका 2, एस की जहां उच्च एकाग्रता के रूप में दिखाया salivarius, एक खुराक पर निर्भर ढंग से न्यूमोकोकल पालन रोकता salivarius (अनुमानितly 10 एस salivarius: 1 pneumococci) सबसे कम न्यूमोकोकल पालन में हुई.

चित्रा 5 सीसीएल -23 कोशिकाओं को pneumococci के पालन से पता चलता है जब एस salivarius 1 pneumococci से पहले मानव संसाधन (preaddition), समवर्ती (coaddition), या pneumococci के बाद 1 घंटा (बाद के अलावा) जोड़ा जाता है. एस salivarius, पूर्व pneumococci में जोड़ा जब न्यूमोकोकल पालन बाधा पर अधिक प्रभावी है एस के दोनों उच्च और मध्यम खुराक के रूप में salivarius काफी एस के केवल उच्च खुराक, जबकि preaddition परख (चित्रा 5A) में न्यूमोकोकल पालन कम salivarius coaddition और बाद के अलावा assays (आंकड़े 5 ब और 5C) में न्यूमोकोकल पालन हिचकते.

तालिका 2 में दिखाया गया है और 4 और 5 आंकड़े डेटा lytA qPCR प्राइमरों के पुराने संस्करण का उपयोग कर प्राप्त किया गया 17 की जांच. मौजूदा प्रोटोकॉल अद्यतन qPCR परख का वर्णन करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एस के प्रतिनिधि विकास घटता निमोनिया PMP843 (ए) और एस salivarius K12 (बी). प्रत्येक प्रजाति के लिए, व्यवहार्य गिनती द्वारा निर्धारित CFU / एमएल ब्लैक (बाएं Y-अक्ष) में दिखाया गया है, और 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) ग्रे (सही Y-अक्ष) में दिखाया गया है. मध्य लॉग चरण एस के लिए 3 घंटा होने के लिए व्यवहार्य गिनती से अनुमान लगाया गया था निमोनिया PMP843 और एस के लिए 2 घंटा salivarius K12. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 2. कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (सीपीई) के साथ स्वस्थ सीसीएल-23 कोशिकाओं और सीसीएल-23 कोशिकाओं के उदाहरण हैं. कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव के साथ सीसीएल-23 कोशिकाओं. बी) सीसीएल-23 कोशिकाओं के एक स्वस्थ, मिला हुआ monolayer के एक) उदाहरण. कोशिकाओं, उज्ज्वल intracellular क्षेत्रों, और कोशिकाओं की थाली से दूर हटा लिया है जहां बाधित monolayer के क्षेत्रों की गोलाई नोट. छवियाँ 200X बढ़ाई एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. एस salivarius और घोड़े रक्त अगर पर न्यूमोकोकल कालोनियों. एस व्हाइट ने संकेत दिया salivarius कालोनियों, छोटे और सफेद होते हैंतीर और सफेद तीर और पत्र बी ने संकेत दिया अक्षर ए न्यूमोकोकल (एस निमोनिया) कालोनियों, रंग में आम तौर पर बड़े चापलूसी, और हरे हैं बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. उदाहरण एस qPCR के लिए निमोनिया मानक वक्र. जीनोमिक डीएनए गणना सीटी मूल्यों के साथ दिखाए जाते हैं (* एक प्रतिनिधि qPCR परख से डुप्लिकेट मानक वक्र कुओं का औसत), ग्राफ पर दिखाया परिणामी मानक वक्र, समीकरण, और आर 2 मूल्य के साथ. के लिए क्लिक करें बड़ी छवि को देखने .

चित्रा 5 सामग्री चौड़ाई = "6in" src = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" चौड़ाई = "600" />
एस चित्रा 5. प्रभाव . (पीएनसी, 100% के लिए सामान्यीकृत) सीसीएल -23 कोशिकाओं कोशिकाओं अकेले pneumococci साथ incubated रहे थे जब सीसीएल -23 सेल monolayers को न्यूमोकोकल पालन करने के लिए न्यूमोकोकल पालन पर salivarius pneumococci और 100 यू / एमएल हेपरिन (हेपरिन) के साथ, या pneumococci साथ और एस salivarius ~ 10 के अनुपात में जोड़ी गई: एस salivarius: 1 pneumococci (उच्च), ~ 1 एस salivarius: 1 pneumococci (मध्यम), या ~ 1 एस salivarius:. 10 pneumococci (कम) एस salivarius (बी) के रूप में एक ही समय में, (ए) से पहले 1 घंटे गयी, या 1 घंटा pneumococci के बाद (सी) किया गया था. n ≥ 3, * पी ​​इंगित करता है <0.05 अकेले pneumococci (छात्र टी परीक्षण). की तुलना में जब बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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समूह परख हालत नोट्स
एक अकेले सीसीएल -23 कोशिकाओं
बी + Pneumococci सीसीएल -23 कोशिकाओं
सी सीसीएल -23 कोशिकाओं + pneumococci + हेपरिन कोशिका की सतह को हेपरिन ब्लॉक न्यूमोकोकल पालन 16 glycosylaminoglycans और एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है
डी सीसीएल -23 कोशिकाओं + pneumococci + S salivarius [अधिक] लगभग 1 pneumococcus: 10 एस salivarius
ए सीसीएल -23 कोशिकाओं + pneumococci + S salivarius [मेड] लगभग 1 pneumococcus: 1 एस salivarius
एफ सीसीएल -23 कोशिकाओं + pneumococci + S salivarius [कम] लगभग 10 pneumococcus: 1 एस salivarius


तालिका 1. न्यूमोकोकल पालन परख में परीक्षण स्थितियां. छह बुनियादी परख की स्थिति यहां से वर्णित हैं.

6
परख हालत * CFU / एमएल पीएनसी (qPCR) % पालन (qPCR) CFU / एमएल पीएनसी (व्यवहार्य गिनती) % पालन (व्यवहार्य गिनती)
पीएनसी लड़का 1.1 10 x 7 100 9.1 x 10 6 100
पीएनसी + हेपरिन 1.5 x 10 6 14 7.6 x 10 5 8
पीएनसी + साल [अधिक] 6.1 x 10 5 6 3.2 x 10 5 4
पीएनसी + साल [मेड] 3.6 x 10 6 33 2.7 x 10 6 29
पीएनसी + साल 9.8 x 10 6 92 90

तालिका 2: एस के अलावा के बाद सीसीएल -23 कोशिकाओं को न्यूमोकोकल पालन *. पीएनसी = pneumococci lytA qPCR और व्यवहार्य गिनती विधि द्वारा निर्धारित रूप salivarius; साल = एस salivarius; [अधिक] लगभग 10 साल =: 1 पीएनसी; [मेड] = लगभग 1 साल: 1 पीएनसी; 10 पीएनसी [कम] लगभग 1 साल =.

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Discussion

इस परख की एक महत्वपूर्ण भाग एस की उचित मात्रा जोड़ना है वर्गों 3.1.7 और 3.1.12 में salivarius और pneumococci. सांद्रता आयुध डिपो रीडिंग का उपयोग कर रहे हैं अनुमान है लेकिन प्लेटों अगले दिन गिने जाते हैं जब तक सटीक inocula निर्धारित नहीं कर रहे हैं. इस कारण से, हम मध्य लॉग चरण की पहचान और आयुध डिपो से एकाग्रता का आकलन करने में सहायता करने के लिए परख में उपयोग किए गए सभी जीवाणु उपभेदों के लिए समय के साथ आयुध डिपो और व्यवहार्य मायने रखता है (CFU / एमएल) को मापने के लिए विकास घटता प्रदर्शन की सलाह देते हैं. इसके अतिरिक्त, न्यूमोकोकल उपभेदों उनके पालन गुणों में काफी अलग कर सकते हैं. अच्छा पालन (> 3 घंटा ऊष्मायन के बाद उपकला कोशिकाओं का पालन करने inocula के 10%) न्यूमोकोकल पालन को बाधित करने के लिए प्रोबायोटिक्स की क्षमता की जांच assays के लिए सिफारिश कर रहे हैं के साथ उपभेदों. एक अनुभवी ऑपरेटर द्वारा प्रदर्शन किया, जब भी पालन स्तरों चित्रा 5 में देखा अपेक्षाकृत बड़ी त्रुटि सलाखों इसका सबूत है, परख करने के लिए परख भिन्न हो सकते हैं. के लिएइस कारण हम प्रत्येक परख हालत के लिए डुप्लिकेट कुओं के साथ, एक प्रयोग के लिए तीन दोहराता की एक न्यूनतम सलाह देते हैं. इसी प्रकार की परिवर्तनशीलता कोलाई 18 का उपयोग पालन assays में सूचित किया गया है. इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं pneumococci के अलावा के बाद 3 घंटे के लिए incubated हैं. पालन ​​समय पाठ्यक्रम प्रयोगों का प्रदर्शन किया और बैक्टीरिया के बहुमत ऊष्मायन के पहले घंटे के दौरान पालन करना बताते हैं कि कर रहे हैं ऊष्मायन समय छोटा किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल न्यूमोकोकल पालन, qPCR और व्यवहार्य गिनती बढ़ाता के लिए दो तरीकों को प्रस्तुत करता है. दोनों तरीकों उपयुक्त हैं, और चुनाव संचालक की पसंद और उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरण (एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन को जैसे का उपयोग) पर निर्भर करता है. व्यवहार्य गिनती से मात्रा का अतिरिक्त अभिकर्मकों या एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन की आवश्यकता नहीं है कि एक कम लागत तरीका है. हालांकि, यह (12 अच्छी तरह से परख के लिए आमतौर पर 80 प्लेटें) कई प्लेटों का उपयोग करता है और तत्काल किया जाना चाहिएपरख के अंत में ly, और न्यूमोकोकल कालोनियों गिनती एस की एक बड़ी मात्रा में होते हैं कि प्लेटों पर मुश्किल हो सकता है salivarius. QPCR द्वारा मात्रा का अधिक महंगा है और एक लंबा डीएनए निष्कर्षण कदम की आवश्यकता है, लेकिन नमूने कार्यकुशलता बढ़ाने, स्थिर और बैचों में संसाधित संग्रहित किया जा सकता है. निकाले डीएनए भी ऐसे पक्षपाती एस के qPCR का पता लगाने के रूप में अन्य प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है salivarius. एस जांच कर रही हैं salivarius पालन, यह सीसीएल-23 कोशिकाओं के साथ साथ एस के साथ कुओं को शामिल करने की सिफारिश की है salivarius (pneumococci बिना) और सीसीएल-23 कोशिकाओं के साथ साथ एस के साथ कुओं salivarius और हेपरिन के रूप में अतिरिक्त नियंत्रण.

बुनियादी परख भी उपनिवेशवाद का अन्य वैज्ञानिक पहलुओं की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, cytokine उत्पादन पर प्रोबायोटिक्स के प्रभाव सेल supernatants भंडारण और परख करने की क्रिया द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. परख भी नहीं बल्कि द्वारा पालन से जीवाणु आक्रमण की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता हैपूर्व कटाई और lysing कोशिकाओं को कोशिकी बैक्टीरिया को मारने के लिए कोशिका झिल्ली अभेद्य एंटीबायोटिक दवाओं के साथ कोशिकाओं incubating. यहाँ वर्णित है, परख पक्षपाती और आक्रामक (भाँति) pneumococci के बीच भेद नहीं करता. हालांकि, पिछले अध्ययनों भाँति pneumococci का स्तर (PMP843 सहित) सबसे आइसोलेट्स के लिए तो 10 (आमतौर पर inocula के 0.01% ≤) बहुत छोटी हो पाया है, सेल जुड़े pneumococci के विशाल बहुमत के पक्षपाती बजाय भाँति हैं. अतिरिक्त अनुप्रयोगों बसाना बाधित करने की क्षमता के लिए अन्य प्रोबायोटिक प्रजातियों का परीक्षण, और / या हित के विशिष्ट जीन की भूमिका की जांच करने के लिए उत्परिवर्ती जीवाणु उपभेदों को देख शामिल हैं.

इस में इन विट्रो परख का एक स्पष्ट सीमा है कि यह एक स्थापित उपकला, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, सामान्य वनस्पति, या होने की संभावना विवो में न्यूमोकोकल बसाना को प्रभावित करने वाले अन्य कारकों में शामिल नहीं करता है. पूरी तरह से है कि क्या प्रोबायोटिक्स cou का मूल्यांकन करने के लिएएलडी पशु मॉडल का उपयोग और मानव नैदानिक ​​परीक्षणों warranted रहे vivo अध्ययन में, श्वसन तंत्र में रोगज़नक़ बसाना रोकने में उपयोगी हो. फिर भी, इन विट्रो पालन assays न्यूमोकोकल पालन को बाधित करने की क्षमता के साथ प्रोबायोटिक्स की पहचान करने के लिए एक उपयोगी स्क्रीन के रूप में सेवा और तरजीही खुराक रणनीतियों के बारे में जानकारी है, साथ ही यंत्रवत अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक प्रयोगात्मक मॉडल उपलब्ध कराने प्रदान कर सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम मर्डोक लड़कों की अनुसंधान संस्थान और विक्टोरियन सरकार का परिचालन बुनियादी सुविधाओं सहायता कार्यक्रम से धन के द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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एक का प्रयोग न्यूमोकोकल औपनिवेशीकरण पर प्रोबायोटिक्स के प्रभाव की जांच<em&gt; इन विट्रो</em&gt; पालन परख
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Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

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