Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Os ensaios in vitro de adesão pode ser utilizado para estudar a ligação de Streptococcus pneumoniae a monocamadas de células epiteliais e para investigar possíveis intervenções, tais como o uso de probióticos para inibir a colonização de pneumococo.

Abstract

A adesão de Streptococcus pneumoniae (pneumococos), para o revestimento epitelial da nasofaringe pode resultar em colonização e é considerada um pré-requisito para as infecções pneumocócicas, tais como pneumonia e otite média. Ensaios in vitro de adesão pode ser utilizado para estudar a ligação de pneumococos para células epiteliais monocamadas e para investigar possíveis intervenções, tais como o uso de probióticos, para inibir a colonização de pneumococo. O protocolo aqui descrito é utilizado para investigar os efeitos do Streptococcus salivarius probiótico na aderência de pneumococos para a linha de células epiteliais humanas CCL-23 (por vezes referidas como células HEp-2). O ensaio envolve três passos principais: 1) a preparação de células epiteliais e bactérias, 2) a adição de bactérias de monocamadas de células epiteliais, e 3) detecção de pneumococos aderente por contagem de viáveis ​​(diluição em série e plaqueamento) ou quantitativa PCR em tempo real (qPCR ). Esta technique é relativamente simples e não requer equipamento especializado, que não seja uma instalação de cultura de tecidos. O ensaio pode ser usado para testar outras espécies de probióticos e / ou inibidores potenciais de colonização pneumocócica e pode ser facilmente modificado para tratar outras perguntas científicos sobre a adesão pneumocócica e invasão.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pneumococos) é uma bactéria Gram positiva que pode causar infecções, incluindo pneumonia, otite média, e meningite. É uma das principais causas de doenças em crianças em países de baixa renda e responsável por cerca de 800.000 mortes de crianças menores de cinco anos de idade anualmente 1. Os pneumococos são freqüentemente realizadas na nasofaringe de crianças pequenas. Embora esta colonização é considerado geralmente assintomática, que precede a infecção por pneumococos e serve como um reservatório para as bactérias em duas populações humanas. Vacinação conjugada pneumocócica reduz eficazmente o transporte dos serotipos contidos na vacina. No entanto, existem mais de 90 serotipos de pneumococos, e a vacinação pode levar à substituição do serotipo, em que a eliminação dos serotipos da vacina é seguido por um aumento no transporte e doença causada por serotipos nonvaccine 3. Além disso, em algumas populações de alto risco, pneumocócicacolonização frequentemente ocorre muito cedo na vida, antes da administração da primeira dose de vacina de 4,5. Recentemente, o uso de probióticos tem sido proposta como uma estratégia adicional para inibir pneumocócica 6,7 colonização. Ensaios in vitro de adesão foram usadas para examinar a aderência pneumocócica 8,9. Estes ensaios foram adaptados para investigar o impacto do probiótico Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) na aderência pneumocócica 10.

Além LGG e outras bactérias de ácido láctico, Streptococcus salivarius, residente comuns da cavidade oral, tem sido investigada como um probiótico potencial para o tracto respiratório devido ao seu potencial de colonização e a capacidade para inibir a pneumococos e outros patogénicos respiratórios in vitro 11 - 13. O protocolo aqui apresentado descreve um ensaio de aderência utilizado para investigar os efeitos de S. salivarius K12 na adesão pneumocócicapara a linha de células epiteliais humanas CCL-23. Antes de ser utilizado no ensaio, pneumococos isolados foram avaliadas por capacidades de adesão, como o crescimento e as propriedades de aderência pode variar entre substancialmente isolados 10,14. As curvas de crescimento de pneumococos e S. salivarius foram realizados para determinar a fase mid-log e estimar a concentração de (unidades formadoras de colónias ou de UFC / mL) por densidade óptica (OD, Figura 1). Recomenda-se para analisar o crescimento de contagem viável e OD para cada isolado antes da sua utilização no ensaio. Este ensaio pode ser realizado em qualquer laboratório com equipamento de cultura de tecido padrão e equipamento. Neste protocolo, os efeitos de três doses de S. salivarius administrado 1 hora antes da adição de pneumococos na aderência de S. pneumoniae PMP843, um sorotipo 19F transporte isolado derivado de um swab de nasofaringe, são examinados. Duas formas diferentes para quantificar pneumococos aderente são apresentados: plaqueamento em agar sangue para determina contagens viáveis, e a extracção do ADN e a detecção do gene lytA pneumocócica por qPCR 15. O protocolo básico de ensaio de aderência pode ser facilmente modificado para testar diferentes doses ou o tempo de administração de probióticos e também pode ser utilizado com outras estirpes bacterianas ou de espécies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparação de células epiteliais e bactérias

  1. Descongelamento de CCL-23 células epiteliais
    1. Pré-aquecer mínima Meios Essencial (MEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) em um banho de água a 37 ° C durante ~ 30 min.
    2. Esterilizar o tecido-aprovado cultura cabine de segurança biológica com luz UV por pelo menos 10 minutos antes do uso, e limpar a área de trabalho com etanol 70%. Limpe a garrafa mídia aquecido com etanol e local de 70% na cabine de segurança biológica.
    3. Utilizando uma pipeta de 25 ml, transferir 14 ml de meio num balão T-75. Coloque frasco em 37 ° C incubadora enquanto células são descongelamento (seção 1.1.4).
    4. Remover um frasco de CCL-23 células de armazenamento de nitrogênio líquido, utilizando medidas de segurança apropriadas e quente em banho-maria 37 ° C até ~ 80% descongelado.
    5. Retorne o frasco preparado no ponto 1.1.3 para a cabine de segurança biológica. Limpar a superfície exterior do frasco de células CCL-23 com 70% de etanol e os conteúdos de transferência (1 ml) para o t-75 Frasco com uma pipeta P1000.
    6. Incubar o balão sobre o seu lado num banho a 37 ° C, 5% de CO 2, 95% de humidade relativa de cultura de tecidos incubadora durante a noite (16-20 hr).
    7. Verifique as células em um microscópio para confirmar a morfologia saudável, ao remover a mídia, e substituir com 15 ml frescos, pré-aquecido MEM + 10% FBS.
  2. Manutenção de CCL-23 células epiteliais
    1. Uma vez que as células são ~ 80% confluentes (1-2 dias), a passagem através da remoção de suporte, utilizando uma pipeta de 25 mL e lavar suavemente as células duas vezes com 8-10 ml de pré-aquecida de fosfato salino tamponado (PBS) utilizando uma pipeta de 10 ml.
    2. Remover PBS e adicionar 1 ml de estéril de 0,25% de tripsina-EDTA (0,25% (w / v) de tripsina, EDTA 0,1 mM). Ligue balão de lado, girar a assegurar tripsina cobre a camada confluente de células, e incuba-se o balão durante 2-3 min em 37 ° C, 5% de CO2.
    3. Frasco Voltar para a cabine de segurança biológica, adicionar 9 ml pré-aquecido MEM + 10% FBS, e pipeta cima e para baixo 6 -8x para voltar a suspender as células, a ejecção de líquido para baixo da parede lateral do balão para desalojar as células.
    4. Células divididas 1:15 (1 ml + 14 ml de MEM + 10% de FBS) ou 1:30 (0,5 ml + 14,5 ml de MEM + 10% de FBS), descartar células em excesso, e um balão de regresso ao 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
    5. Passagem das células, pelo menos duas vezes antes da utilização no ensaio de adesão. Normalmente as células são divididas a cada 3-4 dias.
  3. Sementeira de CCL-23 células epiteliais (um dia antes da aderência ensaio, Protocolo 2)
    1. Dividir as células confluentes, como descrito nas secções 1.2.1-1.2.3, ressuspensão em MEM previamente aquecido + FBS a 5% (concentração de FBS é reduzido para reduzir o risco de os componentes do soro que interferem no ensaio). Remover 20 l de células e contar com coloração azul de tripan e um hemocitômetro.
    2. Diluir as células em MEM previamente aquecido + 5% de FBS com uma concentração de 1,5 x 10 5 células / ml em um tubo de 50 ml estéril.
    3. Semente de 1 ml de células / cavidade em um tecido-Cultura tratada de 24 poços placa.
  4. Preparação das bactérias
    Este procedimento pode ser seguido para a preparação de pneumococos e S. salivarius. Meio de crescimento bacteriano é normalmente mantido em uma incubadora de 37 ° C durante a noite para pré-aquecimento e de teste para a esterilidade (geralmente aparecerá nublado se contaminado).
    1. Dois dias anteriores à adesão do ensaio, bactérias raia sobre cavalo agar sangue placas (HBA) e incubar a 35-37 ° C e 5% de CO 2 por 18-24 horas. Agar de sangue de ovelha pode ser usado como alternativa.
    2. No dia seguinte, prepare uma cultura durante a noite para cada espécie bacteriana pipetando 10 ml Todd-Hewitt Broth com 0,5% de extrato de levedura (THB + YE) em um meio estéril 30 ml tubo. Utilizando uma ansa de 10 ul, inocular aproximadamente 10-12 colónias bem separadas. Resumidamente vortex e incuba-se a 35-37 ° C e 5% de CO 2 durante 14-16 horas. Note-se que os pneumococos vai autolyze se deixado muito tempo na cultura caldo.

    2 Aderência Ensaio:. Adição de bactérias para epiteliais Monolayers celulares

    1. Preparação de meados de fazer culturas bacterianas de pneumococos e S. salivarius
      1. Pipetar 10 ml de pré-aquecido THB + YE em cada uma das duas estéreis 30 ml tubos, um pneumococos rotulada e outra S. salivarius.
      2. Para chegar a fase mid-log, pneumococos requerem ~ 3 horas e S. salivarius exigem ~ 2 horas de incubação (ver Figura 1). Iniciar ambas as culturas, ao mesmo tempo. Vortex (3-5 seg) culturas de bactérias durante a noite e adicionar 100 mL pneumococos e 100 l S. salivarius em tubos correspondentes.
      3. Resumidamente vortex e incubar as culturas a 37 ° C durante aproximadamente 2 horas para S. salivarius e 3 horas para pneumococos.
    2. Preparação de CCL-23 células para ensaio adesão
      1. Usando um microscópio invertido, verifique a placa de 24 poços para confluent monocamadas com a morfologia das células saudáveis. As monocamadas deve ser> 80% confluentes, sem evidência de agregação de células ou os efeitos citopáticos tais como arredondamento celular ou perda de aderência (ver Figura 2).
      2. Remova a mídia em cada poço usando uma pipeta de transferência, inclinando ligeiramente a placa para não perturbar a monocamada de células.
      3. Para lavar suavemente as células, adicionar ~ 500 mL pré-aquecido PBS em cada poço usando uma pipeta sorológica e removê-lo com uma pipeta, inclinando a placa ligeiramente. Descarte a PBS. Repita o passo de lavagem uma vez.
      4. Adicionar 500 ul de MEM previamente aquecido + 5% de FBS a cada poço. E volta da placa de 24 cavidades para a incubadora de CO 2 durante a preparação das culturas bacterianas.
        Nota: Para determinar o número exacto de células CCL-23 para a multiplicidade de infecção (MOI), dois poços podem ser tratadas com tripsina e contadas no dia de infecção.

    3. Ensaio Aderência

    1. Adicionar para pneumococosos CCL-23 células em um ~ 10:01 MOI. Teste as condições listadas na Tabela 1 em poços duplicados.
      1. Medir a densidade óptica a 600 A (OD) de 1 ml de S. cultura salivarius. OD deve estar entre 0,3-0,6.
      2. Transferir 5 ml de S. salivarius cultura para um tubo de 10 ml e centrifugar a 1870 g durante 4 min.
      3. Desprezar o sobrenadante e com base na leitura OD na seção 3.1.1, ressuspender S. salivarius de 200-1.000 ul de NaCl a 0,85% (concentração final de ~ 1,5 x 10 9 CFU / ml). Como orientação geral, uma overdose de 0.375 serão novamente suspensas em 260 mL. Preparar diluições 1:10 e 1:100 de S. salivarius usando 0,85% de NaCl.
        Nota: No total, três concentrações (representando alta, média e baixas doses) de S. salivarius vai ser testado no ensaio. A dose mais elevada é a proporção de ~ 10 S. salivarius: 1 pneumococos, o meio é ~ 1 S. salivarius: 1 pneumococos, eo baixo é ~ 1 S. salivarius: 10 pneumococos.
      4. Retire a placa de 24 poços da incubadora.
      5. A partir dos poços de controlo de heparina, remover 40 ul de meio e adicionar 50 uL de heparina (1000 U / ml de concentração estoque) para uma concentração final de 100 U / ml.
      6. Adicionar 10 ml de NaCl a 0,85% para os poços que contêm as células CCL-23 e apenas os poços que contêm as células CCL-23 e os pneumococos (sem S. salivarius).
      7. Adicionar 10 ul de não diluído, 1:10 e 1:100 de S. salivarius aos respectivos poços.
        Nota: S. salivarius também pode ser adicionado ao mesmo tempo que os pneumococos (coaddition) ou 1 hora após pneumococos (pós-adição) para examinar o efeito do tempo de administração de probióticos.
      8. Centrifugar a placa de 24 poços a 114 g durante 3 min para promover o contacto com bactérias na camada de células e incubar durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2.
      9. Realizar diluição em série do S. estoque salivarius em 0,85% de NaCl e placa em duplicado HBAplacas para contagem de viáveis. Em primeiro lugar, adicionar 50 ul de estoque de 450 ul de NaCl a 0,85% para obter uma diluição de 10 -1, então impulsos de vórtice (5 segundos), pontas de mudança, e adicionar 50 ul de uma diluição de 10 -1 a 450 ul de NaCl a 0,85% para obter uma diluição de 10 ~ 2 e assim por diante até 10 -7.
      10. Placa 100 l de 10 -5, 10 -6 e 10 -7 diluições em duplicata em placas HBA e espalhe com uma espátula estéril. Incubar as placas HBA invertidos durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2.
      11. No final da incubação de 1 hora, repita seções 3.1.1-3.1.3 por pneumococos. Overdoses deve ser entre 0,2-0,7. Girar 1 ml de cultura de pneumococos e ressuspender o pellet em 300-2.000 ul de NaCl a 0,85% (com base na leitura de DO) a uma concentração de aproximadamente 1,5 x 10 8 UFC / ml. Como orientação geral, um diâmetro externo de 0,3 será novamente suspensas em 500 ul.
      12. Depois de 1 hr de incubação com S. salivarius, adicionar 10 μ; L pneumococos não diluído a todos os poços, excepto os poços de controlo negativo (células contendo apenas).
      13. Centrifugar a placa de 24 poços a 114 g durante 3 min e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 3 horas. Realizar diluição em série do estoque de pneumococos em 0,85% NaCl como descrito na seção 3.1.9 e diluições placa 10 -4, 10 -5 e 10 -6 em placas HBA duplicados para a contagem de viáveis.
    2. Depois de 3 horas, verifique as células em um microscópio para garantir que monocamadas parecem saudáveis ​​(ver Figura 2). Remova a mídia de cada poço e lavar cuidadosamente as células 3x como descrito no ponto 2.2.3. utilizando uma pipeta diferente para cada condição. Este passo é essencial para remover pneumococos não-aderentes. As monocamadas não deve vir à parte durante o processo de lavagem; isto pode ser confirmado por verificação de novo sob um microscópio.

    Nota: Média removido durante este passo pode ser armazenada a -20 ° C durante análises adicionais (<em> por exemplo, a medição dos níveis de citocinas).

    1. Adicionar 200 ul de 0,1% de digitonina (um detergente suave) a cada poço e incubar durante 7 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2.
    2. Adicionar 800 ul de meio THB a cada poço. Lisar as células por pipetagem para cima e para baixo, e, se necessário, raspar poços 3-4x com a ponta da pipeta para garantir que a monocamada de células é completamente removido. Mude dicas entre poços.
    3. Remover o conteúdo de cada poço utilizando uma pipeta P1000 e transferir para tubos de microcentrífuga rotulados.

    4. Quantificação de Aderentes pneumococos

    Pneumococos aderente pode ser quantificada pela contagem de viáveis ​​(diluição em série e plaqueamento em agar de sangue) ou por quantitativa PCR em tempo real.

    1. Método de contagem viável
      Este método tem de ser realizado imediatamente depois do passo 3.5 do ensaio de adesão.
      1. Para cada ensaio bem, prepare-se diluições em série de amostras coletadas emo passo 3.5 do ensaio de aderência por adição de 50 uL de amostras de 450 ul de NaCl a 0,85%, pulso vórtex, e diluindo em série, tal como descrito na secção 3.1.9 até à diluição de 10 -6.
      2. Placa de 100 ul de 10 -3, 10 -4, 10 -5, e -6 10 diluições em duplicado em agar de sangue, espalhada com um espalhador estéril e incubar as placas invertidas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2. Note-se que os poços que contêm as células CCL-23 por si só não devem conter qualquer bactéria e pode ser revestida puro (100 uL diluido) como um controlo de esterilidade.
      3. No dia seguinte, determinar os inóculos pneumocócica por contagem das colónias nas placas de diluição adequado (contendo 30-300 colónias) preparados na secção 3.1.13 do ensaio de adesão. Calcular a CFU / ml do inoculo utilizando o valor médio a partir de dois pratos. Da mesma forma, determinar a S. salivarius inóculos por contagem das colónias nas placas preparadasna seção 3.1.10.
        Nota: As placas devem conter apenas pneumococos; a presença de outras espécies indica que o ensaio foi contaminada e os resultados não são válidos.
      4. Para determinar os níveis de adesão pneumocócicas, contar o prato diluição adequada (contendo 30-300 colônias pneumocócicas) para cada amostra preparada na seção 4.1.1. Note-se que S. colónias salivarius será pequeno e branco, ao passo que os pneumococos será devido plana e esverdeada ao α-hemólise, como mostrado na Figura 3. Para calcular a aderência pneumocócica, normalizar o número de aderente do pneumococos condição b. CCL-23 células + pneumococos para 100%, e comparar os pneumococos aderente a partir de outras condições para esta condição.
    2. método de qPCR
      Amostras coletadas em Adesão Ensaio passo 3.5 pode ser armazenada a -20 ° C até a extração de DNA. A extracção do ADN é realizada utilizando um kit comercial e descrita nas secções 4.2.1-4.2.9 e o qPCR quantodizer em seções 4.2.10-4.2.20.
      1. Preparar tampão de lise enzimática (50 mM tampão fosfato pH 6,7 contendo 1 mg / ml de lisozima, de 0,075 mg / ml de mutanolisina, e 2 mg / ml de proteinase K). A receita a seguir pode ser usado fazer 10 ml (suficiente para 50 extrações). Tampão de lise enzimática deve ser preparada antes da utilização.

        7,25 ml de solução 50 mM de tampão fosfato (pH 6.7)
        1,00 ml de 10 mg / ml de lisozima para uma final [1 mg / ml]
        0,75 ml de 1 mg / ml de mutanolisina estoque para um final [0,075 mg / ml]
        1,00 ml de 20 mg / ml de Proteinase K estoque para um final [2 mg / ml]
      2. Descongelar as amostras em gelo ou a 4 ° C. Vortex e transferência de alíquotas de 100 ul de cada amostra para tubos de microcentrífuga rotulados. Retornar amostras originais de volta para a -20 ° C congelador.
      3. Centrifugar as amostras a 6700 xg durante 10 min.
      4. Remover e descartar o sobrenadante. Adicionar 200 ul de tampão de lise enzimática ao sedimento e vortex para ressuspender. IncubComeram as amostras a 56 ° C durante 30 min. Centrifugar brevemente (5 segundos) em 6.700 x g para recolher o líquido na parte inferior do tubo.
      5. Adicionam-se 10 ul de SDS a 20% para completar a lise das células e misturar suavemente à temperatura ambiente durante 2 min.
      6. Adicionar 4 mL de RNase A (100 mg / ml) e misturar delicadamente (num agitador ou por inversão dos tubos), à temperatura ambiente, durante 2 min.
      7. Adicionar 200 ul de tampão de AL (do kit) e vortex durante 15 seg. Incubar as amostras a 70 ° C durante 10 min. Centrifugar brevemente (5 segundos) em 6.700 x g para recolher o líquido na parte inferior do tubo.
      8. Adicionar 200 ul de EtOH a 100% e de vórtice durante 15 seg. Giram rapidamente para recolher o líquido do fundo do tubo, em seguida, transferir a mistura (incluindo qualquer precipitado) para a coluna de centrifugação (de um tubo de recolha de 2 ml) sem molhar o aro. Siga as etapas de lavagem de acordo de protocolo do fabricante (não mostrado aqui).
      9. Para eluir o DNA, transferir coluna num tubo de microcentrífuga rotulado, adicionar 50 ul de Tampão AE (frkit om), e incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Centrifugar a 4300 xg por 1 min. Repetir uma vez para um volume de eluição final de 100 ul. O ADN pode ser armazenada a -20 ° C até à sua utilização.
      10. Para executar qPCR, esterilizar os capuzes com luz UV durante 15 minutos antes de começar. Preparando uma placa de 96 poços mapa planilha para registrar localização dos poços para cada amostra é recomendado.
      11. Prepare curva padrão, utilizando a 10 ng / mL de estoque DNA genômico pneumocócica (extraído de referência ATCC 6305).
        1. Descongele DNA estoque pneumocócica e girar rapidamente (5 segundos) em uma centrífuga de mesa.
        2. Efectuar diluições em série 1:10 em seis tubos de microcentrífuga adicionando prelabeled 3 ul de DNA a 27 ul sem nuclease H2O, mudando dicas e vórtice entre cada diluição. A série de diluição final consiste em seis tubos de: 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 e 0,00001 ng / mL.
          Nota: Estes podem ser armazenados a 4 ° C durante até uma semana.
      12. Prepare lytA MasterMix como segue em um estéril tubo de 15 ml em uma capa PCR estéril. Descongelar componentes em gelo e vórtice imediatamente antes da utilização. 15 de Carvalho et al. E são mostrados na lista de materiais.
      13. Vortex e carga de 23 ul / cavidade do lytA misturar em poços adequados. Consulte a placa do mapa.
      14. Placa de Transporte de modelo de área além (de preferência um armário estéril em uma sala separada) para o carregamento da amostra.
      15. Use uma pipeta de P2 para carregar amostras, mudando dicas para cada poço. Todas as amostras são executados em duplicata. Consulte a placa de mapa para localização.
      16. Nos poços da curva padrão, adicionar 1 ml / poço de uma diluição adequada de ADN curva padrão mais 1 ul / poço de H2O para levar o volume final a 25 ul.Para não poços de controlo modelo, adicione 2 mL de H 2 O.
      17. Adicionar 2 mL / poço de amostra de ADN nos poços apropriados.
      18. Tampe todos os poços em uso. Certifique-se que as tampas estão fechadas confortavelmente. Rapidamente girar a placa de PCR (5 segundos) antes de colocar a placa em uma máquina de PCR em tempo real.
      19. Placa de carga em máquina de PCR e qPCR prazo de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante da máquina. As condições dos ciclos seguintes de sondas de hidrólise são recomendados:
        20. componente por reação x 102 (prato cheio)
        lytA F 0,25 mL de 10 mM estoque 25,5 mL
        lytA R 0,25 mL de 10 mM estoque 25,5 mL
        sonda lytA 0,5 mL de 10 mM estoque 51 mL
        H2O 9,5 mL 969 mL
        Mix Master 12,5 mL 1275 mL
        Volume final 23 mL 2346 mL
        Passo 1 (1x): 3 min a 95 ° C
        Passo 2 (40x): 20 seg a 95 ° C
        20 seg a 60 ° C
      20. Coletar dados e quantificar DNA pneumocócica usando a curva padrão. Cargas bacterianas são calculadas como anteriormente descrito 17, estimando-se que 1 pg de ADN genómico é equivalente a 447,4 células, e registadas como CFU / ml (assumindo que oNE do genoma por CFU, e uma cópia de lytA por do genoma; ver Figura 4). Para um ensaio bem sucedido, o valor de R 2 deve ser ≥ 0,98 e todos os resultados positivos dentro da gama da curva padrão (cT valores menores do que o obtido para a 0,00001 ng / mL de pontos da curva padrão são considerados fundo / lytA negativo).
        Nota: Alguns sistemas de PCR em tempo real incluem um software de análise que podem ser usados ​​para construir curvas padrão e calcular incógnitas. Caso contrário, estes cálculos podem ser realizados em Excel ou programas semelhantes. Uma curva padrão de exemplo é mostrado na Figura 4.
      21. Para calcular a adesão pneumocócica, normalizar o número de pneumococos aderente da condição b. CCL-23 células + pneumococos para 100%, e comparar os pneumococos aderente a partir de outras condições para esta condição.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Os resultados de uma experiência representativa em que os pneumococos (S. pneumoniae PMP843, um isolado de colonizar 19F) foram adicionados a células CCL-23 de 1 hora após a adição de S. salivarius, e aderência pneumocócica foi quantificada por contagem de viáveis ​​e ambos lytA qPCR são mostrados na Tabela 2. resultados foram consistentes entre os dois métodos de ambos, o número absoluto de bactérias (apresentada como CFU / ml) e a aderência%, normalizada para o número pneumococos de aderentes nos poços contendo pneumococos sozinho. A heparina é utilizada como um controle uma vez que é conhecido por inibir a adesão e, portanto, pneumocócica a adesão reduzida na condição pneumococos + heparina (tipicamente <40% em comparação com pneumococos sozinho) é indicativa de um teste de sucesso. S. salivarius inibe a adesão pneumocócica de uma forma dependente da dose, tal como mostrado na Tabela 2, em que a elevada concentração de S. salivarius (aproximadaly 10 S. salivarius: 1 pneumococos) resultou em menor aderência pneumocócica.

A Figura 5 mostra a adesão de pneumococos para CCL-23, quando as células de S. salivarius é adicionado 1 hora antes de pneumococos (preaddition), simultaneamente (coaddition), ou 1 hora depois de pneumococos (pós-adição). S. salivarius é mais eficaz na inibição da adesão pneumocócica quando adicionado antes de pneumococos, como ambas as doses altas e médias de S. salivarius reduziu significativamente a adesão pneumocócica no ensaio preaddition (Figura 5A), enquanto que apenas a uma dose elevada de S. salivarius inibiu a adesão pneumocócica no coaddition e ensaios de pós-adição (Figuras 5B e 5C).

Os dados apresentados na Tabela 2 e Figura 4 e 5 foram obtidos usando uma versão anterior dos primers lytA qPCR e sonda 17. O protocolo atual descreve o ensaio de qPCR atualizado.

Figura 1
Figura 1. Representativos das curvas de crescimento de S. pneumoniae PMP843 (A) e S. salivarius K12 (B). Para cada espécie, CFU / ml, tal como determinado por contagem viável é mostrado em preto (eixo y da esquerda), e a densidade óptica (DO) a 600 nm é mostrado em (eixo y da direita) cinza. Fase Mid-log foi estimado por contagem viável para ser 3 horas para S. pneumoniae PMP843 e 2 horas para S. salivarius K12. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51069/51069fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figura 2. Exemplos de saudáveis ​​CCL-23 e células CCL-23 células com efeitos citopáticos (CPE). A) Exemplo de, uma monocamada confluente saudável de células CCL-23. B) CCL-23 células com os efeitos citopáticos. Nota arredondamento das células, regiões intracelulares brilhantes, e as áreas de monocamada interrompido onde as células têm levantado a placa. As imagens foram tiradas com um microscópio de luz invertida com ampliação de 200X. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3
Figura 3. S. salivarius e colônias de pneumococos em ágar sangue de cavalo. S. colónias salivarius são pequenas e brancas, conforme indicado pela brancoflecha e letra A. pneumocócica (S. pneumoniae) colônias são geralmente maiores, mais plana e de cor esverdeada, como indicado pela seta e carta branca B. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 4
Figura 4. S. Exemplo curva padrão pneumoniae por qPCR. cálculos de ADN genómico são apresentados juntamente com os valores Ct (* média de poços em duplicado da curva padrão a partir de um ensaio representativo de qPCR), com o valor resultante curva padrão, a equação, e R 2 mostrado no gráfico. clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 5 content-width = "6 pol" src = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" width = "600" />
Figura 5. Efeito de S. salivarius na aderência pneumocócica a CCL-23 para as células de adesão pneumocócica CCL-23, quando as monocamadas de células foram incubadas com pneumococos sozinho. (Pnc; normalizada para 100%), com pneumococos e 100 U / ml de heparina (heparina), ou com pneumococos e S. salivarius adicionado numa proporção de ~ 10: S. salivarius: 1 pneumococos (alto), ~ 1 S. salivarius: 1 pneumococos (médio), ou ~ 1 S. salivarius:. 10 pneumococos (baixo) S. salivarius foi adicionado uma hora antes (A), ao mesmo tempo em que (B), ou 1 hora após pneumococos (C). n ≥ 3, * indica P <0,05 quando comparado com pneumococos sozinho (teste t de Student). Clique aqui para ver a imagem ampliada .

"Fo: manter-together.within-page =" always ">

Grupo Condição Assay Notas
A CCL-23 células isoladas
B CCL-23 células + pneumococos
C CCL-23 células + pneumococos + heparina Blocos de heparina adesão à superfície da célula pneumocócica glycosylaminoglycans 16 e é usado como um controle
D CCL-23 células + pneumococos + S. salivarius [alta] Aproximadamente 1 pneumococos: 10 S. salivarius
E CCL-23 células + pneumococos + S. salivarius [med] Aproximadamente 1 pneumococo: 1 S. salivarius
F CCL-23 células + pneumococos + S. salivarius [baixo] Aproximadamente 10 pneumococo: 1 S. salivarius


Tabela 1. Condições testadas no ensaio de adesão de pneumococo. Os seis condições básicas de ensaio são descritas aqui.

6
Condição Ensaio * CFU / ml Pnc (qPCR) % De adesão (qPCR) CFU / ml Pnc (contagem viável) % De adesão (contagem viável)
Sozinho Pnc 1,1 x 10 7 100 9,1 x 10 6 100
Pnc + heparina 1,5 x 10 6 14 7,6 x 10 5 8
Pnc + Sal [alta] 6,1 x 10 5 6 3,2 x 10 5 4
Pnc + Sal [med] 3,6 x 10 6 33 2,7 x 10 6 29
Pnc + Sal 9,8 x 10 6 92 90

Tabela 2: aderência pneumocócica a CCL-23 as células após a adição de S. salivarius, conforme determinado pelo lytA qPCR e método de contagem viável * Pnc = pneumococos.; Sal = S. salivarius; [Alta] = aproximadamente 10 Sal: 1 Pnc; [Med] = aproximadamente 1 Sal: 1 Pnc; [Baixo] = aproximadamente 1 Sal: 10 Pnc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A parte crítica deste ensaio é a adição de concentrações adequadas de S. salivarius e pneumococos nas seções 3.1.7 e 3.1.12. As concentrações são estimados usando leituras OD mas os inóculos exacta não é determinado até que as placas são contadas no dia seguinte. Por esta razão, recomenda-se realizar as curvas de crescimento para medir a OD e as contagens viáveis ​​(CFU / ml) ao longo do tempo para todas as estirpes bacterianas usadas no teste para identificar a fase mid-log e auxiliar no cálculo da concentração de OD. Além disso, cepas de pneumococo podem diferir substancialmente em suas propriedades de aderência. Estirpes com boa aderência (> 10% de inóculos aderirem às células epiteliais, após uma incubação de 3 h), são recomendados para ensaios investigando a capacidade de probióticos para inibir a adesão de pneumococo. Mesmo quando realizado por um operador experiente, níveis de aderência pode variar de ensaio para ensaio, tal como evidenciado pelas barras de erro relativamente grande visto na Figura 5. Paraeste motivo, recomendamos um mínimo de três repetições para cada experimento, com poços duplicados para cada condição de ensaio. Variabilidade semelhante foi avaliado em ensaios de aderência utilizando Escherichia coli 18. Neste protocolo, as células são incubadas durante 3 horas a seguir à adição de pneumococos. O tempo de incubação pode ser reduzido se as experiências do curso tempo aderência são executadas e mostraram que a maioria das bactérias aderir durante a primeira hora de incubação.

Este protocolo apresenta dois métodos para quantificar a adesão pneumocócica qPCR e contando viável. Ambos os métodos são adequados e a escolha depende da preferência e de laboratório disponíveis equipamento do operador (por exemplo, o acesso a um equipamento de PCR em tempo real). A quantificação por contagem viável é um método de baixo custo que não requer reagentes adicionais ou uma máquina de PCR em tempo real. No entanto, utiliza muitas placas (tipicamente 80 placas para um ensaio de 12 poços) e deve ser realizada imediatamentely, no final do ensaio, e contando as colónias de pneumococos pode ser difícil em placas que contêm uma grande quantidade de S. salivarius. Quantificação por qPCR é mais dispendioso e requer um passo de extracção de ADN longa, mas as amostras podem ser armazenadas congeladas e processados ​​em lotes, o aumento da eficiência. O DNA extraído também poderia ser utilizada para outros fins, como a detecção de qPCR aderente S. salivarius. Se investigar S. salivarius aderência, recomenda-se incluir poços com CCL-23 células mais S. salivarius (sem pneumococo) e poços com CCL-23 células mais S. salivarius e heparina como controlos adicionais.

O ensaio de base pode também ser adaptada para investigar outros aspectos científicos de colonização. Por exemplo, o efeito de probióticos na produção de citocinas pode ser avaliada por meio do armazenamento e ensaiando os sobrenadantes celulares. O ensaio também pode ser modificado para analisar a invasão bacteriana, em vez de por aderênciaincubação de células com membrana celular antibióticos impermeáveis ​​para matar as bactérias extracelulares, antes da colheita e as células de lise. Como descrito aqui, o ensaio não faz distinção entre (internalizada) pneumococos aderente e invasivo. No entanto, estudos anteriores encontraram os níveis de pneumococos internalizado a ser muito pequeno (tipicamente ≤ 0,01% de inóculo) 10, de modo para a maioria dos isolados (incluindo PMP843), a vasta maioria dos pneumococos associado a células são aderentes em vez internalizado. Outras aplicações incluem a testar outras espécies probióticos para a capacidade de inibir a colonização e, / ou olhando para estirpes bacterianas mutantes para investigar o papel de genes específicos de interesse.

Uma limitação óbvia deste ensaio in vitro é que ele não inclui um epitélio estabelecido, as células imunitárias, a flora normal, ou outros factores que provavelmente influenciam a colonização pneumocócica in vivo. Para avaliar plenamente se probióticos could ser útil na prevenção da colonização da bactéria no trato respiratório, em estudos in vivo utilizando modelos animais e estudos clínicos em humanos são garantidos. No entanto, os ensaios in vitro de adesão servir como uma tela útil para a identificação de probióticos com o potencial para inibir a aderência de pneumococo e pode fornecer informações sobre estratégias de dosagem preferenciais, bem como o fornecimento de um modelo experimental que pode ser usado para estudos mecanicistas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Programa de Apoio à Infra-Estrutura Operacional do Governo de Victoria Childrens Research Institute e Murdoch.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

Tags

Imunologia Edição 86 Gram-positivas Infecções Bacterianas pneumonia bacteriana doenças pulmonares Infecções Respiratórias, A adesão colonização probióticos,
Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter