Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Исследование действия пробиотиков на пневмококковой колонизации Использование Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

В пробирке приверженности анализы могут быть использованы для изучения прикрепление стрептококковой пневмонии на эпителиальные монослоев клеток и исследовать потенциальные вмешательства, такие как использование пробиотиков для ингибирования пневмококковой колонизации.

Abstract

Приверженность пневмококк (пневмококк) в эпителиальной выстилки носоглотки может привести к колонизации и считается необходимым условием для пневмококковых инфекций, таких как пневмония и отит. В пробирке приверженности анализы могут быть использованы для изучения прикрепление пневмококков к эпителиальных клеток монослои и исследовать возможных мер, таких как использование пробиотиков, ингибирует колонизацию пневмококковой. Протокол, описанный здесь используется, чтобы исследовать влияние пробиотического Streptococcus salivarius на адгезию пневмококков к человеческому эпителиальной клеточной линии CCL-23 (иногда называют Нер-2 клеток). Анализ включает в себя три основных этапа: 1) подготовка эпителиальных и бактериальных клеток, 2) добавление бактерий эпителиальных клеток монослоя, и 3) обнаружение спаечного пневмококков по жизнеспособных микроорганизмов (серийного разведения и посева) или количественной ПЦР в реальном времени (КПЦР ). Это TEChnique относительно проста и не требует специального оборудования, кроме установки для культуры ткани. Анализ может быть использован для тестирования других пробиотических видов и / или потенциальных ингибиторов пневмококковой колонизации и могут быть легко изменены для решения других научных вопросов, касающихся пневмококковой приверженности и вторжения.

Introduction

Пневмококк (пневмококк) является грамположительных бактерий, которые могут вызвать инфекции в том числе пневмонии, отита и менингита. Это является основной причиной заболевания у детей в странах с низким доходом и ответственность за предполагаемые 800,000 смертей детей в возрасте до пяти в год 1. Пневмококки часто проводятся в носоглотке детей младшего возраста. Хотя это колонизация как правило, считается бессимптомно, она предшествует пневмококковой инфекции и служит резервуаром для бактерий в популяциях человека 2. Пневмококковой конъюгированной вакцинация эффективно снижает перевозку серотипов, содержащихся в вакцине. Тем не менее, существует более 90 серотипов пневмококка, и вакцинация может привести к замене серотипа, при этом ликвидация серотипов вакцины сопровождается повышением перевозки и болезней, вызываемых невакцинных серотипов 3. Кроме того, в некоторых группах высокого риска, пневмококковаяколонизация часто происходит в самом начале жизни, до введения первой дозы вакцины 4,5. В последнее время использование пробиотиков был предложен в качестве дополнительного стратегии ингибировать пневмококковой колонизации 6,7. В пробирке приверженности анализы были использованы для изучения пневмококковой присоединение 8,9. Эти анализы были адаптированы для исследования воздействия пробиотиков Lactobacillus Rhamnosus GG (LGG) на пневмококковой приверженности 10.

В дополнение к LGG и других молочнокислых бактерий, Streptococcus salivarius, общий житель полости рта, была исследована в качестве потенциального пробиотика для дыхательных путей из-за его потенциальной колонизации и способностью ингибировать пневмококков и других респираторных патогенов в пробирке 11 - 13. Протокол, представленные здесь описывает приверженности анализа, используемый для исследования эффектов S. salivarius K12 на пневмококковой приверженностик человеческому эпителиальной клеточной линии CCL-23. Перед использованием в анализе, пневмококковых изолятов были оценены для возможности придерживания, как рост и адгезия может существенно меняться в зависимости от изолятов 10,14. Кривые роста пневмококков и S. salivarius проводились для определения середины логарифмической фазы и концентрацию оценка (колониеобразующих единиц или КОЕ / мл) по оптической плотности (OD, рисунок 1). Рекомендуется изучить рост, количество жизнеспособных и ОД для каждого изолята до использования в анализе. Этот анализ может быть выполнен в любой лаборатории с помощью стандартных средств для культивирования тканей и оборудования. В этом протоколе, последствия трех доз S. salivarius вводили за 1 час перед добавлением пневмококков на адгезию S. пневмонии PMP843, серотип 19F перевозки изолят, полученный из носоглотки тампоном, рассматриваются. Существует два различных способа количественно приверженцем пневмококки представлены: покрытие на кровяной агар для сдерживаниямой жизнеспособные счету, и добыча и обнаружение пневмококковой гена Лита по кПЦР 15 ДНК. Основной протокол анализ присоединение может быть легко модифицирована, чтобы проверить различные дозы или время введения пробиотиков, а также может быть использован с другими бактериальными штаммами или видов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка эпителиальных и бактериальных клеток

  1. Таяние CCL-23 эпителиальных клеток
    1. Prewarm минимальную поддерживающую Медиа (MEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в ванну с водой 37 ° С в течение ~ 30 мин.
    2. Стерилизовать культуре ткани утвержденных кабинет биобезопасности с ультрафиолетовым светом в течение не менее 10 мин перед использованием, и протрите рабочую зону с 70% этанола. Протрите подогретое бутылку СМИ с 70% этанола и место в биобезопасности кабинета.
    3. Использование 25 мл пипетки 14 мл среды в Т-75 колбу. Поместите колбу в 37 ° С инкубатор в то время как клетки оттаивают (раздел 1.1.4).
    4. Удалить пузырек CCL-23 клеток из хранения в жидком азоте с использованием соответствующих инструкций по безопасности и тепло в водяной бане при 37 ° C до ~ 80% не размораживают.
    5. Вернуться колбу, подготовленную в разделе 1.1.3 к шкафу биобезопасности. Протрите наружную поверхность флакона CCL-23 клеток с 70% этанола и содержания передачи (1 мл) в Т-75 Колбу с использованием P1000 пипетки.
    6. Инкубировать колбу на его стороне в 37 ° С, 5% СО 2, 95% относительной влажности тканевой культуры инкубатор в течение ночи (16-20 ч).
    7. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить здоровый морфологию, извлекайте носитель, и заменить 15 мл свежих, предварительно нагретой MEM + 10% FBS.
  2. Поддержание CCL-23 эпителиальных клеток
    1. После того, как клетки ~ 80% сливной (1-2 дней), проход путем удаления носитель с помощью 25 мл пипетки и осторожно промыть клетки дважды с 8-10 мл предварительно нагретого забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) с использованием 10 мл пипетки.
    2. Удаление PBS и добавляют 1 мл стерильного 0,25% трипсин-ЭДТА (0,25% (вес / объем) трипсин, 0,1 мМ ЭДТА). Включите колбу на боку, повернуть, чтобы обеспечить трипсина охватывает сливающийся слой клеток, и инкубировать колбу в течение 2-3 мин в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора.
    3. Вернуться колбу к шкафу биобезопасности, добавить 9 мл предварительно нагретой MEM + 10% FBS, и пипетки вверх и вниз 6 -8x для ресуспендирования клеток, эжекции жидкости вниз по стенке колбы вытеснить клетки.
    4. Разделенные клетки 1:15 (1 мл + 14 мл MEM + 10% FBS) или 1:30 (0,5 мл + 14,5 мл MEM + 10% FBS), отбросить лишние клетки, и вернуть колбу на 37 ° С, 5% СО 2 инкубатор.
    5. Прохождение клетки по крайней мере, два раза перед использованием в приверженности анализа. Обычно клетки делятся каждые 3-4 дня.
  3. Посев CCL-23 эпителиальных клеток (за день до приверженности анализа, протокол 2)
    1. Разделение сливной клетки, как описано в разделах 1.2.1-1.2.3, ресуспендирования в предварительно нагретой MEM + 5% FBS (концентрация FBS опускают, чтобы уменьшить вероятность компонентов сыворотки интерферирующих в анализе). Удалить 20 мкл клеток и считать с помощью окрашивания трипановым синим и гемоцитометра.
    2. Развести клеток в предварительно нагретой MEM + 5% FBS в концентрации 1,5 х 10 5 клеток / мл в стерильную пробирку объемом 50 мл.
    3. Seed 1 мл клеток / лунку в ткани-Культура обрабатывают 24-луночный планшет.
  4. Подготовка бактерий
    Эта процедура может следовать за подготовку пневмококков и S. salivarius. Бактериальный рост медиа, как правило, выдерживают в инкубаторе 37 ° C в течение ночи, prewarm и тест на стерильность (как правило, будет появляться облачность в случае загрязнения).
    1. За два дня до приверженности анализе подряд бактерии на лошади кровяной агар (HBA) пластин и инкубировать при 35-37 ° С и 5% CO 2 в течение 18-24 часов. Овцы кровяной агар могут быть использованы в качестве альтернативы.
    2. На следующий день приготовить ночной культуры для каждого вида бактерий с помощью пипетки 10 мл Todd-Hewitt Broth 0,5% дрожжевого экстракта (RUB + YE) средней в стерильный 30 мл пробирку. Использование 10 мкл петлю, привить примерно 10-12 хорошо разделенные колонии. Кратко вихрь и инкубировать при 35-37 ° С и 5% CO 2 в течение 14-16 часов. Обратите внимание, что пневмококки будет подвергать аутолизу, если оставить слишком долго в бульонной культуры.

    2 Соблюдение Анализ:. Добавление бактерий к эпителиальных клеток монослоев

    1. Подготовка середины логарифмической бактериальных культур пневмококков и S. salivarius
      1. Внесите 10 мл нагретого THB + YE в каждом из двух стерильных 30 мл пробирок, одна с надписью пневмококков и другой S. salivarius.
      2. Для достижения середины логарифмической фазы, пневмококки требуют ~ 3 ч и S. salivarius требуют ~ 2 ч инкубации (см. рисунок 1). Начать обе культуры одновременно. Vortex (3-5 сек) в течение ночи бактериальные культуры и добавить 100 мкл пневмококки и 100 мкл С. salivarius в соответствующие пробирки.
      3. Кратко вихрь и инкубировать культур при 37 ° С в течение примерно 2 ч в течение S. salivarius и 3 часа для пневмококков.
    2. Подготовка CCL-23 клеток для приверженности анализа
      1. Использование инвертированного микроскопа, проверьте 24-луночный планшет для confluenт монослоя с здоровой морфологии клеток. Монослои должна быть> 80% сливной, без признаков клеточной слипания или цитопатических эффектов, таких как клетки округления или потери приверженности (см. рисунок 2).
      2. Извлеките носитель в каждую лунку с помощью пипетки передачи, наклоняя тарелку немного, чтобы избежать нарушения клеточный монослой.
      3. Чтобы аккуратно промыть клетки, добавить ~ 500 мкл предварительно нагретой PBS в каждую лунку с помощью серологические пипетки и снимите его с пипетки, слегка наклоняя тарелку. Откажитесь от PBS. Повторите мыть шаг один раз.
      4. Добавить 500 мкл предварительно нагретого MEM + 5% FBS в каждую лунку. Вернуться пластину 24-а в СО 2-инкубаторе при подготовке бактериальные культуры.
        Примечание: Чтобы определить точное CCL-23 количества клеток для множественности инфекции (MOI), две скважины могут быть трипсином и подсчитывали в день инфекции.

    3. Соблюдение Анализ

    1. Добавить пневмококки, чтобыБКК-23 клетки на МВД ~ 10:01. Проверьте условия, перечисленные в таблице 1 в дублирующих скважин.
      1. Измерьте оптическую плотность при 600 (ОП) 1 мл S. salivarius культуры. ОП должна быть между 0,3-0,6.
      2. Перевести 5 мл S. salivarius культура в 10 мл пробирку и центрифугируют при 1870 х г в течение 4 мин.
      3. Удалите супернатант и на основании показаний OD в разделе 3.1.1, ресуспендируйте С. salivarius в 200-1000 мкл 0,85% NaCl (конечная концентрация ~ 1,5 × 10 9 КОЕ / мл). В качестве общей рекомендации, ОП 0,375 будет ресуспендировали в 260 мкл. Подготовьте 1:10 и 1:100 разведения S. salivarius использованием 0,85% NaCl.
        Примечание: В общей сложности, три концентрации (представляющих высокий, средний и низкие дозы) из S. salivarius будут проверены в анализе. Высокая доза представляет собой отношение ~ 10 S. salivarius: 1 пневмококки, среда ~ 1 S. salivarius: 1 пневмококки, а также на низком уровне является ~~~HEAD=iobj 1 S. salivarius: 10 пневмококки.
      4. Выньте пластину 24-а из инкубатора.
      5. Из контрольных гепарин скважин, удалить 40 мкл СМИ и добавить 50 мкл гепарина (1000 ед / мл концентрации наличии) для конечной концентрации 100 Ед / мл.
      6. Добавить 10 мкл 0,85% NaCl в лунки, содержащие только CCL-23 клетки и лунки, содержащие CCL-23 клетки и пневмококки (без С. salivarius).
      7. Добавить 10 мкл в неразбавленном виде, 1:10 и 1:100 S. salivarius в соответствующие лунки.
        Примечание: С. salivarius также могут быть добавлены в то же время, как пневмококков (coaddition) или 1 ч после пневмококки (после дополнение) для изучения влияния времени пробиотика.
      8. Центрифуга 24-луночный планшет при 114 х г в течение 3 мин, чтобы способствовать бактериальной контакт с клеточном слое и инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С, 5% СО 2.
      9. Выполните серийный разбавление S. salivarius акции в 0,85% NaCl и пластины на дубликата HBAплиты для жизнеспособных микроорганизмов. Во-первых, добавить 50 мкл складе до 450 мкл 0,85% NaCl, чтобы сделать разведение 10 -1, то пульс вихрь (5 сек), рекомендации по изменению и добавить 50 мкл разведения 10 -1 450 мкл 0,85% NaCl чтобы сделать разбавление 10 -2 и так далее до 10 -7.
      10. Тарелка 100 мкл 10 -5, 10 -6, и 10 -7 разведения в двух экземплярах на HBA пластин и распространяться с помощью стерильного разбрасывателя. Выдержите HBA пластин перевернутые течение ночи при 37 ° C, 5% CO 2.
      11. К концу 1 ч инкубации, повторите разделы 3.1.1-3.1.3 для пневмококков. ОРВ должны между 0,2-0,7. Спин вниз 1 мл культуры пневмококковой и ресуспендируют осадок в 300-2,000 мкл 0,85% NaCl (на основе показаний OD) до концентрации ~ 1,5 × 10 8 КОЕ / мл. В качестве общей рекомендации, ОП 0,3 будет ресуспендировали в 500 мкл.
      12. После 1 ч инкубации с S. salivarius, добавить 10 μ; Л в неразбавленном виде пневмококки во все лунки кроме отрицательных контрольных лунок (содержащие клетки только).
      13. Центрифуга 24-луночный планшет при 114 мкг в течение 3 мин и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% CO 2 в течение 3 ч. Выполните серийный разбавление пневмококков складе в 0,85% NaCl, как описано в разделе 3.1.9 и пластинчатых разведения 10 -4, 10 -5, а 10 -6 на дубликатов HBA пластин для жизнеспособных микроорганизмов.
    2. Через 3 часа, проверить клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что монослои выглядят здоровыми (см. рисунок 2). Извлеките носитель из каждой лунки и осторожно промыть клетки 3 раза, как описано в разделе 2.2.3. с использованием другого пипетки для каждого условия. Этот шаг имеет важное значение для удаления неадгезированного пневмококки. Монослои не должны разваливаться во время стирки; это может быть подтверждено путем проверки снова под микроскопом.

    Примечание: Медиа удалены на этой стадии можно хранить при -20 ° С в течение дополнительных анализов (<EM> например, измерение уровней цитокинов).

    1. Добавить 200 мкл 0,1% дигитонин (нежный моющего средства) в каждую лунку и инкубировать 7 5% СО 2 мин при 37 ° С,.
    2. Добавить 800 мкл THB СМИ в каждую лунку. Клетки лизируют с помощью пипетки вверх и вниз, и, если необходимо, очистить скважин 3-4x с кончика пипетки, чтобы убедиться, клеточный монослой полностью удаляется. Изменение советы между лунками.
    3. Удалить содержимое из каждой лунки с использованием P1000 пипетки и передать в подписанные микроцентрифужные пробирки.

    4. Количественная оценка Приверженец пневмококков

    Адгезивная пневмококки может быть определена количественно путем определения жизнеспособных микроорганизмов (серийное разведение и покрытие на кровяном агаре) или с помощью количественной ПЦР в реальном времени.

    1. Метод Количество жизнеспособных
      Этот метод должен быть выполнен сразу после шага 3.5 в приверженности анализа.
      1. Для каждого анализа скважины, подготовить серийные разведения образцов, собранных вшаг 3,5 из приверженности анализе путем добавления 50 мкл образцов до 450 мкл 0,85% NaCl, пульс встряхивания и серийно разбавления как описано в разделе 3.1.9 до разведения 10 -6.
      2. Тарелка 100 мкл 10 -3, 10 -4, 10 -5, а 10 -6 разведения в двух экземплярах на кровяной агар, смазать стерильным разбрасыватель, и инкубировать перевернутые тарелки в течение ночи при 37 ° С, 5% СО 2. Обратите внимание, что лунки, содержащие CCL-23 клетки сами по себе не должны содержать любые бактерии и могут быть покрыты аккуратный (100 мкл неразбавленном) в качестве контроля стерильности.
      3. На следующий день, определить пневмококковой инокулята подсчетом колонии на соответствующих пластин разбавления (содержащие 30-300 колоний), подготовленной в разделе 3.1.13 от приверженности анализа. Вычислить КОЕ / мл в инокулята с использованием усредненное значение из двух пластин. Точно так же, определить S. salivarius посевной путем подсчета колоний на пластинах, подготовленныхв разделе 3.1.10.
        Примечание: Плиты должны содержать только пневмококки; присутствие других видов показывает, что анализ был загрязнен и результаты недействительны.
      4. Для определения пневмококковых уровни приверженности, рассчитывать соответствующий разбавления пластину (содержащий 30-300 пневмококковых колонии) для каждого образца, полученного в разделе 4.1.1. Обратите внимание, что С. salivarius колонии будет небольшим и белый, в то время как пневмококки будет ровной, и зеленовато из-за α-гемолиз, как показано на рисунке 3. Для расчета пневмококковой приверженность, нормализуют количество клейкого пневмококков из условия б. CCL-23 ячеек + пневмококки до 100%, и сравнить приверженцем пневмококки от других условий, к этому условию.
    2. Метод КПЦР
      Образцы, собранные в приверженности Пробирной шаг 3.5 не могут храниться при -20 ° С до выделения ДНК. Извлечение ДНК проводили с использованием коммерческого набора и описано в разделах 4.2.1-4.2.9, а также КПЦРговорят в разделах 4.2.10-4.2.20.
      1. Подготовка Ферментативный буфера для лизиса (50 мМ фосфатный буфер рН 6,7, содержащий 1 мг / мл лизоцима, 0,075 мг / мл мутанолизин и 2 мг / мл протеиназы K). Следующий рецепт может быть использован сделать 10 мл (достаточно для 50 экстракции). Ферментативный лизирующего буфера должен быть свежеприготовленным перед использованием.

        7,25 мл 50 мМ раствора фосфатного буфера (рН 6,7)
        1,00 мл 10 мг / мл лизоцима материал для окончательного [1 мг / мл]
        0,75 мл 1 мг / мл мутанолизин запас для окончательного [0,075 мг / мл]
        1,00 мл 20 мг / мл протеиназы К запас для окончательного [2 мг / мл]
      2. Оттепель образцы на льду или при 4 ° С. Vortex и передачи 100 мкл аликвоты каждого образца в подписанные микроцентрифужные пробирки. Вернуться оригинальные образцы обратно в -20 ° C морозильник.
      3. Центрифуга образцов при 6700 х г в течение 10 мин.
      4. Снимите и выбросьте супернатант. Добавить 200 мкл ферментного буфера для лизиса к осадку и вихря для ресуспендирования. Incubели образцов при 56 ° С в течение 30 мин. Центрифуга кратко (5 сек) при 6700 х г для сбора жидкости в нижней части трубы.
      5. Добавить 10 мкл 20% SDS, чтобы завершить лизиса клеток и осторожно перемешать при комнатной температуре в течение 2 мин.
      6. Добавить 4 мкл РНКазы А (100 мг / мл маточного) и осторожно перемешать (на качалке или путем обращения трубки) при комнатной температуре в течение 2 мин.
      7. Добавить 200 мкл буфера AL (от комплекта) и вихрь на 15 сек. Инкубируйте образцы при 70 ° С в течение 10 мин. Центрифуга кратко (5 сек) при 6700 х г для сбора жидкости в нижней части трубы.
      8. Добавить 200 мкл 100% этанола и вихрь в течение 15 сек. Кратко Спин собрать жидкость в нижней части трубки, а затем перенести смесь (в том числе любой осадка) в колонну спина (в 2 сбора мл трубки), не замочив обод. Выполните шаги мыть в соответствии протокола производителя (не показан).
      9. Для элюирования ДНК, колонки передать в меченым пробирке, добавить 50 мкл буфера АЕ (FRом комплект), и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин. Центрифуга на 4300 мкг в течение 1 мин. Повторите один раз для конечного объема элюции 100 мкл. ДНК можно хранить при -20 ° С до использования.
      10. Для выполнения КПЦР, стерилизовать капюшоны с ультрафиолетовым светом в течение 15 мин до начала. Подготовка 96-луночный планшет карту лист для записи также местоположения для каждого образца рекомендуется.
      11. Подготовка стандартную кривую с использованием 10 нг / мкл запас геномной пневмококковой ДНК (извлеченной из эталонного штамма АТСС 6305).
        1. Оттепель пневмококковой фондовый ДНК и спином вниз кратко (5 сек) в настольной центрифуге.
        2. Выполните 1:10 серийные разведения в 6 prelabeled микроцентрифужные пробирки, добавив 3 мкл ДНК 27 мкл нуклеазы без H 2 O, изменение советы и вихревание между каждого разведения. Окончательный серийные разведения состоит из 6 трубок: 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 и 0,00001 нг / мкл.
          Примечание: Это можно хранить при температуре 4 ° С в течение одной недели.
      12. Подгоэ Лита Mastermix следующим в стерильной 15 мл коническую трубку в стерильной ПЦР капотом. Оттепель компоненты на льду и вихря непосредственно перед использованием. и др..15 и показаны в списке материалов.
      13. Vortex и нагрузка 23 мкл / лунку в Лита смешать в соответствующие лунки. См. пластины карте.
      14. Транспорт пластина с матричной сложения область (предпочтительно стерильный кабинет в отдельной комнате) для загрузки образца.
      15. Используйте P2 пипетку, чтобы загрузить образцы, изменяя советы для каждой скважины. Все образцы выполняются в двух экземплярах. См. пластины карте для расположения.
      16. Для стандартных скважин кривой, добавить 1 мкл / лунку соответствующего разбавления стандартной ДНК кривой плюс 1 мкл / лунку H 2 O, чтобы довести конечный объем до 25 мкл.Для никакого контроля шаблон скважин, добавить 2 мкл H 2 O.
      17. Добавить 2 мкл / лунку образца ДНК в соответствующие лунки.
      18. Закройте все скважины в использовании. Убедитесь в том, шапки закрыты плотно. Быстро вращать пластинку ПЦР (5 сек) Перед загрузкой пластину в ПЦР в реальном времени машины.
      19. Нагрузка пластина в ПЦР машины и выполнения КПЦР в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем станка. Следующие гидролиза зонда условия велосипедные рекомендуется:
        20. компонент на реакцию х 102 (полный пластинчатый)
        Лита F 0,25 мкл 10 мкМ наличии 25,5 мкл
        Лита R 0,25 мкл 10 мкМ наличии 25,5 мкл
        Лита зонд 0,5 мкл 10 мкМ складе 51 мкл
        H 2 O 9.5 мкл 969 мкл
        Мастер микс 12.5 мкл 1275 мкл
        Конечный объем 23 мкл 2346 мкл
        Шаг 1 (1x): 3 мин при 95 ° С
        Этап 2 (40x): 20 сек при 95 ° С
        20 сек при 60 ° С
      20. Сбор данных и количественной оценки пневмококковой ДНК с использованием стандартной кривой. Бактериальные нагрузки рассчитываются, как описано выше 17, оценивая, что 1 мкг геномной ДНК эквивалентно 447,4 клетки, и сообщается как КОЕ / мл (при условии, опе генома за КОЕ, и один экземпляр Лита на геном; см. рисунок 4). Для успешного анализа, значение R 2 должен быть ≥ 0,98, а все положительные результаты в пределах диапазона стандартной кривой (CT значения меньше, чем получено для 0,00001 нг / мкл стандартной точки кривой считаются фон / Лита отрицательным).
        Примечание: В некоторых систем реального времени ПЦР оснащены программного обеспечения для анализа, который может использоваться для построения стандартных кривых и вычисления неизвестных. В противном случае, эти расчеты могут быть выполнены в Excel или аналогичных программ. Пример стандартной кривой показан на рисунке 4.
      21. Для расчета пневмококковой приверженность, нормализуют количество клейкого пневмококков из условия б. CCL-23 ячеек + пневмококки до 100%, и сравнить приверженцем пневмококки от других условий, к этому условию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты типичного эксперимента, в котором пневмококки (S.pneumoniae, PMP843, колонизации 19F изолят) добавляли к CCL-23 клеток 1 час после добавления S. salivarius, и пневмококковой соблюдение количественно определяли как количество жизнеспособных Лита и количественной ПЦР приведены в таблице 2. Результаты были совместимы между двумя методами, как для абсолютного числа бактерий (представленный в виде КОЕ / мл) и соблюдение%, нормированной к числу из приверженцем пневмококки в лунках, содержащих пневмококки одиночку. Гепарин использовали в качестве контроля, как известно, ингибируют присоединение пневмококковой и, следовательно, уменьшить прилипание в пневмококков + гепарин состоянии (обычно <40% по сравнению с только пневмококков) указывает на успешное анализа. С. salivarius ингибирует пневмококковой приверженность в зависимости от дозы, как показано в таблице 2, где высокая концентрация S. salivarius (приблизительнолы 10 С. salivarius: 1 пневмококки) приводило к самой низкой пневмококковой присоединения.

На рисунке 5 показана приверженность пневмококков к CCL-23 клеток, когда С. salivarius добавляется 1 час до пневмококков (preaddition), одновременно (coaddition), или через 1 час после пневмококков (пост-дополнение). С. salivarius является более эффективным в подавлении пневмококковой соблюдение при добавлении до пневмококков, а как на высоких и средних доз S. salivarius значительно снижается пневмококковой приверженность в preaddition анализа (рис. 5А), в то время как только высокой дозы S. salivarius ингибирует пневмококковой приверженность в coaddition и пост-сложения анализов (рис. 5B и 5C).

Данные, приведенные в таблице 2 и 4 и 5 были получены с использованием более ранней версии праймеров Лита КПЦР и зонд 17. Нынешний протокол описывает обновленный КПЦР анализа.

Рисунок 1
Рисунок 1. Характерные кривые роста S. пневмонии PMP843 (А) и С. salivarius K12 (B). Для каждого вида КОЕ / мл, как это определено путем подсчета жизнеспособных показано на черного (слева ось у), и оптическая плотность (OD) при 600 нм показана серым цветом (правой оси ординат). Середина войти фазу оценивается жизнеспособного подсчета быть 3 ч для S. пневмонии PMP843 и 2 часа для S. salivarius K12. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51069/51069fig2.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 2. Примеры здоровых CCL-23 клеток и CCL-23 клеток с цитопатических эффектов (CPE). А) Пример здорового, сливной монослоя CCL-23 клеток. B) CCL-23 клеток с цитопатических эффектов. Примечание округление клеток, яркие внутриклеточных регионов и областей нарушается монослоя, где клетки поднятой от тарелки. Изображения были приняты с использованием инвертированного оптического микроскопа в 200-кратное увеличение. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3
Рисунок 3. С. salivarius и пневмококковых колонии на агаре крови лошади. С. salivarius колонии маленькие и белый, как показано белыйстрелки и литера А. пневмококковой (С. пневмонии) колонии, как правило, больше, льстить, и зеленоватого цвета, как указано в белой стрелкой и буквой В. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 4
Рисунок 4. П р С. пневмонии стандартная кривая для количественной ПЦР. геномные расчеты ДНК показаны наряду со значениями Ct (* средняя дубликатов стандартных скважин кривой от представителя КПЦР анализа), и как следствие этого стандартного кривой, уравнение, и R 2 значения, показанного на графике. Кликните здесь, чтобы просмотреть увеличенное изображение .

Рисунок 5 Содержание-шир = "6 дюймов" Первоначально "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" ширина = "600" />
Рисунок 5. Влияние S. salivarius на пневмококковой приверженности CCL-23 клеток пневмококковой следование CCL-23 монослоев клеток, когда клетки инкубировали с пневмококков в одиночку. (Pnc; нормализуется до 100%), с пневмококков и 100 ед / мл гепарина (гепарин), или с пневмококков и С. salivarius добавлен в соотношении ~ 10: S. salivarius: 1 пневмококки (высокий), ~ 1 С. salivarius: 1 пневмококки (средняя), или ~ 1 С. salivarius:. 10 пневмококки (низкий) С. salivarius был добавлен 1 час до (а), в то же время, что и (B), или 1 час после пневмококков (C). N ≥ 3, * означает Р <0,05 по сравнению с только пневмококков (т критерий Стьюдента). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

"FO: держать-together.within-страницу =" всегда ">

Группа Анализ состояние Примечания
CCL-23 клетки сами по себе
B CCL-23 ячеек + пневмококки
С CCL-23 ячеек + пневмококки + гепарин Гепарин блоки пневмококковой присоединение к клеточной поверхности glycosylaminoglycans 16 и используется в качестве контроля
D CCL-23 ячеек + пневмококки + S. salivarius [высокие] Примерно 1 пневмококк: 10 С. salivarius
E CCL-23 ячеек + пневмококки + S. salivarius [мед] Примерно 1 пневмококк: 1 С. salivarius
F CCL-23 ячеек + пневмококки + S. salivarius [низкий] Примерно 10 пневмококк: 1 С. salivarius


Таблица 1. Условия испытания в пневмококковой приверженности анализа. Шесть основных условия анализа описаны здесь.

6
Анализ состояние * КОЕ / мл Pnc (КПЦР) % Приверженность (КПЦР) КОЕ / мл Pnc (количество жизнеспособных микроорганизмов) % Приверженность (количество жизнеспособных микроорганизмов)
Одна Pnc 1,1 х 10 7 100 9.1 х 10 6 100
Pnc + гепарин 1,5 х 10 6 14 7,6 х 10 5 8
Pnc + Сал [высокие] 6,1 х 10 5 6 3,2 х 10 5 4
Pnc + Сал [мед] 3,6 х 10 6 33 2,7 х 10 6 29
Pnc + Сал 9,8 х 10 6 92 90

Таблица 2: пневмококковой соблюдение CCL-23 клеток после добавления S. salivarius как определено Лита кПЦР и метода количество жизнеспособных микроорганизмов * Pnc = пневмококки.; Сал = С. salivarius; [Высокой] = примерно 10 SAL: 1 PNC; [Мед] = примерно 1 Сал: 1 Pnc; [Низкий] = приблизительно 1 SAL: 10 PNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критическая часть этого анализа, добавив соответствующие концентрации S. salivarius и пневмококки в разделах 3.1.7 и 3.1.12. Концентрации оцениваются с использованием показаний OD но точная посевной не определены, пока пластины не подсчитываются на следующий день. По этой причине, мы рекомендуем выполнять кривые роста для измерения OD и жизнеспособных микроорганизмов (КОЕ / мл) в течение долгого времени для всех бактериальных штаммов, используемых в анализе для идентификации фазы середине журнала и помочь в оценке концентрации по ОП. Кроме того, пневмококковых штаммов могут существенно отличаться по своим свойствам приверженности. Штаммы с хорошей адгезией (> 10% посевного материала прилипать к эпителиальным клеткам после 3-часовой инкубации) рекомендуются для анализов следственных способность пробиотиков ингибировать присоединение пневмококковой. Даже тогда, когда выполняется опытным оператором, уровни приверженности может варьироваться анализа к анализу, о чем свидетельствует относительно больших баров ошибках показано на рисунке 5. ДляПо этой причине мы рекомендуем как минимум три повторов для каждого эксперимента, с повторяющимися скважин для каждого условия анализа. Похожие изменчивость было сообщено в приверженности анализов с помощью кишечной палочки 18. В этом протоколе клетки инкубировали в течение 3 ч с последующим добавлением пневмококков. Инкубационный период может быть сокращен, если время приверженность курс эксперименты проводятся и показывают, что большинство бактерий придерживаться в течение первого часа инкубации.

Этот протокол представляет два метода для количественного пневмококковой приверженность, КПЦР и жизнеспособной растет. Оба метода пригодны, и выбор зависит от предпочтений и доступны лабораторного оборудования оператора (например, доступ к ПЦР в реальном времени машины). Количественное по жизнеспособного подсчета является недорогой метод, который не требует дополнительных реагентов или в режиме реального времени ПЦР машины. Тем не менее, он использует много тарелок (обычно 80 пластины для анализа 12-а), и должны производиться немедленноелы в конце анализа и подсчета колоний пневмококковых может быть трудно на пластинах, содержащих большое количество S. salivarius. Количественное КПЦР дороже и требует длительного стадии экстракции ДНК, но образцы можно хранить в замороженном виде и обрабатываются в партиях, повышения эффективности. Извлеченный ДНК также могут быть использованы для других целей, таких как обнаружение КПЦР адгезивных S. salivarius. Если расследование S. salivarius соблюдение, рекомендуется включить скважин с CCL-23 клеток плюс S. salivarius (без пневмококков) и скважины с CCL-23 клеток плюс S. salivarius и гепарин также дополнительные элементы управления.

Основной анализ также может быть приспособлен, чтобы исследовать другие научные аспекты колонизации. Например, эффект пробиотиков на продукцию цитокинов может быть оценена путем хранения и анализируя клеток супернатантов. Анализ также могут быть модифицированы для изучения бактериальной инвазии, а не присоединения к нему техинкубации клеток с клеточной мембраны непроницаемых антибиотиков убивать внеклеточные бактерии до уборки и лизиса клеток. Как описано здесь, анализ не делает различия между приверженцем и инвазивного (интернализованной) пневмококков. Тем не менее, предыдущие исследования показали уровни интернализованной пневмококков быть очень маленьким (обычно ≤ 0,01% посевного материала) 10 поэтому для большинства изолятов (в том числе PMP843), подавляющее большинство клеточно-ассоциированного пневмококков привержены, а не усвоены. Дополнительные приложения включают тестирования других пробиотических видов для способности ингибировать колонизации, и / или глядя на мутантных штаммов бактерий, чтобы исследовать роль специфических генов, представляющих интерес.

Очевидным ограничением этого анализа в пробирке в том, что она не включает установленную эпителий, клетки иммунной системы, нормальную флору, или другие факторы, которые, вероятно, влияют пневмококковой колонизации в естественных условиях. Чтобы в полной мере оценить, насколько пробиотики кулоновскоесть быть полезным в предотвращении патогена колонизации в дыхательных путях, в естественных условиях исследования с использованием животных моделей и клинические испытания на человеке являются оправданными. Тем не менее, в пробирке приверженности анализы служить полезным экране для идентификации пробиотики с потенциалом для подавления пневмококковой приверженность и могут предоставить информацию о льготных стратегий дозирования, а также предоставление экспериментальную модель, которая может использоваться для механистических исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана финансирование из Мердока Детский научно-исследовательского института и Оперативной программы Инфраструктура поддержки викторианской правительства.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

Tags

Иммунологии выпуск 86 грам-положительные Бактериальные инфекции пневмония Бактериальные легочных заболеваний Инфекции дыхательных путей, Соблюдение колонизация пробиотики,
Исследование действия пробиотиков на пневмококковой колонизации Использование<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Соблюдение Анализ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter