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Immunology and Infection

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

En ensayos in vitro de adherencia se pueden utilizar para estudiar la unión de Streptococcus pneumoniae a monocapas de células epiteliales y para investigar las posibles intervenciones, tales como el uso de los probióticos para la inhibición de la colonización neumocócica.

Abstract

La adherencia de Streptococcus pneumoniae (neumococo) para el revestimiento epitelial de la nasofaringe puede dar lugar a la colonización y se considera un requisito previo para las infecciones neumocócicas tales como la neumonía y la otitis media. In vitro ensayos de adherencia se pueden utilizar para estudiar la unión de los neumococos a células epiteliales monocapas y para investigar las posibles intervenciones, tales como el uso de los probióticos, para inhibir la colonización neumocócica. El protocolo descrito aquí se utiliza para investigar los efectos de la Streptococcus salivarius probiótico en la adherencia de los neumococos a la línea celular epitelial humana CCL-23 (a veces referido como células HEp-2). El ensayo implica tres pasos principales: 1) Preparación de células epiteliales y bacterianas, 2) adición de las bacterias a las monocapas de células epiteliales, y 3) detección de neumococos adherente por recuentos de viables (dilución en serie y chapado) o cuantitativa-PCR en tiempo real (qPCR ). Esta technique es relativamente sencillo y no requiere equipo especializado que no sea una configuración de cultivo de tejidos. El ensayo se puede usar para probar otras especies probióticas y / o inhibidores potenciales de la colonización neumocócica y se puede modificar fácilmente para hacer frente a otras cuestiones científicas con respecto a la adherencia neumocócica y la invasión.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es una bacteria Gram positiva que puede causar infecciones como la neumonía, otitis media y meningitis. Es una causa importante de enfermedad en niños en los países de bajos ingresos y responsable de un estimado de 800.000 muertes de niños menores de cinco años anualmente 1. Los neumococos se realizan con frecuencia en la nasofaringe de los niños pequeños. Aunque esta colonización se considera generalmente asintomática, que precede a la infección neumocócica y sirve como un depósito para las bacterias en las poblaciones humanas 2. La vacunación antineumocócica conjugada reduce efectivamente el transporte de los serotipos contenidos en la vacuna. Sin embargo, existen más de 90 serotipos de neumococo, y la vacunación puede conducir a la sustitución de serotipos, por lo que la eliminación de los serotipos de la vacuna es seguida por un aumento en el transporte y la enfermedad causada por los serotipos no vacunales 3. También, en algunas poblaciones de alto riesgo, el neumococola colonización menudo se produce muy temprano en la vida, antes de la administración de la primera dosis de vacuna de 4,5. Recientemente, el uso de probióticos ha sido propuesto como una estrategia adicional para inhibir la colonización 6,7 neumocócica. In vitro ensayos de adherencia se han utilizado para examinar la adherencia neumocócica 8,9. Estos ensayos han sido adaptados para investigar el impacto del probiótico Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) en la adherencia neumocócica 10.

Además de LGG y otras bacterias del ácido láctico, Streptococcus salivarius, un residente común de la cavidad oral, se ha investigado como un probiótico potencial para las vías respiratorias debido a su potencial de colonización y la capacidad para inhibir los neumococos y otros patógenos respiratorios in vitro 11 - 13. El protocolo presentado aquí describe un ensayo de adherencia utilizado para investigar los efectos de S. salivarius K12 en la adherencia neumocócicaa la línea celular epitelial humana CCL-23. Antes de su uso en el ensayo, los aislamientos de neumococos se evaluaron para las capacidades de adherencia, ya que el crecimiento y las propiedades de adherencia pueden variar sustancialmente entre los aislados 10,14. Curvas de crecimiento de neumococos y S. salivarius se realizaron para determinar la fase semilogarítmica y la concentración de estimación (unidades formadoras de colonias o CFU / ml) por la densidad óptica (OD, Figura 1). Se recomienda examinar el crecimiento por recuento de viables y la OD para cada aislamiento antes de su uso en el ensayo. Este ensayo se puede realizar en cualquier laboratorio con instalaciones de cultivo de tejidos estándar y los equipos. En este protocolo, los efectos de tres dosis de S. salivarius administrada 1 hora antes de la adición de neumococos en la adherencia de S. pneumoniae PMP843, un serotipo 19F carro aislado derivado de un exudado nasofaríngeo, se examinan. Se presentan dos formas diferentes para cuantificar los neumococos adherente: placas en agar sangre para disuadirmina de recuentos viables, y la extracción de ADN y la detección del gen lytA neumocócica por qPCR 15. El protocolo básico de ensayo de adherencia se puede modificar fácilmente para probar diferentes dosis o tiempo de administración de probióticos y también se puede utilizar con otras cepas o especies bacterianas.

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Protocol

1. Preparación de las células epiteliales y bacterianas

  1. Descongelación de CCL-23 células epiteliales
    1. Precalentar mínima Medio Esencial (MEM) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) en un baño de agua a 37 ° C durante ~ 30 min.
    2. Esterilizar la cabina de bioseguridad cultura aprobados tejido con luz UV durante al menos 10 minutos antes de su uso, y limpiar el área de trabajo con etanol al 70%. Limpie la botella medios calentado con etanol al 70% y el lugar en el gabinete de bioseguridad.
    3. Usando una pipeta de 25 ml, transferir 14 ml de medio en un matraz T-75. Coloque el frasco en 37 ° C incubadora mientras que las células están descongelando (sección 1.1.4).
    4. Retire un frasco de CCL-23 células de almacenamiento de nitrógeno líquido utilizando las medidas de seguridad apropiadas y caliente en un baño de agua a 37 ° C hasta ~ 80% descongelado.
    5. Regrese el frasco preparado en la sección 1.1.3 de la cabina de bioseguridad. Limpiar la superficie exterior del vial de células CCL-23 con etanol al 70% y el contenido de transferencia (1 ml) en el T-75 Matraz utilizando una pipeta P1000.
    6. Incubar el matraz sobre su lado en un 37 ° C, 5% de CO 2, 95% de humedad relativa cultivo de tejidos incubadora durante la noche (16-20 h).
    7. Compruebe las células bajo un microscopio para confirmar una morfología saludable, eliminar el medio, y reemplazar con 15 ml fresco, precalentado MEM + 10% de FBS.
  2. Mantenimiento de CCL-23 células epiteliales
    1. Una vez que las células son ~ 80% confluente (1-2 días), el paso por la eliminación de los medios de comunicación usando una pipeta de 25 ml y lavar suavemente las células dos veces con 8-10 ml precalentado salina tamponada con fosfato (PBS) usando una pipeta de 10 ml.
    2. Retirar PBS y añadir 1 ml de estéril 0,25% de tripsina-EDTA (0,25% (w / v) de tripsina, EDTA 0,1 mM). Gire frasco en su lado, girar para asegurar tripsina cubre la capa confluente de células, y se incuba el matraz durante 2-3 minutos en el 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
    3. Frasco de Regreso a la cabina de bioseguridad, añadir 9 ml precalentado MEM + 10% de SFB, y la pipeta hacia arriba y abajo 6 -8x para resuspender las células, expulsar líquido por el lado del matraz para desalojar las células.
    4. Dividir celdas uno y quince minutos (1 ml + 14 ml de MEM + 10% de FBS) o 1:30 (0,5 ml + 14,5 ml de MEM + 10% de FBS), desechar el exceso de células, y el frasco de volver a la 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
    5. El paso de las células por lo menos dos veces antes de su uso en el ensayo de adherencia. Típicamente las células se dividen cada 3-4 días.
  3. Siembra de CCL-23 células epiteliales (un día antes de la adherencia ensayo, Protocolo 2)
    1. Dividir las células confluentes como se describe en las secciones 1.2.1-1.2.3, resuspender en MEM precalentado + 5% de FBS (concentración de FBS se redujo a reducir la probabilidad de los componentes del suero que interfieren en el ensayo). Retire 20 l de células y contar mediante la tinción de azul de tripano y un hemocitómetro.
    2. Diluir las células en MEM precalentado + 5% de FBS a una concentración de 1,5 x 10 5 células / ml en un tubo estéril de 50 ml.
    3. Semilla de 1 ml de células / pocillo en un tejidoCultura tratada placa de 24 pocillos.
  4. Preparación de bacterias
    Este procedimiento se puede seguir para la preparación de los neumococos y S. salivarius. Medio de crecimiento bacteriano se mantiene típicamente en una incubadora a 37 ° C durante la noche para precalentamiento y prueba de esterilidad (generalmente un aspecto turbio si está contaminada).
    1. Dos días previos a la adhesión de ensayo, bacterias racha en caballo de agar sangre (HBA) placas e incubar a 35-37 ° C y 5% de CO2 durante 18 a 24 horas. De agar de sangre de oveja se puede utilizar como una alternativa.
    2. El día siguiente, preparar un cultivo de una noche para cada especie bacteriana pipeteando 10 ml de caldo Todd-Hewitt con 0,5% de extracto de levadura (THB + YE) medio en un tubo estéril de 30 ml. El uso de un bucle de 10 l, inocular aproximadamente 10-12 colonias bien separadas. Agitar brevemente e incubar a 35-37 ° C y 5% de CO2 durante 14 a 16 horas. Tenga en cuenta que los neumococos se autolizan si se deja demasiado tiempo en caldo de cultivo.

    2 La adhesión de ensayo:. Adición de bacterias a las monocapas de células epiteliales

    1. Preparación de mediados de registro de cultivos bacterianos de neumococos y S. salivarius
      1. Pipetear 10 ml de precalentado THB + Id por cada uno de dos tubos de 30 ml estériles, uno neumococos marcado y el otro S. salivarius.
      2. Para llegar a la fase semilogarítmica, neumococos requiere ~ 3 horas y S. salivarius requiere ~ 2 h de incubación (ver Figura 1). Iniciar ambas culturas al mismo tiempo. Vortex (3-5 segundos) cultivos bacterianos durante la noche y se añaden 100 l 100 l neumococos y S. salivarius en tubos correspondientes.
      3. Agitar brevemente e incubar los cultivos a 37 º C durante aproximadamente 2 horas para S. salivarius y 3 horas para los neumococos.
    2. Preparación de CCL-23 células para ensayo de adherencia
      1. Usando un microscopio invertido, compruebe la placa de 24 pocillos para confluent monocapas con morfología de células sanas. Las monocapas deben ser> 80% de confluencia, sin evidencia de aglutinación celular o efectos citopáticos tales como el redondeo celular o pérdida de adhesión (véase la Figura 2).
      2. Retire los medios de comunicación en cada pocillo utilizando una pipeta de transferencia, inclinando la placa ligeramente para evitar molestar a la monocapa celular.
      3. Para lavar suavemente las células, añadir ~ 500 l de PBS precalentado en cada pocillo con una pipeta serológica y retírela con una pipeta de transferencia, inclinando la placa ligeramente. Deseche la PBS. Repita el paso de lavado una vez.
      4. Añadir 500 l de MEM precalentado + 5% de FBS a cada pocillo. Devuelva la placa de 24 pocillos a la incubadora de CO 2, mientras que la preparación de los cultivos bacterianos.
        Nota: Para determinar exactamente el número de células CCL-23 para la multiplicidad de infección (MOI), dos pozos pueden tripsina y se contaron en el día de la infección.

    3. Ensayo de adherencia

    1. Añadir a neumococoslas células CCL-23 en un ~ 10:01 MOI. Prueba de las condiciones que se enumeran en la Tabla 1 en pocillos duplicados.
      1. Medir la densidad óptica a A 600 (DO) de 1 ml de S. cultura salivarius. DO debe estar entre 0,3-0,6.
      2. Transfiera 5 ml de S. cultura salivarius en un tubo de 10 ml y centrifugar a 1870 xg durante 4 min.
      3. Descartar el sobrenadante y se basa en la lectura de DO en la sección 3.1.1, resuspender S. salivarius en 200-1.000 l de 0,85% de NaCl (concentración final 1,5 x 10 ~ 9 UFC / ml). Como pauta general, un diámetro exterior de 0.375 se volvió a suspender en 260 l. Preparar 01:10 y 1:100 diluciones de S. salivarius utilizando 0,85% de NaCl.
        Nota: En total, tres concentraciones (altos, medios y dosis bajas) de S. salivarius se pondrá a prueba en el ensayo. La alta dosis es una proporción de ~ 10 S. salivarius: 1 neumococos, el medio es ~ 1 S. salivarius: 1 neumococos, y el bajo es ~ 1 S. salivarius: 10 neumococos.
      4. Saque la placa de 24 pocillos de la incubadora.
      5. A partir de los pocillos de control de la heparina, eliminar 40 l de los medios de comunicación y añadir 50 l de heparina (1.000 U / ml de concentración de stock) para una concentración final de 100 U / ml.
      6. Añadir 10 l de NaCl al 0,85% de los pozos que contienen CCL-23 células únicas y pozos que contienen células CCL-23 y los neumococos (sin S. salivarius).
      7. Añadir 10 ul de sin diluir, 1:10 y 1:100 de S. salivarius a los pocillos respectivos.
        Nota: S. salivarius también se puede añadir al mismo tiempo que los neumococos (coaddition) o 1 h después de neumococos (después de la adición) para examinar el efecto del tiempo de la administración de probióticos.
      8. Centrifugar la placa de 24 pocillos a 114 xg durante 3 min para promover el contacto bacteriano con la capa de células y se incuba durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2.
      9. Realizar dilución en serie de la S. salivarius acciones en 0,85% de NaCl y placa en duplicado HBAplacas para los recuentos de viables. En primer lugar, añadir 50 l de acciones a 450 l de NaCl al 0,85% para realizar una dilución 10 -1, entonces pulso vórtice (5 seg), Puntas de cambio, y añadir 50 l de la dilución 10 -1 a 450 l de NaCl al 0,85% para realizar una dilución 10 -2 y así sucesivamente hasta 10 -7.
      10. Placa 100 l de la 10 -5, 10 -6 y 10 -7 diluciones por duplicado en placas HBA y untadas con un esparcidor estéril. Incubar las placas HBA invertidas durante una noche a 37 ° C, 5% de CO 2.
      11. Hacia el final de la incubación de 1 hora, repita las secciones 3.1.1-3.1.3 por neumococos. OD debe ser de entre 0,2 a 0,7. Centrifugar 1 ml de cultivo neumocócica y resuspender el precipitado en 300-2,000 l de NaCl al 0,85% (basado en la lectura de DO) a una concentración de ~ 1,5 x 10 8 UFC / ml. Como una guía general, una DO de 0,3 se resuspendió en 500 l.
      12. Después de 1 h de incubación con S. salivarius, añadir 10 μ; L neumococos no diluida a todos los pocillos excepto pocillos de control negativo (que contienen sólo células).
      13. Centrifugar la placa de 24 pocillos a 114 xg durante 3 min y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 3 horas. Realizar diluciones seriadas de las acciones neumococos en NaCl al 0,85% como se describe en la sección 3.1.9 y las diluciones de la placa 10 -4, 10 -5 y 10 -6 en placas HBA duplicados para los recuentos de viables.
    2. Después de 3 horas, compruebe las células bajo el microscopio para asegurar que las monocapas de aspecto saludable (ver Figura 2). Retire el papel de cada pocillo y suavemente se lavan las células 3 veces como se describe en la sección 2.2.3. usando una pipeta diferente para cada condición. Este paso es esencial para eliminar los neumococos no adherente. Las monocapas no deben romperse durante el proceso de lavado; esto puede ser confirmado mediante la comprobación de nuevo bajo un microscopio.

    Nota: Medios eliminado durante este paso puede ser almacenado a -20 ° C para análisis adicionales (<em> por ejemplo, la medición de los niveles de citoquinas).

    1. Añadir 200 l de 0,1% de digitonina (un detergente suave) a cada pocillo y se incuba durante 7 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
    2. Añadir 800 l de los medios de comunicación THB a cada pocillo. Células Lyse por la pipeta hacia arriba y hacia abajo, y si es necesario, raspe pozos 3-4x con la punta de la pipeta para asegurarse de la monocapa celular se elimina por completo. Cambie consejos entre los pozos.
    3. Retire el contenido de cada pocillo utilizando una pipeta P1000 y transferir a tubos de microcentrífuga etiquetados.

    4. Cuantificación de Adherente Los neumococos

    Neumococos adherente se puede cuantificar mediante la determinación de recuentos viables (dilución en serie y en placas sobre agar sangre) o por cuantitativa-PCR en tiempo real.

    1. Método de conteo Viable
      Este método se debe realizar inmediatamente después de la etapa 3.5 del ensayo de adherencia.
      1. Para cada pocillo de ensayo, preparar diluciones seriadas de las muestras recogidas enpaso 3.5 del ensayo de adherencia mediante la adición de 50 l de muestras de 450 l de NaCl al 0,85%, vórtex pulso, y la dilución en serie, como se describe en la sección 3.1.9 hasta la dilución 10 -6.
      2. Placa 100 l de la 10 -3, 10 -4, 10 -5, y 10 -6 diluciones por duplicado en agar sangre, se extendió con una espátula estéril, y se incuban las placas invertidas durante una noche a 37 ° C, 5% de CO 2. Tenga en cuenta que los pocillos que contienen las células CCL-23 por sí sola no deben contener ningún bacterias y puede ser plateado puro (100 l sin diluir) como un control de esterilidad.
      3. El día siguiente, determinar la inóculos neumocócica por recuento de las colonias en las placas de dilución apropiados (que contienen 30-300 colonias) preparados en la sección 3.1.13 del ensayo de adherencia. Calcular la UFC / ml de los inóculos usando el valor promediado a partir de dos placas. Del mismo modo, determinar la S. salivarius inóculos por recuento de las colonias en las placas preparadasen la sección 3.1.10.
        Nota: Las placas deben contener sólo neumococos; la presencia de otras especies indica que el ensayo estaba contaminado y los resultados no son válidos.
      4. Para determinar los niveles de adherencia de neumococo, cuente la placa de dilución apropiada (que contiene 30 a 300 colonias neumocócicas) para cada muestra preparada en el apartado 4.1.1. Tenga en cuenta que S. colonias salivarius serán pequeños y blanco, mientras que los neumococos se deberán plana y verdoso a α-hemólisis, como se muestra en la Figura 3. Para calcular la adherencia neumocócica, normalizar el número de neumococos adherente de la condición b. CCL-23 + células de neumococos a 100%, y comparar los neumococos adherente de otras condiciones para esta condición.
    2. método de qPCR
      Las muestras recogidas en la adherencia Ensayo paso 3.5 se puede almacenar a -20 ° C hasta la extracción de ADN. La extracción de ADN se realizó utilizando un kit comercial y se describe en las secciones 4.2.1-4.2.9 y la qPCR comodecir en secciones 4.2.10-4.2.20.
      1. Preparar enzimática tampón de lisis (50 mM de tampón fosfato pH 6,7 que contiene 1 mg / ml de lisozima, 0,075 mg / ml de mutanolisina, y 2 mg / ml de proteinasa K). La siguiente receta se puede utilizar hacer 10 ml (suficiente para 50 extracciones). Tampón de lisis enzimática debe ser recién preparada antes de su uso.

        7,25 ml de solución 50 mM tampón de fosfato (pH 6,7)
        1,00 ml de 10 mg / ml de solución madre de lisozima para una final [1 mg / ml]
        0,75 ml de 1 mg / ml de mutanolisina de stock para un final de [0,075 mg / ml]
        1,00 ml de 20 mg / ml de proteinasa K de stock para una final [2 mg / ml]
      2. Descongele las muestras en hielo oa 4 ° C. Vortex y la transferencia de 100 ml de alícuotas de cada muestra en tubos de microcentrífuga etiquetados. Volver muestras originales de nuevo en el -20 ° C congelador.
      3. Centrifugar las muestras a 6700 xg durante 10 min.
      4. Retire y deseche el sobrenadante. Añadir 200 l de tampón de lisis enzimática al sedimento y vórtice para resuspender. Incubcomió las muestras a 56 º C durante 30 min. Centrifugar brevemente (5 seg) a 6700 xg para recoger líquido en la parte inferior del tubo.
      5. Añadir 10 l de SDS al 20% para completar la lisis celular y mezclar suavemente a temperatura ambiente durante 2 min.
      6. Añadir 4 l de RNasa A (100 mg / ml) y mezclar suavemente (en un eje de balancín o invirtiendo los tubos) a temperatura ambiente durante 2 min.
      7. Añadir 200 l de tampón AL (del kit) y agitar durante 15 seg. Incubar las muestras a 70 ° C durante 10 min. Centrifugar brevemente (5 seg) a 6700 xg para recoger líquido en la parte inferior del tubo.
      8. Añadir 200 l de EtOH al 100% y agitar durante 15 segundos. Girar brevemente para recoger el líquido en la parte inferior del tubo, a continuación, transferir la mezcla (incluyendo cualquier precipitado) a la columna de centrifugación (en un tubo de recogida de 2 ml) sin mojar el borde. Siga los pasos de lavado según el protocolo del fabricante (no mostrado aquí).
      9. Para eluir el ADN, transferir la columna en un tubo de microcentrífuga etiquetado, añadir 50 l de Buffer AE (frkit de OM), y se incuba a temperatura ambiente durante 2 min. Se centrifuga a 4.300 g durante 1 min. Repetir una vez para un volumen de elución final de 100 l. ADN se puede almacenar a -20 ° C hasta su uso.
      10. Para llevar a cabo qPCR, esterilizar las campanas con luz ultravioleta durante 15 minutos antes de empezar. Se recomienda Preparación de un 96-así placa mapa hoja de trabajo para registrar las localizaciones de pozos para cada muestra.
      11. Preparar una curva estándar utilizando 10 ng / l balance de ADN genómico neumocócica (extraído de la cepa de referencia ATCC 6305).
        1. Descongele Stock ADN neumocócica y centrifugar brevemente (5 segundos) en una centrífuga de mesa.
        2. Realice 01:10 diluciones seriadas de 6 tubos de microcentrífuga premarcan añadiendo ADN 3 l de 27 l de nucleasa libre de H 2 O, el cambio de puntas y vortex entre cada dilución. La serie de dilución final consta de 6 tubos: 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 y 0,00001 ng / l.
          Nota: Estos pueden ser almacenados a 4 ° C durante hasta una semana.
      12. Prepare lytA Mastermix como sigue en un tubo cónico de 15 ml estéril en una campana estéril de PCR. Descongelar componentes en el hielo y agitar inmediatamente antes del uso. et al.15 y se muestran en la lista de materiales.
      13. Vortex y carga 23 l / pocillo del lytA mezclan en los pocillos correspondientes. Consulte el mapa de placas.
      14. Placa de transporte a la plantilla área adición (preferiblemente un gabinete estéril en un cuarto separado) para la carga de la muestra.
      15. Utilice una pipeta P2 para cargar muestras, cambiar las puntas de cada pozo. Todas las muestras se realizan por duplicado. Consulte el mapa de la placa de ubicación.
      16. Para los pozos de la curva estándar, añadir 1 l / pocillo de la dilución apropiada de ADN curva estándar más 1 l / pocillo de H 2 O para llevar el volumen final a 25 l.Por ningún control de los pozos plantilla, añadir 2 l H 2 O.
      17. Añadir 2 l / pocillo de ADN de la muestra en los pozos apropiados.
      18. Tapar todos los pozos en uso. Haga tapas estén cerradas perfectamente. Girar rápidamente la placa de PCR (5 seg) antes de cargar la placa en una máquina de PCR en tiempo real.
      19. Plato de carga en la máquina de PCR y qPCR plazo de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante de la máquina. Se recomiendan las siguientes condiciones de ciclo de hidrólisis de la sonda:
        20. componente por reacción x 102 (plato lleno)
        lytA F 0,25 l de 10 mM de stock 25,5 l
        lytA R 0,25 l de 10 mM de stock 25,5 l
        sonda lytA 0,5 l de 10 mM de stock 51 l
        H 2 O 9.5 l 969 l
        Master mix 12,5 l 1275 l
        El volumen final 23 l 2346 l
        Paso 1 (1x): 3 min a 95 ° C
        Paso 2 (40x): 20 segundos a 95 ° C
        20 seg a 60 ° C
      20. Recopilar datos y cuantificar el ADN neumocócica usando la curva estándar. Cargas bacterianas se calculan como se describió previamente 17, estimando que 1 pg de ADN genómico es equivalente a 447,4 células, y registraron como UFC / ml (suponiendo Ogenoma ne por UFC, y una copia de lytA por genoma; véase la Figura 4). Para un ensayo con éxito, el valor de R 2 debe ser ≥ 0,98 y todos los resultados positivos dentro de la gama de la curva estándar (valores de Ct menor que la obtenida para el 0,00001 ng / l punto de la curva estándar se consideran fondo / lytA negativo).
        Nota: Algunos sistemas de PCR en tiempo real vienen con software de análisis que puede ser utilizado para construir las curvas de calibración y calcular incógnitas. De lo contrario, estos cálculos se pueden realizar en Excel o programas similares. Una curva estándar de ejemplo se muestra en la Figura 4.
      21. Para calcular la adherencia neumocócica, normalizar el número de neumococos adherente de la condición b. CCL-23 + células de neumococos a 100%, y comparar los neumococos adherente de otras condiciones para esta condición.

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Representative Results

Los resultados de un experimento representativo en el que los neumococos (S. pneumoniae PMP843, un aislado de colonizar 19F) se añadieron a las células CCL-23 1 h después de la adición de S. salivarius, y la adherencia neumocócica se cuantificó por tanto recuento viable y lytA qPCR se muestran en la Tabla 2. Los resultados fueron consistentes entre los dos métodos para tanto el número absoluto de bacterias (presentada como UFC / ml) y la adherencia%, normalizada para el número neumococos de adherentes en los pocillos que contienen los neumococos solo. La heparina se utiliza como control, ya que se sabe que inhibe la adherencia neumocócica y por lo tanto la adherencia reducida en el neumococos + condiciones de heparina (típicamente <40% en comparación con neumococos solo) es indicativo de un ensayo de éxito. S. salivarius inhibe la adherencia neumocócica en una manera dependiente de la dosis, como se muestra en la Tabla 2, en donde la alta concentración de S. salivarius (aproximadoly 10 S. salivarius: 1 neumococos) dio lugar a la adherencia más baja neumocócica.

La Figura 5 muestra la adhesión de los neumococos a células CCL-23 cuando S. salivarius se añade 1 hora antes de neumococos (preadición), al mismo tiempo (coaddition), o 1 hora después de neumococos (post-adición). S. salivarius es más eficaz en la inhibición de la adherencia neumocócica cuando se añade antes de neumococos, ya que tanto las dosis alta y media de S. salivarius redujo significativamente la adherencia neumocócica en el ensayo de preadición (Figura 5), mientras que sólo la alta dosis de S. salivarius inhibe la adherencia de neumococo en el coaddition y los ensayos de post-adición (figuras 5B y 5C).

Los datos que se muestran en la Tabla 2 y las Figuras 4 y 5 se obtuvieron utilizando una versión anterior de los cebadores lytA qPCR y la sonda 17. El actual protocolo describe el ensayo qPCR actualizado.

Figura 1
Figura 1. Curvas de crecimiento representativos de S. pneumoniae PMP843 (A) y S. salivarius K12 (B). Para cada especie, se muestra UFC / ml como se determinó por recuento viable en negro (izquierda eje y), y la densidad óptica (DO) a 600 nm se muestra en gris (eje y derecho). Mediados de la fase logarítmica se estimó por recuento viable para ser de 3 horas para S. pneumoniae PMP843 y 2 h para S. salivarius K12. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 2. Ejemplos de CCL-23 células sanas y CCL-23 células con efectos citopáticos (CPE). A) Ejemplo de una monocapa sana, confluente de CCL-23 células. B) CCL-23 células con efectos citopáticos. Nota redondeo de las células, las regiones intracelulares brillantes, y las áreas de monocapa perturbado donde las células han quitado la placa. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio de luz invertida con una ampliación de 200X. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 3
Figura 3. S. salivarius y colonias neumocócicas en agar sangre de caballo. S. salivarius colonias son pequeñas y blanco, como se indica por el blancoflecha y la letra A. neumococo (S. pneumoniae) colonias son típicamente más grandes, más planos y de color verdoso, como lo indica la flecha y carta blanca B. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 4
Figura 4. Ejemplo S. curva estándar pneumoniae por qPCR. cálculos de ADN genómico se muestran junto con los valores de Ct (* promedio de los pozos de la curva estándar duplicadas de un ensayo qPCR representante), con el valor de su norma resultante curva, ecuación, y R 2 se muestra en el gráfico. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

La figura 5 content-width = "6 pulgadas" src = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" width = "600" />
Figura 5. Efecto de S. salivarius en la adherencia neumocócica a células CCL-23 de adherencia neumocócica a CCL-23 monocapas de células cuando las células se incubaron con neumococos solo. (PNC; normalizado a 100%), con neumococos y 100 U / ml de heparina (heparina), o con neumococos y S. salivarius añadió en una proporción de ~ 10: S. salivarius: 1 neumococos (alto), ~ 1 S. salivarius: 1 neumococos (medio), o ~ 1 S. salivarius:. 10 neumococos (bajo) S. salivarius se añadió 1 h antes (A), al mismo tiempo que (B), o 1 h después de neumococos (C). n ≥ 3, * indica P <0,05 en comparación con los neumococos solo (prueba de la t de Student). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Grupo Condición de ensayo Notas
La CCL-23 células solas
B CCL-23 + células neumococos
C CCL-23 + células neumococos + heparina Bloques de heparina adherencia neumocócica a la superficie celular glycosylaminoglycans 16 y se utiliza como un control
D CCL-23 + células neumococos + S. salivarius [alta] Aproximadamente 1 neumococo: 10 S. salivarius
E CCL-23 + células neumococos + S. salivarius [med] Aproximadamente 1 neumococo: 1 S. salivarius
F CCL-23 + células neumococos + S. salivarius [bajo] Aproximadamente el 10 por neumococo: 1 S. salivarius


Tabla 1. Condiciones ensayadas en el ensayo de la adherencia neumocócica. Las seis condiciones de ensayo básicos se describen aquí.

6
Condición de ensayo * UFC / ml Pnc (qPCR) % De adherencia (qPCR) UFC / ml Pnc (recuento viable) % De adherencia (recuento de viables)
Solo Pnc 1,1 x 10 7 100 9.1 x 10 6 100
Pnc + heparina 1.5 x 10 6 14 7.6 x 10 5 8
Pnc + Sal [alta] 6.1 x 10 5 6 3.2 x 10 5 4
Pnc + Sal [med] 3.6 x 10 6 33 2.7 x 10 6 29
Pnc + Sal 9.8 x 10 6 92 90

Cuadro 2: cumplimiento neumocócica para CCL-23 células después de la adición de S. salivarius según lo determinado por lytA qPCR y el método de recuento de viables * Pnc = neumococos.; Sal = S. salivarius; [Alta] = aproximadamente 10 Sal: 1 Pnc; [Med] = aproximadamente 1 Sal: 1 Pnc; [Bajo] = aproximadamente 1 Sal: 10 Pnc.

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Discussion

Una parte crítica de este ensayo es la adición de las concentraciones apropiadas de S. salivarius y neumococos en las secciones 3.1.7 y 3.1.12. Las concentraciones se estimaron utilizando lecturas de DO, pero los inóculos exacta no se determinan hasta que las placas se contaron el día siguiente. Por esta razón, se recomienda la realización de curvas de crecimiento para medir OD y los recuentos de viables (UFC / ml) en el tiempo para todas las cepas bacterianas usadas en el ensayo para identificar la fase semilogarítmica y ayudar en la estimación de la concentración por la OD. Además, las cepas neumocócicas pueden diferir sustancialmente en sus propiedades de adherencia. Las cepas con buena adherencia (> 10% de los inóculos adherirse a las células epiteliales después de una incubación de 3 h) se recomienda para los ensayos de investigación de la capacidad de los probióticos para inhibir la adherencia neumocócica. Aun cuando es realizada por un operador con experiencia, los niveles de adhesión puede variar de ensayo para el ensayo, como lo demuestran las relativamente grandes barras de error se ven en la figura 5. Paraesta razón se recomienda un mínimo de tres repeticiones para cada experimento, con pocillos duplicados para cada condición de ensayo. La variabilidad similar se ha reportado en ensayos de adherencia utilizando Escherichia coli 18. En este protocolo, las células se incubaron durante 3 horas después de la adición de neumococos. El tiempo de incubación puede acortarse si experimentos de tiempo la adherencia se realizan y muestran que la mayoría de las bacterias se adhieran durante la primera hora de incubación.

Este protocolo presenta dos métodos para cuantificar la adherencia neumocócica, qPCR y el recuento viable. Ambos métodos son adecuados, y la elección depende de la preferencia y de laboratorio disponibles los equipos del operador (por ejemplo, acceso a una máquina de PCR en tiempo real). Cuantificación mediante recuento viable es un método de bajo costo que no requiere reactivos adicionales o una máquina de PCR en tiempo real. Sin embargo, utiliza muchos platos (típicamente, 80 placas para un ensayo de 12 pocillos) y debe ser cumplido de inmediatoLY al final del ensayo, y contando las colonias de neumococos puede ser difícil en placas que contienen una gran cantidad de S. salivarius. Cuantificación por qPCR es más caro y requiere una larga etapa de extracción de ADN, pero las muestras se puede almacenar congelado y procesado en lotes, aumentando la eficiencia. El ADN extraído también podría ser utilizado para otros fines, como la detección de qPCR de adherente S. salivarius. Si la investigación de S. salivarius adherencia, se recomienda incluir pozos con CCL-23 células más S. salivarius (sin neumococos) y pocillos con células CCL-23, además de S. salivarius y heparina como controles adicionales.

El ensayo básico también se puede adaptar para investigar otros aspectos científicos de la colonización. Por ejemplo, el efecto de los probióticos en la producción de citoquinas puede ser evaluada mediante el almacenamiento y ensayando los sobrenadantes celulares. El ensayo también puede ser modificado para examinar la invasión bacteriana en lugar de la adhesión de losla incubación de las células con la membrana celular antibióticos impermeables para matar las bacterias extracelulares antes de la cosecha y las células de lisis. Como se describe aquí, el ensayo no distingue entre (interiorizado) neumococos adherente e invasiva. Sin embargo, estudios previos han encontrado que los niveles de neumococos internalizado a ser muy pequeño (normalmente ≤ 0,01% de inóculos) 10 por lo que para la mayoría de los aislamientos (incluyendo PMP843), la gran mayoría de los neumococos asociado a células son adherentes y no internalizados. Las aplicaciones adicionales incluyen pruebas de otras especies probióticas para la capacidad de inhibir la colonización, y / o mirando a cepas bacterianas mutantes para investigar el papel de los genes específicos de interés.

Una limitación obvia de este ensayo in vitro es que no incluye un epitelio establecido, las células inmunes, la flora normal, u otros factores que probablemente influyen en la colonización neumocócica in vivo. Para evaluar plenamente si los probióticos couLD ser útil en la prevención de la colonización de patógenos en el tracto respiratorio, en estudios in vivo usando modelos animales y ensayos clínicos humanos se justifica. Sin embargo, ensayos de adherencia in vitro sirven como una pantalla útil para identificar los probióticos con el potencial para inhibir la adherencia neumocócica y pueden proporcionar información sobre estrategias de dosificación preferenciales, así como proporcionar un modelo experimental que se puede utilizar para estudios mecanísticos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por fondos del Programa de Apoyo a la Infraestructura Childrens Operativa del Gobierno de Victoria Instituto e Investigación Murdoch.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

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References

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Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

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