Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Undersöka effekterna av probiotika på Pneumococcal Colonization Använda en Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

In vitro följsamhet analyser kan användas för att studera fastsättning av Streptococcus pneumoniae till epitelceller monolager och för att undersöka möjliga åtgärder såsom användning av probiotika för att hämma pneumokocker kolonisation.

Abstract

Vidhäftning av Streptococcus pneumoniae (den pneumokocker) till epitelial slemhinnan i nasofarynx kan resultera i kolonisering och anses vara en förutsättning för pneumokockinfektioner såsom lunginflammation och öroninflammation. In vitro adherence analyser kan användas för att undersöka vidhäftningen av pneumokocker till epitelceller monolager och för att undersöka möjliga åtgärder, såsom användning av probiotika, att hämma pneumokock kolonisering. Protokollet som beskrivs här används för att undersöka effekterna av den probiotiska Streptococcus salivarius på vidhäftningen av pneumokocker i människo epitelcellinje CCL-23 (ibland kallad HEp-2-celler). Analysen omfattar tre huvudsteg: 1) beredning av epitel och bakterieceller, 2) Förutom av bakterier till epitelceller monolager, och 3) upptäckt av fastsittande pneumokocker med bakterieräkning (seriespädning och plätering) eller kvantitativ realtids-PCR (qPCR ). Denna technique är relativt enkelt och inte kräver annat än en vävnadsodlingsinställningsspecialutrustning. Analysen kan användas för att testa andra probiotiska arter och / eller potentiella hämmare av pneumokocker kolonisation och kan lätt modifieras för att ta itu med andra vetenskapliga frågor om pneumokocker vidhäftning och invasion.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (den pneumococcus) är en grampositiv bakterie, som kan orsaka infektioner, inklusive lunginflammation, otitis media, och meningit. Det är en viktig orsak till sjukdom hos barn i låginkomstländer och ansvarig för uppskattningsvis 800.000 dödsfall bland barn under fem års ålder varje år 1. Pneumokocker sker ofta i nasofarynx av småbarn. Även om denna kolonisering anses allmänt asymtomatiska, föregår den pneumokockinfektion och tjänar som en reservoar för bakterierna i mänskliga populationer 2. Konjugerat pneumokock vaccinering minskar effektivt transport av de serotyper som ingår i vaccinet. Men det finns mer än 90 serotyper av pneumokocker, och vaccination kan leda till serotyp ersättning, varvid elimineringen av vaccinets serotyper följs av en uppgång i vagn och sjukdom orsakad av nonvaccine serotyper 3. Också i vissa högriskpopulationer, pneumokockerkolonisering sker ofta mycket tidigt i livet, före administrering av den första vaccindosen 4,5. På senare tid har användningen av probiotika föreslagits som en ytterligare strategi för att hämma pneumococcal colonization 6,7. In vitro adherence analyser har använts för att undersöka pneumococcal adherence 8,9. Dessa analyser har anpassats för att undersöka effekterna av den probiotiska Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) på pneumokock följsamhet 10.

Utöver LGG och andra mjölksyrabakterier, Streptococcus salivarius, en gemensam hemvist i den orala kaviteten, har undersökts som en potentiell probiotisk för luftvägarna på grund av sin kolonisering potential och förmåga att inhibera pneumokocker och andra respiratoriska patogener in vitro 11 - 13. Protokollet presenteras här beskriver en följsamhet analys som används för att undersöka effekterna av S. salivarius K12 på pneumococcal adherencetill den humana epitelcellinje CCL-23. Före användning i analysen, var pneumokock isolat utvärderades för vidhäftningsförmåga, som tillväxt-och vidhäftningsförmåga kan variera kraftigt mellan isolat 10,14. Tillväxtkurvor av pneumokocker och S. salivarius utfördes för att bestämma mitten av log-fasen och uppskattning koncentration (kolonibildande enheter eller CFU / ml) av den optiska densiteten (OD, figur 1). Det rekommenderas att undersöka tillväxten av viabla celler och OD för varje isolat före användning i analysen. Denna analys kan utföras i alla laboratorier med standardvävnadsodlings anläggningar och utrustning. I detta protokoll, effekten av tre doser av S. salivarius administreras 1 h före tillsats av pneumokocker på vidhäftningen av S. pneumoniae PMP843, en serotyp 19F vagn isolat kommer från en nasofarynxpinne, undersöks. Två olika sätt att kvantifiera vidhäftande pneumokocker presenteras: plätering på blodagar att avskräckamin livsdugliga räkningar, och DNA-extraktion och detektion av pneumokock LytA genen från qPCR 15. Den grundläggande adherence analysprotokoll kan lätt modifieras för att testa olika doser eller tiden för administrering av probiotika och kan även användas tillsammans med andra bakteriestammar eller arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av Epithelial och bakterieceller

  1. Upptining av CCL-23 epitelceller
    1. Förvärm Minimum Essential Media (MEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) i en 37 ° C vattenbad i ~ 30 min.
    2. Sterilisera vävnadskultur-godkänd biosäkerhet skåp med UV-ljus under minst 10 min före användning och torka av arbetsområdet med 70% etanol. Torka den värmde medieflaskan med 70% etanol och plats i biosäkerhet skåp.
    3. Med hjälp av en 25 ml pipett 14 ml av media i en T-75 kolv. Placera kolven i 37 ° C inkubator medan celler upptining (avsnitt 1.1.4).
    4. Ta en flaska med CCL-23-celler från lagring flytande kväve med hjälp av lämpliga säkerhetsåtgärder och varmt i ett 37 ° C vattenbad tills ~ 80% tinas.
    5. Gå tillbaka kolven upprättats i avsnitt 1.1.3 till biosäkerhet skåpet. Torka utsidan av injektionsflaska med CCL-23-celler med 70% etanol och överföra innehåll (1 ml) i T-75 Kolv med en P1000 pipett.
    6. Inkubera kolven på sidan i en 37 ° C, 5% CO2, 95% relativ fuktighet vävnadskultur inkubator över natten (16-20 h).
    7. Kontrollera cellerna i mikroskop för att bekräfta en hälsosam morfologi, ta bort media och ersätt med 15 ml färska, förvärmt MEM + 10% FBS.
  2. Underhåll av CCL-23 epitelceller
    1. När cellerna är ~ 80% konfluent (1-2 dagar), passage genom avlägsnande av media med användning av en 25 ml pipett och försiktigt tvätta cellerna två gånger med 8-10 ml förvärmd fosfatbuffrad salin (PBS) med användning av en 10 ml pipett.
    2. Avlägsna PBS och tillsätt 1 ml av en steril 0,25% trypsin-EDTA (0,25% (vikt / vol) trypsin, 0,1 mM EDTA). Vrid kolven på sidan, rotera för att säkerställa trypsin täcker sammanflytande lager av celler, och inkubera kolven i 2-3 min i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
    3. Gå tillbaka kolven till biosäkerhet skåp, lägga till 9 ml förvärmd MEM + 10% FBS, och pipettera upp och ner 6 -8x att suspendera cellerna, mata vätska ner på sidan av kolven för att få bort celler.
    4. Sträck celler 01:15 (1 ml + 14 ml MEM + 10% FBS) eller 1:30 (0,5 ml + 14,5 ml MEM + 10% FBS), kassera överflödiga celler och returnera kolven till 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
    5. Passage cellerna minst två gånger före användning i adherensanalysen. Normalt celler delas varje 3-4 dagar.
  3. Ympning av CCL-23 epitelceller (en dag före adherensanalysen, protokoll 2)
    1. Split konfluenta celler enligt beskrivningen i avsnitten 1.2.1-1.2.3, återsuspendering i förvärmd MEM + 5% FBS (FBS koncentration sänks för att minska sannolikheten av serumkomponenter som interfererar i analysen). Ta bort 20 l av celler och räkna med hjälp av trypan blå färgning och en hemocytometer.
    2. Späd celler i förvärmd MEM + 5% FBS till en koncentration av 1,5 x 10 5 celler / ml i ett sterilt 50 ml rör.
    3. Seed 1 ml celler / brunn i en vävnads-Odlingsbehandlade 24-brunnars platta.
  4. Beredning av bakterier
    Denna procedur kan följas för beredning av pneumokocker och S. salivarius. Bakteriellt tillväxtmedia är vanligtvis förvaras i en 37 ° C inkubator över natt för att Förvärm och sterilitetstest (i allmänhet kommer att synas grumlig om kontaminerad).
    1. Två dagar före adherensanalysen spruta på bakterier på hästblodagar (HBA)-plattor och inkubera vid 35 till 37 ° C och 5% CO2 under 18-24 timmar. Fårblodagar kan användas som ett alternativ.
    2. Följande dag, förbereda en övernattning kultur för varje bakteriearter genom att pipettera 10 ml Todd-Hewitt buljong med 0,5% jästextrakt (THB + YE) medium i en steril 30 ml tub. Med hjälp av en 10 l ögla, ympa cirka 10-12 väl separerade kolonier. Kortfattat virvel och inkubera vid 35 till 37 ° C och 5% CO2 under 14-16 timmar. Observera att pneumokocker kommer autolyze om de lämnas för länge i buljong kultur.

    2 adherensanalysen:. Tillägg av bakterier till epitelceller monolager

    1. Beredning av mid-log bakteriekulturer av pneumokocker och S. salivarius
      1. Pipettera 10 ml av förvärmd THB + YE i vardera av två sterila 30 ml rör, en märkt pneumokocker och den andra S. salivarius.
      2. För att nå mitten log fas, pneumokocker kräver ~ 3 timmar och S. salivarius kräva ~ 2 h inkubation (se figur 1). Starta båda kulturerna samtidigt. Vortex (3-5 sek) över natten bakteriekulturer och tillsätt 100 l pneumokocker och 100 ^ S. salivarius in i motsvarande rör.
      3. Kortfattat virvel och inkubera kulturer vid 37 ° C under ca 2 h för S. salivarius och 3 h för pneumokocker.
    2. Beredning av CCL-23 celler för adherensanalysen
      1. Med användning av ett inverterat mikroskop, ta en 24-brunnsplatta för confluent monolager med frisk cell morfologi. Monolager bör vara> 80% sammanflytande, utan tecken på cellklumpning eller cytopatiska effekter såsom cell avrundning eller förlust av vidhäftning (se figur 2).
      2. Ta bort materialet i varje brunn med hjälp av en pipett, luta plattan något för att undvika att störa encellsskiktet.
      3. För att försiktigt tvätta cellerna, lägga ~ 500 l förvärmd PBS i varje brunn med hjälp av en serologisk pipett och ta bort den med en överföringspipett, luta plattan något. Kassera PBS. Upprepa tvättn gång.
      4. Addera 500 pl av förvärmd MEM + 5% FBS i varje brunn. Returnera 24-brunnar till CO2 inkubator vid utarbetandet av bakteriekulturer.
        OBS: För att fastställa den exakta CCL-23 cell nummer för mångfald av infektion (MOI), kan två brunnar att trypsin och räknas på dagen för infektion.

    3. Adherensanalysen

    1. Lägg pneumokocker tillde CCL-23-celler vid ett MOI ~ 10:01. Testa de villkor som listas i tabell 1 i dubbla brunnar.
      1. Mät den optiska tätheten vid A 600 (OD) av 1 ml av S. salivarius kultur. OD bör vara mellan 0,3-0,6.
      2. För över 5 ml av S. salivarius kulturen in i ett 10 ml rör och centrifugera vid 1870 xg under 4 minuter.
      3. Kassera supernatanten och utifrån OD behandlingen i avsnitt 3.1.1, resuspendera S. salivarius i 200-1000 ul av 0,85% NaCl (slutlig koncentration ~ 1,5 x 10 9 CFU / ml). Som en allmän riktlinje, kommer en OD av 0,375 återsuspenderas i 260 | il. Förbered 1:10 och 1:100 spädningar av S. saliv använda 0,85% NaCl.
        Anm: Totalt tre koncentrationer (som representerar hög, medel och låga doser) av S. saliv kommer att testas i analysen. Den höga dosen är ett förhållande på ~ 10 S. salivarius: 1 pneumokocker, är ~ 1 mediet S. saliv: 1 pneumokocker, och den låga är ~ 1 S. salivarius: 10 pneumokocker.
      4. Ta ut 24-brunnar från inkubatorn.
      5. Från heparin kontrollbrunnarna, ta bort 40 | il medium och tillsätt 50 | il av heparin (1000 U / ml slut koncentration) till en slutlig koncentration av 100 U / ml.
      6. Tillsätt 10 l av 0,85% NaCl till brunnar innehållande enbart CCL-23-celler och brunnar innehållande CCL-23-celler och pneumokocker (ingen S. salivarius).
      7. Tillsätt 10 ul av outspädd, 1:10 och 1:100 av S. salivarius till respektive brunnar.
        Notera: S. saliv kan också läggas samtidigt som pneumokocker (coaddition) eller 1 timme efter pneumokocker (efter tillägg) för att undersöka effekten av tidpunkten för probiotiska administration.
      8. Centrifugera i 24-brunnsplatta vid 114 x g under 3 min för att främja bakteriell kontakt med cellskiktet och inkubera under 1 timme vid 37 ° C, 5% CO2.
      9. Gör seriespädning av S. saliv lager i 0,85% NaCl och plattan på duplikat HBAplattor för livskraftiga räknas. Lägg först till 50 l av lager till 450 l av 0,85% NaCl för att göra en 10 -1 utspädning, sedan puls virvel (5 sek), byta tips och tillsätt 50 ìl av 10 -1 utspädning till 450 l av 0,85% NaCl för att göra en 10 -2 spädning och så vidare upp till 10 -7.
      10. Plate 100 ul av 10 -5, 10 -6, och 10 -7 spädningar i två exemplar på HBA-plattor och sprids med en steril spridare. Inkubera HBA plattorna inverterade över natten vid 37 ° C, 5% CO2.
      11. Mot slutet av den 1 timme inkubation, upprepa avsnitt 3.1.1-3.1.3 för pneumokocker. OD bör vara mellan 0,2 till 0,7. Centrifugera ner 1 ml av pneumokock kultur och återsuspendera pelleten i 300-2,000 il av 0,85% NaCl (räknat på OD-läsning) till en koncentration av ~ 1,5 x 10 8 CFU / ml. Som en allmän riktlinje, kommer en OD på 0,3 återsuspenderas i 500 | il.
      12. Efter 1 h inkubation med S. salivarius, lägga 10 μ, L outspädd pneumokocker till alla brunnar utom negativa kontrollbrunnar (innehållande celler endast).
      13. Centrifugera i 24-brunnsplatta vid 114 x g under 3 min och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 3 timmar. Gör seriespädning av pneumokocker lager i 0,85% NaCl som beskrivs i avsnitt 3.1.9 och plattspäd 10 -4, 10 -5, och 10 -6 om dubbla HBA plattor för bakterieräkning.
    2. Efter 3 timmar, kontrollera cellerna i mikroskop för att se till att monolager ser friska (se figur 2). Ta bort materialet från varje brunn och försiktigt tvätta cellerna 3x som beskrivs i avsnitt 2.2.3. med en annan pipett för varje tillstånd. Detta steg är viktigt att ta bort nonadherent pneumokocker. Mono bör inte komma ifrån varandra under tvättprocessen; Detta kan bekräftas genom att kontrollera igen under ett mikroskop.

    Anm: Media avlägsnas under detta steg kan lagras vid -20 ° C under ytterligare analyser (<em> till exempel mätning av cytokinnivåer).

    1. Addera 200 pl av 0,1% digitonin (en mild detergent) till varje brunn och inkubera i 7 minuter vid 37 ° C, 5% CO2.
    2. Lägg till 800 l av THB media till varje brunn. Lyse cellerna genom pipettering upp och ned, och, om nödvändigt, skrapa brunnar 3-4x med pipettspetsen för att se till cellmonoskiktet avlägsnas fullständigt. Ändra tips mellan brunnar.
    3. Ta bort innehållet från varje brunn med en P1000 pipett och överför till märkta mikrofugrör.

    4. Kvantifiering av vidhäftande Pneumokocker

    Vidhäftande pneumokocker kan kvantifieras genom att bestämma bakterieräkning (seriell utspädning och utstrykning på biodagar) eller genom kvantitativ realtids-PCR.

    1. Livskraftiga count metod
      Denna metod måste utföras omedelbart efter steg 3,5 av adherensanalysen.
      1. För varje analys väl, förbereda seriespädningar av prover som samlats insteg 3,5 av adherensanalysen genom tillsats av 50 pl av prov till 450 pl av 0,85% NaCl, puls virvling, och seriespädning, såsom beskrivs i avsnitt 3.1.9 upp till 10 -6 utspädning.
      2. Plate 100 pl av 10 -3, 10 -4, 10 -5 och 10 -6 spädningar i två exemplar på blodagar, sprids med en steril spridare och inkubera inverterade plattorna över natten vid 37 ° C, 5% CO2. Observera att brunnarna innehållande CCL-23-celler enbart inte bör innehålla några bakterier och kan vara pläterade snyggt (100 l outspädd) som en sterilitetskontroll.
      3. Följande dag, bestämma pneumokock inokulat genom att räkna kolonierna på lämpliga utspädningsplattorna (innehållande 30-300 kolonier) som framställts i avsnitt 3.1.13 i adherensanalysen. Beräkna CFU / ml av inokulat med den genomsnittliga värde från två plattor. På liknande sätt bestämmer S. saliv inokulat genom räkning av de kolonier på plattorna bereddai avsnitt 3.1.10.
        OBS: Plattor bör endast innehålla pneumokocker; närvaron av andra arter tyder på att analysen var förorenad och resultatet är ogiltigt.
      4. För att bestämma pneumokocker vidhäftningsnivåerna, räkna lämplig utspädning plattan (innehållande 30-300 pneumokocker kolonier) för varje prov bereds i avsnitt 4.1.1. Observera att S. salivarius kolonier kommer att vara små och vita, medan pneumokocker kommer att vara platt och grönaktiga på grund av att α-hemolys, såsom visas i fig. 3. Beräkna pneumokock-vidhäftning, normalisera antalet vidhäftande pneumokocker från villkor b. CCL-23-celler + pneumokocker till 100%, och jämföra vidhäftande pneumokocker från andra tillstånd till detta tillstånd.
    2. qPCR metod
      Prov uppsamlade i adherensanalysen steg 3,5 kan lagras vid -20 ° C fram till DNA-extraktion. DNA-extraktion utförs med hjälp av ett kommersiellt kit och beskrivs i avsnitten 4.2.1-4.2.9 och qPCR somsäger i avsnitt 4.2.10-4.2.20.
      1. Förbered Enzymatisk Lysis Buffer (50 mM fosfatbuffert pH 6,7 innehållande 1 mg / ml lysozym, 0,075 mg / ml mutanolysin, och 2 mg / ml proteinas K). Följande recept kan användas göra 10 ml (tillräckligt för 50 extraktioner). Enzymatisk lyseringsbuffert bör beredas före användning.

        7.25 ml 50 mM fosfatbuffertlösning (pH 6,7)
        1,00 ml 10 mg / ml lysozym lager för en slutlig [1 mg / ml]
        0,75 ml av 1 mg / ml mutanolysin lager för en slutlig [0,075 mg / ml]
        1,00 ml 20 mg / ml proteinas K lager för en slutlig [2 mg / ml]
      2. Tina proverna på is eller vid 4 ° C. Vortexa och överföring 100 | il alikvoter av varje prov i märkta mikrofugrör. Avkastning ursprungliga prover tillbaka till -20 ° C frys.
      3. Centrifugera proverna vid 6700 xg under 10 min.
      4. Avlägsna och kassera supernatanten. Lägg till 200 l av enzymatisk lys buffert till pelleten och vortex för att suspendera. Incubåt proverna vid 56 ° C under 30 min. Centrifugera kort (5 sek) vid 6700 x g för att samla vätska i botten av röret.
      5. Tillsätt 10 | il av 20% SDS för att fullborda cellys och blanda försiktigt vid rumstemperatur under 2 min.
      6. Lägg 4 ul av RNas A (100 mg / ml lager) och blanda försiktigt (på en vippa eller genom att vända rören) vid rumstemperatur under 2 min.
      7. Tillsätt 200 l av buffert AL (ur satsen) och skaka i 15 sekunder. Inkubera prov vid 70 ° C i 10 min. Centrifugera kort (5 sek) vid 6700 x g för att samla vätska i botten av röret.
      8. Addera 200 pl av 100% EtOH och vortexa i 15 sek. Snurra kort stund för att samla upp vätskan i botten av röret, sedan överföra blandningen (inklusive eventuell fällning) till spinnkolonn (i en 2 ml provrör) utan att blöta ner kanten. Följ tvättsteg enligt tillverkarens protokoll (visas inte här).
      9. För att eluera DNA, överföra kolumn i ett märkt mikrofugrör, tillsätt 50 l av buffert AE (frOM-satsen) och inkubera vid rumstemperatur under 2 min. Centrifugera vid 4300 xg i 1 minut. Upprepa en gång för en slutlig eluering volym på 100 l. DNA kan förvaras vid -20 ° C fram till användning.
      10. För att utföra qPCR, sterilisera kåpor med UV-ljus i 15 min före start. Förbered en 96-brunnars platta karta bladet för att spela in och platser för varje prov rekommenderas.
      11. Bered standardkurva med hjälp av en 10 ng / l lager av genomiskt pneumokock-DNA (extraherat från referensstam ATCC 6305).
        1. Tina pneumokock lager-DNA och spinn ner en kort stund (5 sek) i en bordscentrifug.
        2. Utför 1:10 seriella spädningar i 6 prelabeled mikrocentrifugrör genom att tillsätta 3 | il DNA till 27 pl nukleasfritt H2O, förändras tips och virvling mellan varje spädning. Den slutliga utspädnings serien består av 6 rör: 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, och 0,00001 ng / ul.
          Not: Dessa kan lagras vid 4 ° C i upp till en vecka.
      12. Förberedere LytA Mastermix så här i en steril 15 ml koniska rör i en steril PCR huva. Tina komponenter på is och virvel omedelbart före användning. et al.15 och visas i listan med material.
      13. Vortex och last 23 l / brunn av LytA blanda i lämpliga brunnar. Se plattkarta.
      14. Transportplattan mall tillägg område (helst en steril skåp i ett separat rum) för provbelastning.
      15. Använd en P2 pipett för att ladda prover, byta tips för varje brunn. Alla prover kördes i duplikat. Se plattkarta för platsen.
      16. För standard curve brunnarna, tillsätt 1 pl / brunn av en lämplig spädning av standardkurva DNA plus 1 | il / brunn H2O för att bringa den slutliga volymen till 25 | il.För ingen mall kontrollbrunnarna, tillsätt 2 l H2O
      17. Tillsätt 2 l / brunn av prov-DNA i lämpliga brunnar.
      18. Cap alla brunnar i bruk. Se till att locken är stängda tätt. Snabbt snurra PCR-plattan (5 sekunder) innan du lägger plattan i en realtids-PCR-maskin.
      19. Lastplatta i PCR-maskin och köra qPCR enligt anvisningarna från maskintillverkaren. Följande hydrolysbetingelser sondcykelbetingelser rekommenderas:
        20. komponent per reaktion x 102 (hela plattan)
        LytA F 0.25 l av 10 mikroM lager 25,5 | il
        LytA R 0.25 l av 10 mikroM lager 25,5 | il
        LytA sond 0.5 l av 10 mikroM lager 51 | il
        H2O 9,5 ^ il 969 | il
        Mästare mix 12,5 | il 1275 | il
        Slutlig volym 23 | il 2346 | il
        Steg 1 (1x): 3 minuter vid 95 ° C
        Steg 2 (40x): 20 sek vid 95 ° C
        20 sek vid 60 ° C
      20. Samla in data och kvantifiera pneumokock-DNA med användning av standardkurvan. Bakteriella belastningar beräknas såsom beskrivits tidigare 17, och uppskattar att 1 pg av genomiskt DNA är ekvivalent med 447,4 celler och rapporterades som CFU / ml (under antagande one genomet per CFU, och en kopia av LytA per genomet; se Figur 4). För en lyckad analys, bör värdet på R 2 vara ≥ 0,98 och samtliga positiva resultat inom området för standardkurvan (Ct-värden mindre än den som erhölls för den 0,00001 ng / jil standardkurva punkt anses bakgrund / LytA negativ).
        Obs: Vissa realtids-PCR-system kommer med analys programvara som kan användas för att konstruera standardkurvor och beräkna okända. Annars kan dessa beräkningar utföras i Excel eller liknande program. Ett exempel på standardkurva visas i figur 4.
      21. För att beräkna pneumokocker vidhäftning, normalisera antalet vidhäftande pneumokocker från villkor b. CCL-23-celler + pneumokocker till 100%, och jämföra vidhäftande pneumokocker från andra tillstånd till detta tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultat från ett representativt experiment i vilket pneumokocker (S. pneumoniae PMP843, en koloniserande 19F isolat) sattes till CCL-23 celler 1 h efter tillsats av S. salivarius, och pneumococcal vidhäftning kvantifierades med både antal viabla celler och LytA qPCR visas i tabell 2. Resultaten var konsekvent mellan de två metoder för både det absoluta antalet bakterier (fram som CFU / ml) och% följsamhet, normaliserad till det antal av vidhäftande pneumokocker i brunnarna innehållande pneumokocker ensam. Heparin användes som en kontroll eftersom det är känt för att inhibera pneumococcal vidhäftning och därför den reducerade vidhäftningen i pneumokocker + heparin villkoret (typiskt <40% jämfört med enbart pneumokocker) är en indikation på en framgångsrik analys. S. saliv hämmar pneumokocker följsamhet i ett dosberoende sätt, vilket visas i tabell 2, där den höga koncentrationen av S. salivarius (ungefärligly 10 S. salivarius: 1 pneumokocker) resulterade i det lägsta pneumokock följsamhet.

Figur 5 visar vidhäftningen av pneumokocker till CCL-23-celler när S. salivarius sättes 1 h före pneumokocker (förtillsats), samtidigt (coaddition) eller 1 h efter pneumokocker (eftertillsats). S. salivarius är mer effektiva på att hämma pneumokock-vidhäftning när det tillsätts före pneumokocker, eftersom både den höga och medelhöga doser av S. saliv minskade signifikant pneumokocker följsamhet i förtillsats analysen (Figur 5A), medan endast den höga dosen av S. salivarius inhiberade pneumokock-vidhäftning i coaddition och post-additions analyser (fig. 5B och 5C).

De data som visas i tabell 2 och figur 4 och 5 erhölls med hjälp av en tidigare version av LytA qPCR primers och sond 17. Den nuvarande protokollet beskriver den uppdaterade qPCR-analysen.

Figur 1
Figur 1. Representativa tillväxtkurvor för S. pneumoniae PMP843 (A) och S. salivarius K12 (B). För varje art är CFU / ml som bestäms av livskraftiga räkning visas i svart (vänster y-axel), och optisk densitet (OD) vid 600 nm visas i grått (höger y-axel). Mid-log fas uppskattades av livskraftig räkna till 3 timmar för S. pneumoniae PMP843 och 2 tim för S. salivarius K12. Klicka här för att visa en större bild .

fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51069/51069fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figur 2. Exempel på friska CCL-23-celler och CCL-23-celler med cytopatiska effekter (CPE). A) Exempel på en frisk, sammanflytande monolager av CCL-23-celler. B) CCL-23 celler med cytopatiska effekter. Observera avrundning av celler, ljusa intracellulära regioner och områden med störd monolager där cellerna har lyft av plattan. Bilder tagna med ett inverterat ljusmikroskop vid 200 gångers förstoring. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. S. salivarius och pneumokocker kolonier på hästblodagar. S. salivarius kolonier är små och vita, såsom indikeras av den vitaarrow och bokstaven A. pneumokockinfektioner (S. pneumoniae) kolonier är oftast större, plattare, och grönaktig färg, vilket indikeras av den vita pilen och bokstaven B. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4
Figur 4. Exempel S. pneumoniae standardkurva för qPCR. iskt DNA beräkningarna visas tillsammans med Ct-värden (* genomsnitt dubbla standardkurvan brunnar från en representant qPCR-analys), med den resulterande 2 värdet standardkurva, ekvationen, och R visas i diagrammet. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5 innehåll-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" width = "600" />
Figur 5. Effekt av S. salivarius på pneumococcal adherence till CCL-23-celler Pneumococcal efterlevnad av CCL-23-cellmonoskikt, när cellerna inkuberades med pneumokocker ensam. (PNC, normaliserad till 100%), med pneumokocker och 100 U / ml heparin (heparin), eller med pneumokocker och S. salivarius sattes vid ett förhållande av ~ 10: S. salivarius: 1 pneumokocker (hög), ~ 1 S. salivarius: 1 pneumokocker (medium), eller ~ 1 S. salivarius:. 10 pneumokocker (låg) S. salivarius sattes 1 h före (A), samtidigt som (B) eller 1 h efter pneumokocker (C). n ≥ 3, * anger P <0,05 jämfört med enbart pneumokocker (Students t-test). Klicka här för att visa en större bild .

"Fo: keep-together.within-page =" alltid ">

Grupp Assay Förhållande Anmärkningar
ETT CCL-23-celler enbart
B CCL-23-celler + pneumokocker
C CCL-23-celler + pneumokocker + heparin Heparin block pneumococcal vidhäftning till cellytan glycosylaminoglycans 16 och används som en kontroll
D CCL-23-celler + pneumokocker + S. saliv [hög] Cirka 1 pneumokocker: 10 S. salivarius
E CCL-23-celler + pneumokocker + S. saliv [med] Cirka 1 pneumokocker: 1 S. salivarius
F CCL-23-celler + pneumokocker + S. saliv [låg] Cirka 10 pneumokocker: 1 S. salivarius


Tabell 1. Testades i pneumococcal adherensanalysen villkor. De sex grundläggande analysbetingelser beskrivs här.

6
Assay Förhållande * CFU / ml Pnc (qPCR) % Följsamhet (qPCR) CFU / ml Pnc (viabla celler) % Följsamhet (livskraftig count)
Pnc ensam 1,1 x 10 7 100 9,1 x 10 6 100
Pnc + heparin 1,5 x 10 6 14 7,6 x 10 5 8
Pnc + Sal [hög] 6,1 x 10 5 6 3,2 x 10 5 4
Pnc + Sal [med] 3,6 x 10 6 33 2,7 x 10 6 29
Pnc + Sal 9,8 x 10 6 92 90

Tabell 2: Pneumococcal adherence till CCL-23-celler efter tillsats av S. saliv bestämt med LytA qPCR och livskraftig count metod * Pnc = pneumokocker.; Sal = S. salivarius; [Hög] = ca 10 Sal: 1 Pnc; [Med] = ca 1 Sal: 1 Pnc; [Låg] = ca 1 Sal: 10 Pnc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En kritisk del av denna analys är att lägga till lämpliga koncentrationer av S. salivarius och pneumokocker i avsnitt 3.1.7 och 3.1.12. Halterna beräknas med hjälp av OD-avläsningar, men den exakta inokulat bestäms inte förrän plattorna räknas följande dag. Därför rekommenderar vi att du utför tillväxtkurvor för att mäta OD och bakterieräkning (CFU / ml) över tid för alla bakteriestammar som används i analysen för att identifiera mitten log fas och hjälpa till att uppskatta koncentration av OD. Dessutom kan pneumokockstammar skiljer sig avsevärt i sin vidhäftningsförmåga. Stammar med god vidhäftning (> 10% av inokulat vidhäfta till epitelceller efter en 3 timmars inkubering) rekommenderas för analyser som undersöker förmågan hos probiotika att inhibera pneumokock-vidhäftning. Även när de utförs av en erfaren aktör, kan vidhäftningsnivåerna variera analys till analys, vilket framgår av de relativt stora felstaplar ses i figur 5. Fördenna anledning rekommenderar vi minst tre upprepningar för varje experiment med dubbla brunnar för varje analystillstånd. Liknande variationer har rapporterats i vidhäftningsanalyser med användning av Escherichia coli 18. I detta protokoll är celler inkuberades under 3 h efter tillsats av pneumokocker. Inkubationstiden kan förkortas om adherence tidsförloppsexperiment utförs och visar att majoriteten av bakterier fästa under den första timmen av inkuberingen.

Detta protokoll presenterar två metoder för kvantifiering av pneumokocker följsamhet, qPCR och livskraftig räkning. Båda metoderna är lämpliga, och valet beror på operatörens önskemål och tillgängliga labbutrustning (t.ex. tillgång till en realtids-PCR-maskin). Kvantifiering av livskraftiga räkning är en billig metod som inte kräver ytterligare reagens eller en realtids-PCR-maskin. Men använder den många plattor (vanligtvis 80 plattor för en 12-väl-analys) och måste utföras omedelbartly vid slutet av analysen, och räkning pneumococcal kolonier kan vara svårt på plattor, som innehåller en stor mängd av S. salivarius. Kvantifiering av qPCR är dyrare och kräver en lång DNA-extraktion steg, men prover kan förvaras fryst och bearbetas i omgångar, vilket ökar effektiviteten. Det extraherade DNA kan också användas för andra ändamål, såsom qPCR upptäcka vidhäftande S. salivarius. Om undersöknings S. saliv vidhäftning rekommenderas att inkludera brunnar med CCL-23-celler plus S. salivarius (utan pneumokocker) och brunnar med CCL-23-celler plus S. salivarius och heparin som ytterligare kontroller.

Den grundläggande analysen kan också anpassas för att undersöka andra vetenskapliga aspekterna av kolonisering. Till exempel, kan uppskattas effekten av probiotika på cytokinproduktion genom att lagra och analysera cellsupernatanter. Analysen kan också modifieras för att undersöka bakteriell invasion istället vidhäftning avinkubera celler med cellmembran ogenomträngliga antibiotika för att döda extracellulära bakterier före skörd och lyserande celler. Som beskrivs här, gör analysen inte mellan vidhäftande och invasiv (internaliserad) pneumokocker. Däremot har tidigare studier funnit nivåerna av interna pneumokocker vara mycket liten (vanligen ≤ 0,01% av inokulat) 10 så för de flesta isolat (inklusive PMP843), den stora majoriteten av cellassocierade pneumokocker är anhängare snarare än internaliserade. Ytterligare användningsområden är att testa andra probiotiska arter för förmågan att hämma kolonisering, och / eller titta på muterade bakteriestammar för att undersöka vilken roll specifika gener av intresse.

En uppenbar begränsning av detta in vitro-analys är att den inte innehåller en etablerad epitel, immunceller, normalflora, eller andra faktorer som sannolikt påverkar pneumokocker kolonisation in vivo. För att till fullo utvärdera huruvida probiotika could vara användbara för att förhindra patogener kolonisation i luftvägarna, in vivo-studier med hjälp av djurmodeller och kliniska försök är motiverade. Ändå, in vitro vidhäftningsanalyser utgöra en värdefull skärm för att identifiera probiotika med potential att hämma pneumokock vidhäftning och kan ge information om förmånsdoseringsstrategier, samt att ge en experimentell modell som kan användas för mekanistiska studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av medel från Murdoch Childrens Research Institute och den viktorianska regeringens Operational Infrastruktur Support Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

Tags

Immunology grampositiva bakterieinfektioner lunginflammation bakteriella lungsjukdomar luftvägsinfektioner, Följsamhet kolonisering probiotika,
Undersöka effekterna av probiotika på Pneumococcal Colonization Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adherensanalysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter