Summary
神经元的形态发生和迁移的基本正常的大脑发育至关重要的事件。在这里，我们描述的方法来操纵基因培养的小脑颗粒神经元和小脑发展的形态和神经元的迁徙特性的评估。
Abstract
在大脑发育事件包括神经元的形态发生和迁移是高度协调的过程， 在体外和体内分析，以便作深入刻画，以确定参与这些活动的途径。小脑颗粒神经元（小脑颗粒神经元），这些来自发展中国家小脑派生是一个理想的模型系统，允许进行形态学分析。在这里，我们描述了如何将遗传操纵小脑颗粒神经元的方法，以及如何学习axono和树突单个神经元。用这种方法RNA干扰，过表达或小分子的效应可以比较来控制神经元。另外，啮齿动物小脑皮层是体内系统，由于其优越的出生后发育的方便。我们还提出了一个在体内电穿孔技术，基因操作的开发小脑，并说明后续小脑分析评估神经元形态的ND迁移。
Introduction
小脑是一个很好的系统来研究轴突生长和迁移的机制。自1神经科学的曙光小脑已经解剖研究的主题。现代显微镜和免疫组化技术已显著扩大，由圣地亚哥，拉蒙和卡哈尔2-4细化初始的发现。小鼠遗传学和分子生物学研究发现重要的增长和转录因子在小脑发育的控制，从而导致需要对不同类型的神经元，包括小脑颗粒神经元（小脑颗粒神经元）5-7的正确接线关键事件的更深入的了解。
小脑是显影后脑8的菱1的衍生物。菱形唇，它是4 个脑室的屋顶的一部分，引起的小脑颗粒神经元祖细胞，这将构成最大量的神经元群中的成人小脑9。下面的喙迁移，他们定居在小脑原基。在这里，颗粒神经元前体有丝分裂导致外颗粒层（EGL），其中发生在出生后啮齿动物的急剧扩张。来自东瀛，神经元开始通过分子层（ML）向内迁移，过去的浦肯野细胞层，最终定居在内部颗粒层（IGL 2）。在这个迁徙的过程中，他们获得一个双极形状有两个轴突延伸到ML。在进一步迁移，细胞体迁移远离轴突和两个进程融合以形成一个分叉的，T形的轴突10。随后，这些轴突束状和被称为平行纤维。已入驻IGL，小脑颗粒神经元树突生长，形成树枝状的爪子，建立突触苔藓纤维。审查基本过程中的显影小脑，组合在体外和体内 approach允许进行可靠的结果和结论。
小脑颗粒神经元不仅是小脑而是整个大脑的最大量的神经元，并且可以被培养，以高纯度11-13。在文化方面，这个高度同质化的神经元群变得迅速和有丝分裂后获得一个极形态，易于识别轴突和树突。培养的小脑颗粒神经元已被证明是研究神经发育的各个方面，包括祖细胞增殖，分化，轴突和树突发育，神经细胞迁移，凋亡及电生理特性（14-19和许多其他人）非常有用。利用基因操作的扩大培养的小脑颗粒神经元的通用性，并允许进行进一步机械洞察上述事件。使用低效率的磷酸钙或亲脂性的方法，其次是免疫细胞化学与极性标记或软件支持的分析facili培养神经元的转染塔特斯单个神经元，例如在一个密集的神经元文化形态的评估。用这种方法，在轴突或枝晶生长兴趣蛋白质的作用，可以研究20-25,26-28。然而，这种文化体系是分析神经细胞迁移的迁移是非常有限的高密度培养的那么有用，并需要共同培养。 在体外分析轴突和树突生长还允许一个信号传导途径的利用RNA干扰（I）的组合相互连接的蛋白质的检测，过度表达或小分子。
建立在轴突和树突生长调控或神经细胞迁移的目的蛋白的相关性， 在体内电穿孔（IVE）技术允许用于分析在显影小脑皮层。由于其在啮齿类动物小脑发育延伸的方式进入第一产后2周的事实，小脑表示accessib乐大脑结构的遗传操作研究发展轴突和树突，神经元迁移，突触和凋亡20-24,29,30,26,27,31-34。此外，该模型体系也为神经元发育的需要完整的小脑皮层如轴突路径，布线和神经元和神经胶质细胞的相互作用两者合计的连接等方面有用的，该协议提供了在体外和体内技术来解决有关神经元的形态发生和迁移互补的方法。
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Protocol
小脑颗粒神经元可以从产后当天（P）5小鼠幼崽或P6幼鼠准备。我们遵循的协议，由Bilimoria医师和他的同事描述的，它采用了有丝分裂抑制剂，以选择用于有丝分裂后小脑颗粒神经元13。
伦理语句：
根据批准的“Verbraucherschutz UND Lebensmittelsicherheit”下萨克森州，德国的动物协议所有涉及活的动物实验已经进行的。
体外测定：
1。对于磷酸钙转染方法制备的DNA质粒，媒体，和缓冲器的
- 溶解质粒DNA在无菌，无热原的水; DMEM（高糖），使250万氯化钙 ;使2X HBSS（将4克氯化钠，0.1775克 氯化钾，0.095克的Na 2 HPO 4•7H 2 O，0.675克葡萄糖和250毫升的超纯水2.5克HEPES和调节pH值至7.05，7.08，和7.11）。注：当准备2倍HBSS溶液，测试其pH值提供了有关质粒的特定组合的转染效率达到最佳效果。
2。培养神经细胞的转染
图1。 体外轴突和树突生长测定法的流程图。培养小脑颗粒神经元（24孔板用玻璃盖玻片），分离出P6幼鼠，转染在DIV 0或1，含有荧光标记的转染（ 如 GFP）的DNA沉淀。固定和免疫后，神经元的成像采用盲法的方式。影像会导入的ImageJ和流程计量。测量，然后用统计软件进行处理。
- 种子小脑颗粒神经元（20×10 6每24孔板; BME，10％小牛血清，2mM青霉素-Streptomycin-谷氨酰胺（PSG），25mM的KCl）中的硝酸洗涤，聚鸟氨酸涂布的12毫米盖玻片的24孔板用500μl的媒体，每孔。
- 一天在体外 （DIV）0（至少8小时后镀）或DIV 1，收集培养基，并保持在37°C用500μl预热的DMEM洗两次神经元和加入500μlDMEM中。
- 在孵化广场神经元（37℃，5％CO 2）45分钟。
- 准备40微升DNA沉淀每个孔的混合：脱氧核糖核酸（2-2.5微克/孔，总DNA的10％应该是一个转染标记如 GFP可视化转染神经元），水（最多18微升），加2微升2.5M的氯化钙 ，拌匀，加入20微升2倍的HBSS。
- 孵育DNA沉淀5分钟，在RT。
- 添加DNA沉淀到各孔中，孵育神经元在孵化18分钟。
- 删除的DMEM / DNA混合物，并用500μl预热的DM洗两次神经元EM。
- 从步骤2.2添加回收集媒体的神经元。如果神经元将在培养3天以上，补充媒体25毫米的葡萄糖在DIV 3补充碳源。
- 经过1-5天，受神经元免疫细胞化学利用绿色荧光蛋白的抗体。
- 图像的至少30％的条件下的单个神经元中使用荧光显微镜以盲方式。
3。测量轴突和树突与NeuronJ，一个国家卫生研究院ImageJ的插件
重要提示：请确保图像通过使用适当的像素correctluy规模：微米比例视放大率和图像的分辨率。
- 图像转换为8位与ImageJ的：打开图像，选择“图像” - >“类型” - > '8位' - >'保存'的形象。
- 运行NeuronJ插件并打开8位图像。
- 使用“添加描记'选项来跟踪轴突：CLICK鼠标左键一次是在轴突的开始，移动鼠标沿的过程。双击轴突的尖端，如果跟踪轴突形状相匹配。
注意：如果建议跟踪从轴突形状不同，单击一次轴突过程锚跟踪，然后双击轴突的尖端。 - 点击“测量描记”，选择“显示跟踪测量”选项，然后按“运行”。轴突的测量都显示在一个新窗口。对于树突，选择“显示组的测量选项”，然后按“运行”。
总枝晶的测量都显示在一个新窗口。将其保存为可以在任何电子表格程序中打开一个单独的文件。 - 或者手动跟踪，使用斐济软件：右键单击日E'直线'选项，选择“手绘线”，
保持按下鼠标左键并手动跟踪过程中，按“CTRL + M”来衡量。 - 计算每个条件平均轴突/树突长度和使用适当的统计检验。
体内电穿孔：
1。设备和试剂的制备
- 你需要30 G针，间隔（1-2毫米），注射器，死体积减速机（DVR），电穿孔和tweezertrodes，加热垫或红外线保温灯，鹅颈灯和异氟醚。
- 把DVR成针，然后将针注射器，最后把垫片针上（ 图2）。
数字2。针。DVR的制剂被切断200μl的移液管尖端，并置于针以减少死体积。垫片是从200微升加载提示衍生和被放置在针的末端，以调节渗透深度进入小脑到大约2毫米。标尺单位：厘米 - 在PBS/0.03％固绿溶解DNA。注意：作为一个转染的标记，但有利的是使用一种荧光蛋白质，是下一个神经元特异性启动子（ 例如，突触蛋白），以唯一的可视化的神经元。总质粒量的25％应是编码转染标记的质粒上。
- 使70％的乙醇。
- 混合十月等体积和30％的蔗糖溶解在PBS中。
- 填充注射器4微升的DNA（4微克/微升的PBS/0.03％固绿质粒DNA）的。
2。幼鼠的香港专业教育学院
香港专业教育学院的流程图：参见图3
图3。 体内电穿孔。P4幼鼠流程图被麻醉的异氟醚和质粒DNA编码荧光标记物的转染（ 如 GFP）被注入到小脑，随后暴露于5电脉冲。五天后，分离GFP阳性小脑被切片，进行免疫组织化学染色。图像是使用共焦显微镜拍摄，并使用了Imaris软件进行分析。数据处理与统计程序。
- 从白化菌株（只Wistar或长埃文斯）使用P4的幼鼠。
- 麻醉幼崽（一个接一个）与异氟醚的小盒子（ 例如 P1000的枪头盒）与200微升异氟醚（浸泡在组织）1-2分钟，直到小狗不再移动。请小心，幼崽不要接触瓦特第i个Iiquid异氟醚。监视时间密切个别幼犬麻醉的反应不同。
- 消毒背部小狗的头，用70％的乙醇。
- 修复拇指和食指之间的小狗的头，用鹅颈灯来定位白化小狗的小脑。横窦大幅标定中脑（上，下丘）从皮质半球（ 图3）。小脑毗邻脑并出现在暗的阴影。使用永久性标记，以指示以点小脑。重要提示：请小狗在固定的位置！注：如果麻醉在此过程中磨掉，露出小狗到异氟烷注射的DNA之前。
- 插入针（ 图3），慢慢注入3μl的DNA的插入小脑。
- 让DNA溶液扩散为30-60秒。
- 将tweezertrodes之间小狗的头，使该负极使用后脑勺（小脑接触R区域），而正极接触头的相对侧（ 图3）。
- 待小狗到5的电脉冲。调整电压，以重幼崽，以确保良好的电效率，而不影响其生存期（ 表1）。
表1中。电穿孔的P4幼鼠。重量 电压 脉冲 间隔 8-9克 160 V 50毫秒 950毫秒 9-10克 165 V 50毫秒 950毫秒 >10克 170V的 50毫秒 950毫秒 - 让幼犬恢复上加热垫或红外线灯的下方。返回幼仔大坝。重要提示：请确保加热源不造成任何灼伤。
- 通过将它们的CO 2，然后斩首电5天后牺牲幼崽。
- 隔离小脑和屏幕的GFP阳性的人小脑用荧光显微镜。
- 小脑固定在4％PFA O / N在4℃，然后在4℃孵育在30％蔗糖，直到小脑下沉到试管底部。
- 嵌入小脑在OCT/30％蔗糖和切为40μm冠状切片用低温恒温器。注：在一项双盲的方式各节小脑。
- 主题部分，以免疫组化用绿色荧光蛋白抗体。染液核染料（DAPI或赫斯特33258），并确定每只动物至少200转染的神经元的观察。
- 供了深入的分析，细分IGL成两半，从而导致面向ML和低级IGL对着白质的上部IGL和计数驻留在每个半GFP阳性神经元。注：计数以盲方式各部分的GFP阳性神经元。
3。测量枝蔓长，采集的部分在X，Y，Z平面的图像使用共聚焦显微镜
注：例如，使用40张为40μm的部分与Z-stwp为1微米。
- 打开的图像序列中的软件，Imaris里，产生枝晶的3D图像。
- 点击'超越'的模式来检视神经元在三维。
- 选择“添加新的灯丝”，然后点击“跳过自动创建'开始半自动跟踪。
注：分析在盲法每个3D图像 - 选择“绘图”选项卡和“AutoPath”。
- 移动对C的鼠标光标埃尔身体和Shift +鼠标右键点击，选择细胞体。注：Autocalculation软件可能需要几分钟。
- 使用Shift键+鼠标左键点击路径添加到灯丝（树突）。注意：路径可以实时可视化。
- 去长丝统计窗口，点击“详细”，“特殊值”和“丝枝晶长度（和）'的枝蔓总长度的总和。
- 使用适当的统计测试，以分析数据。
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Representative Results
分析小脑颗粒神经元的响应不同培养条件的形态，我们转染对DIV 0的神经元，如上所述。转染后，我们把一组神经元的充分培养基（BME，10％小牛血清，2mM PSG，25mM的KCl）中，另一组为最小的含有培养基的胰岛素（BME，25mM的葡萄糖，2mM的PSG，10微克/毫升胰岛素）。我们使用GFP抗体在DIV 1,2进行的神经元免疫细胞化学，和3，随后通过测量轴突和树突为组1和轴突只为一组2。由于血清和KCl，提供生长因子和模仿神经元活性，分别轴突和树突开发迅速，在所示（ 图4A）的时间窗口增长。组2的轴突生长，主要是内在刺激的结果，因而大大减少。然而树突未能正常发育，由于缺乏血清和氯化钾，从而激发枝晶生长（ 图4B）。
轴突和树突生长在小脑颗粒神经元（A，B）的小脑颗粒神经元，转染了质粒的GFP在DIV 0，分别培养在任一全培养基（A）或BME 1，2，或3天补充有胰岛素图4。分析（B）。固定后，神经元用GFP抗体进行了进行免疫细胞化学，测定轴突和树突长度。总共有82（A）和65（B）的神经元进行测定（方差分析，* P <0.05，*** P <0.001，平均值±SEM）。白色箭头和黄色箭头指示轴突和树突，分别。比例尺等于100微米。 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。
执行大鼠小脑的形态学分析，我们进行P4幼犬IVE如上所述的和孤立的小脑5天后。 40微米的冠状冰冻切片免疫组化染色显示，86％的GFP阳性神经元从东瀛陷入了IGL（ 图5A）。其中，50％观察到在EGL的上部和36％迁移到更远的IGL的下部。我们还确定了三个独立的电穿孔的小脑枝晶生长并比较平均长度（ 图5B）。
图5。神经细胞迁移和树突长度在体内电穿孔小脑，小脑分析P4幼鼠进行电与PSYN-GFP质粒和隔离5天后。 40微米的冠状切片，用GFP抗体进行免疫组化。 （ 一 ）在小脑本地化小脑颗粒神经元的进行了评估。 （克鲁斯卡尔沃利斯，曼惠特尼校正，* P <0.05，*** P <0.001）（B）总枝晶长度是使用了Imaris软件测量（单因素方差分析，Bonferroni校正，NS =不显着，平均值±SEM）。箭头表示中广核细胞体。箭头指示树突。比例尺等于50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
优点和在体外和体内方法所描述的限制：
从小鼠和大鼠培养的小脑颗粒神经元也同样适用以及形态学分析。由于一只老鼠小脑的大尺寸，CNGS从幼鼠的产量超过了小鼠幼崽3至4倍。除小脑颗粒神经元，皮质和海马神经元可被用作培养系统为好。磷酸钙方法导致低（0.01-5％）的转染效率，这是需要的，分析单个神经元的形态。替代亲脂转染方法可以用于为好，但过于昂贵而无需进一步的增益。应避免高密度培养，如小脑颗粒神经元的病毒转染方法高效率将使它很难分辨单个进程。在小脑颗粒神经元，我们通常发现的转染效率和天在体外的相关性。神经元已经被培养的时间越长的影响较小，他们将通过转染诱导的应力。其结果转染效率就上去了。此外，集中于轴突生长的内在机制和排除从血清中存在的媒体源生长因子的影响，小脑颗粒神经元可以在补充有胰岛素，一种廉价的替代胰岛素样生长因子1生存介质中培养（IGF-1的），从而促进神经元存活35。从全媒体的一个媒体就换到包含胰岛素媒体必须要么发生在DIV 0或DIV 1，防止血清/氯化钾戒断诱导的细胞凋亡。可以执行类似的轴突生长测定枝晶生长的分析。但重要的是要保持小脑颗粒神经元的补充氯化钾来模拟神经元的活性，从而促进树突发育媒体。神经细胞迁移的分析应用在体内电穿孔技术进行。
培养神经元的转染通常将需要的共转染至少2质粒：一种质粒编码的转染标记，它可以是一种质粒编码荧光蛋白（ 例如 GFP）或β-半乳糖苷酶，和任一RNA干扰或过表达质粒。以确保质粒的成功共表达，转染标记的推荐量应该是脱氧核糖核酸（24孔板的2-2.5微克/孔）的总量的10％。我们先前已经建立了DNA（GFP连同红色荧光蛋白）的结果在神经元共表达两种质粒22,24的85％以上等量的转染。应该击倒，过表达或暴露于小分子诱导神经细胞死亡，质粒编码Bcl-XL可以转染，以确保神经元的存活而对形态的影响20。高达三，四质粒共转染也是没有问题的，这是开展上位有用的分析，以建立两个蛋白在轴突的线性途径或协同作用或树状GRO问心无愧。这里，两个独立的RNAi或过表达的质粒或两者的组合可一起转染的标记共转染。
体内电穿孔技术是开发小脑皮质神经细胞迁移的分析的理想方法。它的优势，使用从白化菌株幼仔相比，皮肤黝黑的应变。此外，它很容易与幼鼠由于其较大尺寸的小脑工作。在我们的手中，几乎所有的小脑是GFP阳性，但程度不同。良好的电穿孔小脑有好几百个GFP阳性神经元，一个严重转小脑小于100。用少量做法，但也可以使用小鼠，如果需要进行研究的转基因小鼠。 （功能丧失的，获得性的功能和结构 - 功能分析）该方法比转基因小鼠的产生显著更快，它允许在不同条件下进行分析。香港专业教育学院确实不属于Require立体定向，鹅颈灯是足以检测一个相当半透明白化小狗的小脑。这也将缩短每小狗的手术时间和简短的异氟醚麻醉就足够了。但它确实需要一些练习瞄准正确的区域，从而掌握该技术。
造成击倒或过度发育问题是微不足道的，由于小脑的区域化遗传操作。这允许对内在机制作为电穿孔导致嵌入在野生型环境中基因修饰的神经元的镶嵌图案的分析。不足之处是将电大鼠或小鼠不能经受行为测试，由于转染神经元的低量。以确保在神经元质粒的共表达，我们建议共转染用质粒编码GFP（或任何其他荧光蛋白）下一个神经元特异性启动子，以避免的可视化转染胶质细胞。效果，导致减少轴突长度可以容易地检测并测量24。相反，它在技术上是无法量化的轴突刺激作用作为其整个长度无法追查。平行的纤维Defasciculation不过是可测量20。为树突长度和神经细胞迁移23,24,30的评估也同样如此。我们通常进行电穿孔后第5天我们的分析。这当然是可能的，以更快和更高执行分析。稍后的时间点，建议检查树突状爪29，它代表小脑颗粒神经元和苔藓纤维之间的突触连接的形成。
要完成的分析，选择合适的统计检验是很重要的。对于这一点，人们必须考虑到，如果各组的值服从正态分布（ 如轴突树突或长度），如果2或M矿石比2组被包含在分析中。对于2组，我们用学生的考试，超过2组单因素方差分析。如果数值遵循非正态分布（ 如迁移距离），曼惠特尼U检验和Kruskal Wallis检验分别有用于2个或多于2组。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢N. Schwedhelm - 杜美尔优秀的技术援助，三锤和S. Papiol帮助与统计分析。我们的工作是由马普学会，德意志研究联合会，该中心的纳米显微镜，及脑分子生理学（CNMPB），哥廷根，德国和由GGNB初级组助学金哥廷根大学的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isoflurane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 G | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
References
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