Summary
Morfogenesi neuronale e la migrazione sono eventi cruciali alla base un corretto sviluppo del cervello. Qui, descriviamo i metodi per manipolare geneticamente colture di neuroni granulari del cervelletto e del cervelletto in via di sviluppo per la valutazione della morfologia e delle caratteristiche migratorie dei neuroni.
Abstract
Eventi dello sviluppo del cervello, tra cui la morfogenesi neuronale e migrazione sono processi altamente orchestrati. In vitro e in vivo analisi consentono di una caratterizzazione approfondita per identificare meccanismi coinvolti in questi eventi. Neuroni granulari cerebellari (CGN) che sono derivati dal cervelletto di sviluppo sono un sistema modello ideale che consente analisi morfologiche. Qui, descriviamo un metodo di come manipolare geneticamente CGN e come studiare axono-e dendritogenesis dei singoli neuroni. Con questo metodo gli effetti dell'interferenza RNA, sovraespressione o piccole molecole possono essere confrontati per controllare neuroni. Inoltre, la corteccia cerebellare roditore è facilmente accessibile in sistema vivo a causa del suo sviluppo postnatale predominante. Vi presentiamo anche una tecnica di elettroporazione in vivo per manipolare geneticamente il cerebella sviluppo e descrivere la successiva cerebellare analisi per valutare la morfologia neuronale unand migrazione.
Introduction
Il cervelletto è un ottimo sistema per studiare i meccanismi di crescita degli assoni e la migrazione. Il cervelletto è stata oggetto di studi anatomici fin dagli albori delle neuroscienze 1. Microscopia moderna e tecniche di immunoistochimica hanno notevolmente ampliato e perfezionato le scoperte iniziali di Santiago, Ramon e Cajal 2-4. Genetica del topo e studi molecolari scoperti fattori di crescita e di trascrizione essenziali nel controllo dello sviluppo del cervelletto, che ha portato ad una maggiore comprensione degli eventi cruciali necessari per il corretto cablaggio dei diversi tipi di neuroni, tra cui neuroni granulari del cervelletto (CGN) 5-7.
Il cervelletto è un derivato di rhombomere 1 della hindbrain sviluppo 8. Il labbro rombico, che è parte del tetto del 4 ° ventricolo, dà origine a progenitori neuronali dei granuli cerebellari, che costituiranno la più numerosa popolazione neuronale nelcervelletto adulto 9. Dopo la migrazione rostrale, si depositano nel anlage cerebellare. Qui, mitosi di precursori neuronali dei granuli porta alla drammatica espansione dello strato granulare esterno (EGL), che avviene dopo la nascita nei roditori. Dal EGL, i neuroni iniziano la migrazione verso l'interno attraverso lo strato molecolare (ML), oltre lo strato di cellule di Purkinje a prendere in ultima analisi, la residenza nello strato granulare interno (IGL 2). Durante questo processo migratorio, acquisiscono una forma bipolare con due assoni si estende nella ML. Su ulteriore migrazione, il corpo cellulare migra distanti assoni ei due processi fondono per formare uno biforcato, assone forma di T 10. Successivamente, questi assoni fasciculate e sono indicate come fibre parallele. Stabilitosi nel IGL, CGN crescere dendriti, che formano artigli dendritiche stabilire sinapsi con le fibre di muschio. Per esaminare processi fondamentali nel cervelletto sviluppo, un combinato in vitro e in vivo approach consente di ottenere risultati affidabili e conclusioni.
CGN sono non solo più numerosi neuroni del cervelletto ma dell'encefalo e possono essere coltivate a elevata purezza 11-13. Nella cultura, questa popolazione neuronale molto omogenea diventa rapidamente postmitotico e acquisisce una morfologia polare con assoni e dendriti facilmente identificabili. CGN coltura hanno dimostrato di essere estremamente utile per studiare i vari aspetti dello sviluppo neuronale, tra cui la proliferazione progenitore, la differenziazione, assonale e lo sviluppo dei dendriti, migrazione neuronale, l'apoptosi e le proprietà elettrofisiologiche (14-19 e molti altri). L'uso della manipolazione genetica ha ampliato la versatilità di CGN colti e consentito per una visione più meccanicistica nei suddetti eventi. La trasfezione di neuroni in coltura con bassa efficienza fosfato di calcio o metodi lipofile seguiti da immunocitochimica con marcatori polarità o software supportato da analisi di facilitareTATI la valutazione ad esempio la morfologia dei singoli neuroni in coltura neuronale denso. Con questo approccio, il ruolo delle proteine di interesse in assoni e dendriti crescita può essere studiato 20-25,26-28. Questo sistema di coltura però è meno utile per analizzare migrazione neuronale, come la migrazione è molto limitata nelle culture ad alta densità e richiederebbe co-colture. L'analisi in vitro di assoni e dendriti crescita consente anche per l'esame di proteine interconnessi di una via di segnalazione utilizzando combinazioni di RNA interference (i), sovra-espressione o piccole molecole.
Per stabilire la rilevanza della proteina di interesse in assoni e dendriti regolazione della crescita o la migrazione neuronale, l'elettroporazione in vivo (IVE) tecnica permette l'analisi in via di sviluppo corteccia cerebellare. Per il fatto che lo sviluppo cerebellare nei roditori estende strada nelle prime due settimane dopo la nascita, il cervelletto rappresenta un accessibstruttura del cervello per le manipolazioni genetiche per esaminare lo sviluppo di assoni e dendriti, migrazione neuronale, sinaptogenesi e apoptosi 20-24,29,30,26,27,31-34. Inoltre, questo modello di sistema è utile anche per altri aspetti dello sviluppo neuronale che richiedono la corteccia cerebellare intatta come assone pathfinding, il cablaggio e la connettività dei neuroni e delle interazioni neuroni-glia Preso insieme, questo protocollo prevede in vitro e in vivo le tecniche per affrontare un approccio complementare per quanto riguarda la morfogenesi neuronale e la migrazione.
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Protocol
CGN possono essere preparati sia dal primo giorno post-natale (P) 5 cuccioli di topo o cuccioli di ratto P6. Seguiamo un protocollo, descritto da Bilimoria e colleghi, che utilizza un inibitore mitotico per selezionare per CGN postmitotic 13.
Etica dichiarazione:
Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali vivi sono stati condotti secondo il protocollo degli animali, approvato dal "Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit" della Bassa Sassonia, in Germania.
Nel test in vitro:
1. Preparazione di plasmidi DNA, Media e buffer per il fosfato di calcio Metodo Transfezione
- Sciogliere plasmide DNA in acqua privo di endotossine sterile; DMEM (alti livelli di glucosio); fanno 2,5 M CaCl 2; fare 2x HBSS (sciogliere 4 g NaCl, 0,1775 g KCl, 0.095 g di Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,675 g di glucosio e 2,5 g HEPES in 250 ml di acqua ultrapura e aggiustare il pH a 7.05, 7.08 e 7.11). Nota: Quando si preparala soluzione HBSS 2x, pH test che dà i migliori risultati per quanto riguarda l'efficienza di trasfezione di data combinazione di plasmidi.
2. Trasfezione di colture di neuroni
Figura 1. Diagramma di flusso di assoni in vitro e dendrite saggio di crescita. Coltivate CGN (piastra da 24 pozzetti con vetrini), isolato da P6 cuccioli di ratto, sono trasfettati in DIV 0 o 1 con precipitato DNA contenente un marcatore fluorescente trasfezione (es. GFP). Dopo la fissazione e immunocitochimica, i neuroni vengono esposte in modo cieco. Le immagini vengono importati in ImageJ e processi sono misurati. Le misurazioni vengono quindi elaborati utilizzando un programma statistico.
- CGN Seed (20 x 10 6 per 24 pozzetti, BME, siero di vitello al 10%, 2 mM penicillina-Streptomycin-Glutammina (PSG), 25 mM KCl) in acido nitrico-lavato, polyornithine rivestite 12 millimetri vetrini in una piastra da 24 pozzetti con 500 microlitri di media per pozzetto.
- Il giorno in vitro (DIV) 0 (almeno 8 ore dopo la placcatura) o DIV 1, raccogliere i media di crescita e di mantenere a 37 ° C. Lavare i neuroni due volte con 500 ml di DMEM preriscaldata e aggiungere 500 ml di DMEM.
- Inserire neuroni in incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per 45 min.
- Preparare 40 ml precipitato di DNA per ogni ben mescolando: DNA (2-2,5 mg / bene, il 10% del DNA totale dovrebbe essere un marcatore di transfezione es GFP per visualizzarne i neuroni trasfettati), acqua (fino a 18 ml), aggiungere 2 ml di 2,5 M CaCl 2, mescolare bene e aggiungere 20 ml di 2x HBSS.
- Incubare DNA precipitato per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungi precipitato DNA a ciascun pozzetto e incubare i neuroni per 18 min in incubatrice.
- Rimuovere mix DMEM / DNA e lavare i neuroni due volte con 500 ml di preriscaldata DMEM.
- Aggiungere raccolta multimediale dal punto 2.2 torna ai neuroni. Se i neuroni saranno in coltura per più di 3 giorni, i media supplemento con glucosio 25 mm a DIV 3 per ricostituire fonte di carbonio.
- Dopo 1-5 giorni, neuroni sottoposti a immunocitochimica utilizzando anticorpi GFP.
- Immagine almeno 30 neuroni individuali a condizione in modo cieco utilizzando un microscopio a fluorescenza.
3. Misurare assoni e dendriti con NeuronJ, un NIH ImageJ Plugin
Importante: Assicurarsi che le immagini vengono ridimensionate correctluy utilizzando appropriate pixel: rapporto micron a seconda di ingrandimento e la risoluzione dell'immagine.
- Converti immagini a 8-bit con ImageJ: Apri immagine, selezionare 'Immagine' -> 'Tipo' -> '8 bit '->' Salva immagine '.
- Eseguire NeuronJ plug-in e aprire l'immagine a 8 bit.
- Utilizzare l'opzione 'Aggiungi' tracciati per monitorare l'assone: click il pulsante sinistro del mouse una volta all'inizio dell'assone e spostare il mouse lungo il processo. Fare doppio click sulla punta dell'assone se traccia corrisponde a forma assonale.
Nota: Se la traccia suggerita differire dalla forma assonale, fare clic una volta sul processo assonale per ancorare traccia, fare doppio clic sulla punta dell'assone. - Clicca su "tracciati misura", scegliere il 'Display misurazioni tracciamento' opzione e premere 'Esegui'. Misurazioni Axon sono tutti visualizzati in una nuova finestra. Per i dendriti, scegliere l'opzione 'misure gruppo di visualizzazione' e premere 'Esegui'.
Misurazioni dendriti totali sono tutti visualizzati in una nuova finestra. Salvarli come file separato che può essere aperto in qualsiasi programma di foglio di calcolo. - In alternativa, per il tracciamento manuale, utilizzare il software Fiji: clic destro su °e l'opzione 'retta', scegliere 'la linea a mano libera',
mantenere il tasto sinistro del mouse e tracciare manualmente il processo, premere 'Ctrl + M' per misurare. - Calcola lunghezza / assonale media dendritiche per condizione e utilizzare test statistico appropriato.
In elettroporazione in vivo:
1. Attrezzature e Preparazione dei reagenti
- Avete bisogno di 30 aghi G, distanziale (1-2 mm), siringa, riduttore di volume morto (DVR), elettroporatore e tweezertrodes, piastra elettrica o lampada di calore a raggi infrarossi, lampada a collo d'oca e isoflurano.
- Mettere DVR in dell'ago, quindi collegare l'ago alla siringa, e, infine, mettere distanziale sulla ago (Figura 2).
Figura2. Preparazione dell'ago. DVR è tagliata una punta di pipetta 200 microlitri e collocato all'interno dell'ago per ridurre il volume morto. Spaziatore è derivato da una punta di 200 microlitri di carico e viene posizionato sull'estremità dell'ago per regolare la profondità di penetrazione nel cervelletto di circa 2 mm. Unità righello: cm - Sciogliere DNA in PBS/0.03% Verde veloce. Nota: Come marcatore trasfezione, è vantaggioso utilizzare una proteina fluorescente che è sotto un promotore neurone-specifica (ad es Synapsin) per visualizzare solo i neuroni. 25% del totale plasmide dovrebbe essere il plasmide codificante il marcatore trasfezione.
- Effettuare il 70% di etanolo.
- Miscelare volumi uguali di ottobre e del 30% di saccarosio disciolto in PBS.
- Riempire la siringa con 4 ml di DNA (4 mg / mL di DNA plasmidico in PBS/0.03% rapidi verde).
2. IVE di Rat Pups
Diagramma di flusso di IVE: si veda la Figura 3
Figura 3. Diagramma di flusso di elettroporazione in vivo. P4 cuccioli di ratto sono anestetizzati con isoflurano e DNA plasmidico codificante un marcatore fluorescente trasfezione (es. GFP) viene iniettato nel cervelletto, seguito da esposizione a 5 impulsi elettrici. Cinque giorni dopo, isolato cerebella GFP-positive sono sezionato e sottoposto a immunoistochimica. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale e analizzati utilizzando il software Imaris. I dati sono trattati con un programma statistico.
- Utilizzare P4 cuccioli di ratto dal ceppo albino (Wistar o Long Evans).
- Anestetizzare cuccioli (uno dopo l'altro) con isoflurano in piccola scatola (ad esempio P1000 box puntale) con 200 ml di isoflurano (imbevuto in tessuto) per 1-2 minuti fino a quando cucciolo non è più in movimento. Fate attenzione che i cuccioli non entrare in contatto wesima Iiquido isoflurano. Monitorare il tempo strettamente individuali cuccioli rispondono diversamente ad anestesia.
- Sterilizzare posteriore della testa del cucciolo con il 70% di etanolo.
- Fissare capo del pup tra il pollice e l'indice e utilizzare la lampada a collo d'oca per individuare cervelletto del pup albino. Il seno trasverso delimita nettamente il mesencefalo (collicolo superiore ed inferiore) a partire da emisferi corticali (Figura 3). Il cervelletto si trova adiacente al mesencefalo e appare in una tonalità più scura. Utilizzare un pennarello indelebile per indicare il cervelletto con un punto. Importante: Conservare pup in posizione fissa! Nota: In caso di anestesia indossare durante questa procedura, esporre cucciolo di isoflurano prima di iniettare il DNA.
- Inserire l'ago (figura 3) e iniettare lentamente 3 ml di DNA nel cervelletto.
- Lasciate che la soluzione di DNA diffusa per 30-60 sec.
- Inserire la testa del cucciolo tra tweezertrodes in modo che il polo negativo a contatto con la parte posteriore della testa (cerebellaregione r) e che il polo positivo contro il lato opposto della testa (Figura 3).
- Oggetto pup a 5 impulsi elettrici. Regolare la tensione al peso dei cuccioli di garantire una buona efficienza elettroporazione senza compromettere la loro sopravvivenza (Tabella 1).
Tabella 1. Elettroporazione di P4 cuccioli di ratto.Peso Tensione Impulso Intervallo 8-9 g 160 V 50 msec 950 msec 9-10 g 165 V 50 msec 950 msec > 10 g 170 V 50 msec 950 msec - Lasciate cuccioli recuperare il pad riscaldato o sotto una lampada a raggi infrarossi. Cuccioli di diga di ritorno. Importante: Assicurarsi che fonte di riscaldamento non infliggere ustioni.
- Sacrifica cuccioli 5 giorni dopo l'elettroporazione mettendoli in CO 2, seguita da decapitazione.
- Isolare il cerebella e lo schermo per quelli GFP-positive cerebella utilizzando un microscopio a fluorescenza.
- Fix cerebella in 4% PFA O / N a 4 ° C, poi incubare in saccarosio al 30% a 4 ° C fino cerebella lavello a fondo della provetta.
- Incorpora cerebella in OCT/30% di saccarosio e tagliare 40 micron sezioni coronali utilizzando un criostato. Nota: Tratto ogni cervelletto in modo cieco.
- Sezioni soggette a immunoistochimica con l'anticorpo GFP. Controcolorare con colorante nucleare (DAPI o Hoechst 33258) e determinare la localizzazione di almeno 200 neuroni trasfettati per animale.
- Per un'analisi approfondita, suddividere il IGL in due metà, con un conseguente IGL superiore di fronte alla ML e una IGL minore di fronte alla materia bianca e contare i neuroni GFP-positive che risiedono in ogni tempo. Nota: Count neuroni GFP-positive di ogni sezione in modo cieco.
3. Misurare Dendrite intera, Acquisire le immagini della sezione in x, y, z aereo utilizzando un microscopio confocale
Nota: per esempio, utilizzare 40 immagini per una sezione di 40 micron con una z-stwp di 1 micron.
- Serie di immagini Open in software, Imaris, per generare una immagine 3D di dendriti.
- Clicca su modalità 'Superare' per vedere il neurone in 3D.
- Selezionare 'Aggiungi nuovo filamento' e cliccare su 'Skip creazione automatica' per avviare l'analisi semiautomatica.
Nota: Analizzare ogni immagine 3D in modo cieco - Selezionare la scheda 'Draw' e 'AutoPath'.
- Spostare il cursore del mouse sul ccorpo ell e Maiusc + tasto destro del mouse per selezionare il corpo cellulare. Nota: autocalculation dal software potrebbe richiedere alcuni minuti.
- Aggiungi percorsi per il filamento (dendriti) usando Shift + click del mouse a sinistra. Nota: I percorsi possono essere visualizzati in tempo reale.
- Vai alla finestra delle statistiche ad incandescenza e clicca su "valori specifici, '' dettagliate 'e' la lunghezza del filamento dendrite (somma) 'per somma di lunghezza totale dendrite.
- Utilizzare appropriati test statistici per analizzare i dati.
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Representative Results
Per analizzare la morfologia della CGN in risposta a differenti condizioni di coltura, abbiamo trasfettato i neuroni sul DIV 0 come descritto sopra. Dopo trasfezione, abbiamo messo una serie di neuroni in pieno mezzo (BME, siero di vitello al 10%, 2 PSG mM, 25 mM KCl) e un'altra serie in minima quantità di terreno contenente insulina (BME, glucosio 25 mM, 2 PSG mm, 10 mg / insulina ml). Abbiamo sottoposto i neuroni a immunocitochimica utilizzando l'anticorpo GFP a DIV 1, 2, e 3, seguita da assoni e dendriti di misura per 1 set e assoni solo per il set 2. A causa di siero e KCl, che forniscono fattori di crescita e l'attività neuronale mimica, rispettivamente, assoni e dendriti sviluppò e crebbe rapidamente sopra la finestra di tempo indicato (Figura 4A). Crescita assonale dei set 2 è principalmente una conseguenza della stimolazione intrinseca e quindi molto ridotta. Dendriti tuttavia riusciti a sviluppare correttamente a causa della mancanza siero e KCl, che stimolano la crescita di dendriti (Figura 4B).
Figura 4. Analisi di assoni e dendriti crescita in CGN (A, B) CGN, trasfettate con un plasmide codificante GFP DIV a 0, sono state coltivate per 1, 2, o 3 giorni in entrambi pieno mezzo (A) o BME supplementato con insulina (B). Dopo la fissazione, i neuroni sono stati sottoposti a immunocitochimica utilizzando l'anticorpo GFP e assoni e dendriti lunghezze sono stati misurati. Un totale di 82 (A) e 65 (B) neuroni sono stati misurati (ANOVA, * p <0.05, *** p <0,001, media + SEM). Frecce bianche e le frecce gialle indicano gli assoni e dendriti, rispettivamente. Barra della scala è pari a 100 micron. Cliccare qui per vedereuna versione più grande di questa figura.
Per eseguire l'analisi morfologica del cervello dei topi, abbiamo sottoposto cuccioli P4 di Ive come descritto sopra e isolato cerebella 5 giorni dopo. L'immunoistochimica di 40 micron criosezioni coronale ha rivelato che l'86% dei neuroni GFP-positive discendono dal EGL nel IGL (Figura 5A). Tra questi, il 50% sono stati osservati nella parte superiore della EGL e 36% migrato più lontano nella parte inferiore del IGL. Abbiamo determinato anche la crescita dei dendriti dei tre indipendenti cerebella elettroporate e lunghezza media a confronto (Figura 5B).
Figura 5. Analisi della migrazione neuronale e la lunghezza in dendrite in vivo elettroporate cerebella. Cerebella diP4 cuccioli di ratto sono state elettroporate con il plasmide Psyn-GFP e isolato 5 giorni dopo. 40 micron sezioni coronali sono state sottoposte a immunoistochimica usando l'anticorpo GFP. È stata valutata (A) Localizzazione dei CGN nel cervelletto. Lunghezza totale dendrite (Kruskal Wallis, correzione Mann Whitney, * p <0.05, *** p <0.001) (B) è stata misurata utilizzando il software Imaris (ANOVA, correzione di Bonferroni, ns = non significativo, media + SEM). Le frecce indicano corpi cellulari CGN. Punte di freccia indicano dendriti. Barra della scala è uguale a 50 micron. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vantaggi e limitazioni del descritto in vitro e in vivo:
CGN Colta da mouse e ratti sono ugualmente adatti per le analisi morfologiche. A causa della dimensione più grande di un cervelletto di ratto, la resa di CNGS da cuccioli di ratto supera quello dei cuccioli di topo 3-4x. A parte CGN, neuroni corticali e ippocampali possono essere utilizzati come sistema cultura. Il metodo di fosfato di calcio si traduce in un basso (0,01-5%) efficienza di trasfezione, che è desiderato per analizzare la morfologia dei singoli neuroni. Metodi di transfezione lipofili alternativi possono essere utilizzati come bene, ma sono eccessivamente costosi senza ulteriore guadagno. Metodi di transfezione virali di colture ad alta densità come CGN dovrebbero essere evitati come alta efficienza sarà molto difficile distinguere i singoli processi. In CGN, di solito troviamo una correlazione di efficienza di trasfezione e giorni in vitro. Più a lungo i neuroni sono state coltivate, La meno colpita essi saranno da stress trasfezione indotta. Di conseguenza l'efficienza di trasfezione salirà. Inoltre, per concentrarsi sui meccanismi intrinseci di crescita degli assoni e di escludere l'influenza di fattori di crescita derivati da siero presente nei media, CGN può essere coltivato in mezzi di sopravvivenza integrati con l'insulina, un surrogato economici per il insulin-like growth factor 1 (IGF-1 ), che promuove la sopravvivenza neuronale 35. Un cambiamento supporti dal supporto completo per media-insulina contenente deve avvenire sia a DIV DIV 0 o 1 per impedire siero / apoptosi-KCl-ritiro indotta. L'analisi della crescita di dendriti può essere eseguita analogo al saggio di crescita assonale. E 'comunque importante tenere CGN nei media integrato con KCl per simulare l'attività neuronale, che promuove lo sviluppo dendritiche. Analisi della migrazione neuronale deve essere effettuata utilizzando la tecnica di elettroporazione in vivo.
La trasfezione di neuroni in coltura in genere comporta l'cotrasfezione di almeno due plasmidi: un plasmide codificante il marcatore trasfezione, che può essere un plasmide codificante per una proteina fluorescente (GFP ad esempio) o B-galattosidasi, e sia RNAi o plasmidi iperespressione. Per garantire la coespressione successo di plasmidi, la dose consigliata di marcatore trasfezione dovrebbe essere del 10% della quantità totale di DNA (2-2,5 mg / pozzetto di una piastra da 24 pozzetti). Abbiamo già stabilito che la transfezione di uguali quantità di DNA (GFP insieme DsRed) risultati in oltre l'85% dei neuroni coexpressing due plasmidi 22,24. Dovrebbe knockdown, sovraespressione o l'esposizione a piccole molecole di indurre la morte delle cellule neuronali, un plasmide codificante Bcl-XL può essere cotransfected per garantire la sopravvivenza neuronale, senza effetti sulla morfologia 20. Cotrasfezione fino a tre o quattro plasmidi è anche priva di problemi, che è utile per effettuare epistasi analisi per stabilire un percorso lineare o sinergia di due proteine in assoni e dendriti growth. Qui, due RNAi indipendenti o plasmidi overespressione o una combinazione di entrambi possono essere co-trasfettate con un marcatore trasfezione.
La tecnica di elettroporazione in vivo è un metodo ideale per l'analisi della migrazione neuronale nello sviluppo corteccia cerebellare. È vantaggioso utilizzare cuccioli da un ceppo albino rispetto ad un ceppo con carnagione scura. Inoltre, è più facile da lavorare cuccioli di ratto per la loro cerebella dimensioni più grandi. Nelle nostre mani, quasi tutti cerebella sono GFP-positive, ma in misura diversa. Un cervelletto ben elettroporato-ha molte centinaia di neuroni GFP-positive, un cervelletto mal transfettate inferiore a 100. Con un po 'di pratica, è anche possibile utilizzare topi se sono richiesti topi transgenici per lo studio. Questo metodo è molto più veloce rispetto alla generazione di topi transgenici e consente per l'analisi delle diverse condizioni (perdita-di-funzione, guadagno-di-funzione e struttura-funzione-analisi). IVE non rrichiedere talune stereotaxis, una lampada a collo d'oca è sufficiente per rilevare il cervelletto di un cucciolo albino abbastanza traslucido. Questo sarà anche ridurre il tempo di procedura per cuccioli e una breve anestesia con isoflurano suffissi. Lo fa però richiedono un po 'di pratica per indirizzare la regione corretta e quindi a padroneggiare la tecnica.
Problemi di sviluppo causati da knockdown o sovraespressione sono insignificanti a causa della manipolazione genetica regionalizzata del cervelletto. Questo permette l'analisi di meccanismo intrinseco come i risultati di elettroporazione in un mosaico di neuroni geneticamente modificati incorporati in un ambiente di tipo selvatico. Lo svantaggio è che i ratti o topi elettroporate non possono essere sottoposti a prova comportamentale a causa della bassa quantità di neuroni trasfettati. Per garantire la coexpression di plasmidi nei neuroni, si consiglia l'cotrasfezione con un plasmide codificante GFP (o di qualsiasi altra proteina fluorescente) sotto un promotore specifico neurone per evitare la visuazione delle cellule gliali trasfettate. Effetti che si traducono in una riduzione della lunghezza assonale possono essere facilmente individuati e misurati 24. Al contrario, è tecnicamente impossibile quantificare effetti stimolanti sul assoni in tutta la loro lunghezza non possono essere rintracciati. Defasciculation di fibre parallele tuttavia è misurabile 20. Lo stesso vale per la valutazione della lunghezza dei dendriti di un neurone e 23,24,30 migrazione. Noi di solito svolgiamo le nostre analisi 5 giorni dopo l'elettroporazione. Naturalmente è possibile effettuare l'analisi prima e dopo. Un punto secondo momento si raccomanda di esaminare la formazione di artigli dendritiche 29, che rappresentano la connessione sinaptica tra CGN e fibre di muschio.
Per finalizzare le analisi, è importante scegliere il test statistico appropriato. Per questo, si deve prendere in considerazione se i valori dei gruppi seguono una distribuzione normale (ad esempio assonale o dendriti lunghezze) e se 2 o mminerale di 2 gruppi sono inclusi nell'analisi. Per i 2 gruppi, usiamo test di Student, per più di 2 gruppi ANOVA. Qualora i valori di seguire una distribuzione non-normale (per esempio la distanza di migrazione), test di Mann Whitney U e test di Kruskal Wallis devono essere utilizzati, rispettivamente, per 2 o più di 2 gruppi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo N. Schwedhelm-Domeyer per l'eccellente assistenza tecnica, C. Martello e S. Papiol per un aiuto con analisi statistiche. Il nostro lavoro è finanziato dalla Max Planck Society, la Deutsche Forschungsgemeinschaft, il Center for Nanoscale Microscopia e Fisiologia Molecolare del cervello (CNMPB), Göttingen, Germania e dal GGNB Junior Gruppo Stipend dell'Università di Göttingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isoflurane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 G | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
References
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