Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Genetisk manipulering av Lillehjernen Granule Neuroner Published: March 17, 2014 doi: 10.3791/51070
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Cellular and Molelcular Neurobiology, Max Planck Institute of Experimental Medicine, 2Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB)

Summary

Nevronale morphogenesis og migrasjon er avgjørende hendelser som ligger til grunn riktig hjernens utvikling. Her beskriver vi metoder for å manipulere genetisk dyrkede lillehjernen granule neuroner og utviklingslillehjernen for vurdering av morfologi og trekkende karakteristikker av nerveceller.

Abstract

Utviklings hendelser i hjernen inkludert nevronale morphogenesis og migrasjon er sterkt orkestrert prosesser. In vitro og in vivo-analyser gir mulighet for en grundig karakterisering å identifisere stier involvert i disse hendelsene. Lillehjernen granule neuroner (CGNs) som er utledet fra utviklingslillehjernen er en ideell modell system som gjør det mulig for morfologiske analyser. Her beskriver vi en metode for hvordan man skal manipulere genetisk CGNs og hvordan å studere axono-og dendritogenesis av enkelte nerveceller. Med denne metoden effekten av RNA-interferens, overekspresjon eller små molekyler kan bli sammenlignet med kontroll neuroner. I tillegg er den gnager cerebellar cortex en lett tilgjengelig in vivo-system på grunn av sin dominerende postnatal utvikling. Vi presenterer også en in vivo electroporation teknikk for å manipulere genetisk utviklings cerebella og beskrive påfølgende lillehjernen analyser for å vurdere neuronal morfologi ennd migrasjon.

Introduction

Den cerebellum er et utmerket system for å studere mekanismene for axon vekst og migrering. Lillehjernen har vært gjenstand for anatomiske studier siden tidenes morgen nevro en. Moderne mikroskopi og immunhistokjemiske teknikker har betydelig utvidet og videreutviklet de første funnene av Santiago, Ramon, og Cajal 2-4. Muse genetikk og molekylær studier avdekket vesentlige vekst og transkripsjonsfaktorer i kontroll av lillehjernen utvikling, noe som førte til større forståelse for viktige hendelser som kreves for riktig kabling av forskjellige typer nevroner inkludert lillehjernen granule neuroner (CGNs) 5-7.

Lillehjernen er et derivat av rhombomere en av utviklings hindbrain åtte. Den rombiske leppe, som er en del av taket av 4 th hjertekammer, gir opphav til cerebellare granule neuron stamceller, som vil utgjøre den mest tallrike neuronal populasjon ivoksen cerebellum ni. Etter rostral migrasjon, de ender opp i lillehjernen anlage. Her, mitose av granule neuron forløpere fører til dramatisk utvidelse av den eksterne granulær laget (EGL), som finner sted etter fødselen hos gnagere. Fra EGL, nerveceller begynner å migrere innover gjennom den molekylære lag (ML), forbi Purkinje cellelaget til slutt å ta seg ned i det indre granulære sjikt (IGL 2). I løpet av denne trekkprosessen, skaffe de en bipolar form med to axoner som strekker seg inn i den ML. Ved videre migrering, migrerer cellelegemet bort fra axoner og de ​​to prosesser som smelter for å danne en gaffelformet, T-formet axon 10.. Deretter ble disse axoner fasciculate og blir referert til som parallelle fibre. Etter å ha avgjort i IGL, CGNs vokse dendritter, som danner dendrittiske klør for å etablere synapser med mosegrodde fibre. For å undersøke de grunnleggende prosesser i utviklingen av lillehjernen, et kombinert in vitro og in vivo approach åpner for pålitelige resultater og konklusjoner.

CGNs ikke bare er de mest tallrike nevroner i cerebellum, men i hele hjernen og kan bli dyrket til høy renhet 11-13. I kultur, blir dette svært homogen nevronale befolkningen raskt postmitotic og får en polar morfologi med lett identifiserbare axoner og dendritter. Dyrkede CGNs har vist seg å være svært nyttig å studere ulike aspekter av nevronale utvikling inkludert stamfar spredning, differensiering, aksonal og Dendritt utvikling, neuronal migrasjon, apoptose og elektrofysiologiske egenskaper (14-19 og mange andre). Bruk av genetisk manipulasjon har utvidet allsidighet av dyrkede CGNs og lov for videre mekanistisk innsikt i de nevnte hendelsene. Transfeksjon av dyrkede nevroner bruker laveffektivt kalsiumfosfat eller lipofile metoder etterfulgt av immunocytochemistry med polaritet markører eller programvare-støttet analyse facilitates vurderingen av f.eks morfologien av individuelle nevroner i en tett neuronal kultur. Med denne tilnærmingen, kan rollen som proteiner av interesse i akson eller Dendritt vekst studeres 20-25,26-28. Denne kulturen systemet er imidlertid mindre nyttig å analysere neuronal migrasjon som migrasjon er svært begrenset i høy tetthet kulturer og ville kreve cocultures. Den in vitro-analyse av akson-og dendritt vekst gjør det også mulig for undersøkelse av sammenknyttede proteiner av en signalveien ved hjelp av kombinasjoner av RNA interferens (i), over-ekspresjon eller små molekyler.

Å etablere relevansen av proteinet av interesse i akson og Dendritt vekstregulering eller neuronal migrasjon, in vivo electroporation (IVE) teknikken gjør det mulig for analysen i utviklingslillehjernen cortex. På grunn av det faktum at cerebellar utvikling hos gnagere strekker seg helt inn i de to første uker etter fødselen, representerer cerebellum en accessible hjernestruktur for genetiske manipulasjoner for å undersøke utviklingen av aksoner og dendritter, neuronal migrasjon, synaptogenesis og apoptose 20-24,29,30,26,27,31-34. I tillegg er også nyttig for andre aspekter av neuronal utvikling som krever intakt lillehjernen cortex som axon pathfinding, kabling og tilkobling av nerveceller og nervecellen-gliaceller interaksjoner tatt sammen denne modellen system, gir denne protokollen in vitro og in vivo teknikker for å takle en komplementær tilnærming om nevronale morphogenesis og migrasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

CGNs kan være forberedt enten fra postnatal dag (P) 5 museunger eller P6 rotteunger. For å følge en protokoll, som er beskrevet av Bilimoria og kolleger, som bruker en mitotisk inhibitor for å selektere for postmitotic CGNs 13.

Etikk uttalelse:
Alle forsøk med levende dyr har blitt utført i henhold til dyr protokollen godkjent av "Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit" av Niedersachsen, Tyskland.

In vitro-analyse:

En. Utarbeidelse av DNA plasmid, Media, og buffere for kalsiumfosfat Transfection Method

  1. Løs opp plasmid DNA i steril, endotoxin-fritt vann; DMEM (høy glukose), gjør 2,5 M CaCl 2, gjør 2x HBSS (oppløse 4 g NaCl, 0,1775 g KCl, 0.095 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,675 g glukose og 2,5 g HEPES i 250 ml ultrarent vann, og justere pH til 7.05, 7.08, og 7.11). Merk: Når du forbereder2x HBSS løsning, test som pH gir best resultat om transfeksjon effektiviteten av gitt kombinasjon av plasmider.

2. Transfeksjon av kultivert Neuroner

Figur 1
Figur 1. Flytskjema for in vitro-axon og dendritt vekst assay. Cultured CGNs (24-brønns plate med glass dekkglass), isolert fra rotteunger P6, blir transfektert ved DIV 0 eller 1 med DNA-bunnfallet inneholdende en fluorescent markør transfeksjon (f.eks GFP). Etter fiksering og immunocytochemistry, er nevroner avbildet i en blindet måte. Bildene er importert til ImageJ og prosesser måles. Målingene blir deretter behandlet ved hjelp av en statistisk program.

  1. Seed CGNs (20 x 10 6 per 24-brønns plate; BME, 10% kalveserum, 2 mM Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PSG), 25 mM KCl) på salpetersyre-vasket, polyornithine belagt 12 mm glassDekk i en 24-brønns plate med 500 mL av media per brønn.
  2. På dag in vitro (DIV) 0 (minst 8 timer etter plating) eller DIV 1, samle vekstmedier og holde ved 37 ° C. Vask nevroner to ganger med 500 mL av forvarmet DMEM og tilsett 500 mL av DMEM.
  3. Plasser nevroner i inkubator (37 ° C, 5% CO 2) i 45 min.
  4. Forbered 40 pl DNA-bunnfallet for hver brønn ved å blande: DNA (2-2,5 ug / brønn, 10% av total-DNA bør være en transfeksjon markør f.eks GFP å visualisere transfekterte neuroner), vann (inntil 18 ul), tilsett 2 pl av 2,5 M CaCl 2, bland godt og tilsett 20 mL av 2x HBSS.
    1. Inkuber DNA utfelling for 5 min ved RT.
  5. Legg DNA-bunnfallet til hver brønn og inkuber nevroner etter 18 min i inkubatoren.
  6. Fjern DMEM / DNA mix og vaske nevroner to ganger med 500 mL av prewarmed DMEM.
  7. Legg innsamlet media fra trinn 2.2 tilbake til nerveceller. Hvis nevroner vil være i kultur i mer enn tre dager, supplement media med 25 mM glukose på DIV tre å fylle karbonkilde.
  8. Etter 1-5 dager, med forbehold nevroner til immunocytochemistry hjelp GFP antistoffer.
  9. Dette bildet er minst 30 individuelle nevroner pr tilstand i en blindet måte ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.

Tre. Mål Axoner og dendritter med NeuronJ, en NIH ImageJ Plugin

Viktig: Sørg for at bildene blir skalert correctluy ved å bruke riktig pixel: mikrometer forhold avhengig av forstørrelse og oppløsningen på bildet.

  1. Konvertere bilder til 8-bit med ImageJ: Åpne bildet, velg 'Bilde' -> 'Type' -> '8-bit '->' Lagre 'image.
  2. Kjør NeuronJ plugin og åpne 8-bits bilde.
    skjermbilde
  3. Bruk "Legg tracings 'mulighet til å spore aksonet: click venstre museknapp en gang på begynnelsen av aksonet og bevege musa langs prosessen. Dobbelklikk på tuppen av axon hvis spor kamper aksonal form.
    skjermbilde
    Merk: Dersom det foreslåtte spor avvike fra aksonal form, klikk en gang på axonal prosess for å forankre spor, og dobbeltklikk på tuppen av axon.
  4. Klikk på 'Mål tracings', velge 'Vis tracing målinger alternativet og trykker "Kjør". Axon målingene er alle vises i et nytt vindu. For dendritter, velge 'Vis gruppe målinger alternativ "og trykk" Kjør ".
    skjermbilde
    Totalt dendrite målinger er alle vises i et nytt vindu. Lagre dem som en egen fil som kan åpnes i alle regnearkprogram.
  5. Alternativt for manuell tracing, bruker Fiji programvare: Høyreklikk på the 'Rett linje' valget, velg 'Freehand linje ",
    skjermbilde
    holde venstre museknapp inne og manuelt spore prosessen, trykk Ctrl + M "for å måle.
  6. Beregn gjennomsnittlig axonal / dendrittiske lengde per stand og bruke riktig statistisk test.

    In vivo electroporation:

En. Utstyr og klargjøring av reagenser

  1. Du trenger 30 G nåler, spacer (1-2 mm), sprøyte, døde volum redusering (DVR), electroporator og tweezertrodes, oppvarming puten eller infrarød varmelampe, gooseneck lampe og isofluran.
  2. Sett DVR inn nålen, deretter legge nål til å sprøyte, og til slutt sette spacer på nålen (figur 2).
    Fig. 2
    Figur2. Fremstilling av nålen. Dvr er kuttet av en 200 ul pipette og plassert i kanylen for å redusere dødvolumet. Spacer er avledet fra en 200 mL lastespissen og er plassert på enden av nålen for å regulere dybden av gjennomtrengning inn i cerebellum til omtrent 2 mm. Ruler enheter: cm
  3. Løs opp DNA i PBS/0.03% Fast Grønn. Merk: Når en transfeksjon markør, er det fordelaktig å anvende en fluorescerende protein som er under en neuron-spesifikk promoter (f.eks synapsin) til bare å visualisere neuroner. 25% av det totale plasmid mengden bør være plasmid som koder for transfeksjon markør.
  4. Gjør 70% etanol.
  5. Bland like volumer av oktober og 30% sakkarose ble oppløst i PBS.
  6. Fyll sprøyte med 4 pl av DNA (4 mikrogram / mikroliter av plasmid-DNA i PBS/0.03% Fast grønn).

2. IVE av rotteavkom

Flytskjema av IVE: se figur 3


Figur 3. Flytskjema for in vivo elektroporering. P4 rotteunger blir bedøvet med isofluran, og plasmid-DNA som koder for en fluorescerende markør transfeksjon (f.eks GFP) injiseres i lillehjernen, etterfulgt av eksponering for 5 elektriske pulser. Fem dager senere blir isolert GFP-positive cerebella seksjonert og utsatt for immunohistokjemi. Bildene er tatt med et konfokalmikroskop og analysert ved hjelp av Imaris programvare. Opplysninger blir behandlet med et statistikkprogram.

  1. Bruk P4 rotteunger fra albino stamme (Wistar eller Long Evans).
  2. Anesthetize valper (etter hverandre) med isofluran i liten boks (f.eks P1000 pipettespissen boks) med 200 mL av isofluran (dynket i vev) for 1-2 min før valpen er ikke lenger beveger seg. Pass på at valpene ikke får i kontakt with Iiquid isofluran. Monitor tid tett som enkelte unger reagerer forskjellig på anestesi.
  3. Steriliden av valp hode med 70% etanol.
  4. Fix leder av valpen mellom tommelen og pekefingeren og bruke gooseneck lampe for å finne lillehjernen av albino valp. Den tverrgående sinus kraftig avgrenser midthjernen (overlegen og underlegen colliculus) fra hjernebark halvkuler (figur 3). Lillehjernen er plassert ved siden av midthjernen og vises i en mørkere nyanse. Bruk en permanent markør for å indikere lillehjernen med en prikk. Viktig: Hold valpen i fast stilling! Merk: Bør anestesi slites av i løpet av denne prosedyren, utsett valpen å isofluran før injisere DNA.
  5. Sett nålen (figur 3) og langsomt injisere 3 pl av DNA inn i cerebellum.
  6. La DNA løsning diffuse i 30-60 sek.
    1. Plasser leder av pup mellom tweezertrodes, slik at minus-pol kommer i kontakt med baksiden av hodet (cerebellar-regionen), og at pluss-pol i kontakt med den motsatte siden av hodet (fig. 3).
    2. Subject valp til fem elektriske pulser. Juster spenning til vekten av avkom for å sikre god electroporation effektivitet uten å svekke deres overlevelse (tabell 1).
      Vekt Spenning Puls Intervall
      8-9 g 160 V 50 msek 950 msek
      9-10 g 165 V 50 msek 950 msek
      > 10 g 170 V 50 msek 950 msek
      Tabell 1. Electroporation av P4 rotteunger.
    3. La ungene komme seg på oppvarmet pad eller under en infrarød lampe. Returner valper til demningen. Viktig: Kontroller at varmekilden ikke påfører noen brannskader.
  7. Sacrifice valpene fem dager etter elektroporering ved å plassere dem i CO 2 etterfulgt av halshogging.
    1. Isoler cerebella og skjermen for GFP-positive de cerebella bruker et fluorescerende mikroskop.
  8. Fiks cerebella i 4% PFA O / N ved 4 ° C, og deretter inkuberes i 30% sukrose ved 4 ° C inntil cerebella synke til bunnen av røret.
  9. Embed cerebella i OCT/30% sukrose og kutte 40 mikrometer koronale seksjoner ved hjelp av en kryostat. Merk: Seksjon hver lillehjernen i en blindet måte.
  10. Subject seksjoner til immunhistokjemi hjelp av GFP antistoff. Counterstain med kjernefysisk fargestoff (DAPI eller Hoechst 33258) og bestemme lokalisering av minst 200 transfekterte nevroner per dyr.
  11. For en grundig analyse, dele opp IGL i halvdeler, som resulterer i en øvre IGL mot ML og en lavere IGL vendt hvit substans og telle GFP-positive nevroner bosatt i hver halvdel. Merk: Telle GFP-positive nevroner av hver del i en blindet måte.

    Tre. Måle Dendrite Lengde, Acquire Bildene av den delen av x, y, z Plane Bruke en konfokalmikroskop

    Merk: for eksempel bruke 40 bilder for en 40 mikrometer seksjon med en z-stwp av en mikrometer.

    1. Åpne bildeserien i programvaren, Imaris, å generere et 3D-bilde av dendritter.
    2. Klikk på "overgå"-modus for å se nervecelle i 3D.
      skjermbilde
    3. Velg "Legg til ny filament" og klikk "Skip automatisk oppretting 'for å starte halvautomatisk sporing.
      skjermbilde
      Merk: Analysere hver 3D-bilde i en blindet måte
    4. Velg Tegn 'og' AutoPath '.
      skjermbilde
    5. Flytt musepekeren på cell kropp og Shift + mus høyreklikk for å velge cellen kroppen. Merk: Autocalculation av programvaren kan kreve noen få minutter.
      skjermbilde
    6. Legg stier til filament (dendrite) bruker Shift + musen til venstre klikk. Merk: Baner kan visualiseres i sanntid.
      skjermbilde
    7. Gå til gløde statistikk vinduet og klikk på 'avansert', 'Spesifikke verdier "og" Filament dendrite lengde (sum)' for summen av total Dendritt lengde.
      skjermbilde
    8. Bruk egnede statistiske tester for å analysere data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å analysere morfologi CGNs i respons til forskjellige dyrkningsbetingelser, vi transfektert neuronene på DIV 0 som beskrevet ovenfor. Etter transfeksjon ble det lagt et sett av nerveceller i full medium (BME, 10% kalveserum, 2 mM PSG, 25 mM KCl) og et annet sett i minimalt medium inneholdende insulin (BME, 25 mM glukose, 2 mM PSG, 10 pg / ml insulin). Vi underkastet neuronene i immunocytokjemi ved hjelp av GFP-antistoff ved DIV 1, 2 og 3, etterfulgt av måling av aksoner og dendritter for apparatet 1 og aksoner bare for settet 2.. På grunn av serum og KCl, som gir vekstfaktorer og etterligne neuronal aktivitet, henholdsvis, axoner og dendritter utviklet og vokste raskt i løpet av tidsvinduet er angitt (Figur 4A). Aksonal vekst av settet 2 var hovedsakelig en følge av iboende stimulering og dermed sterkt redusert. Dendritter imidlertid ikke klart å utvikle seg på grunn av den manglende serum og KCl, som stimulerer dendritt vekst (figur 4B).


Figur 4 Analyse. For axon og dendritt vekst i CGNs (A, B) CGNs, transfektert med et plasmid som koder GFP ved DIV 0, ble dyrket i 1, 2, eller 3 dager i enten komplett medium (A) eller BME supplert med insulin (B). Etter fiksering, ble nevroner utsatt for immunocytochemistry hjelp av GFP antistoff og axon og dendrite lengder ble målt. En total på 82 (A) og 65 (B) neuroner ble målt (ANOVA, * p <0,05, *** p <0,001, betyr + sem). Hvite piler og gule pilspisser tyder axoner og dendritter, henholdsvis. Scale bar tilsvarer 100 mikrometer. Vennligst klikk her for å seen større versjon av denne figuren.

For å utføre morfologisk analyse av rotte cerebella, vi utsettes P4 pups å ive som beskrevet ovenfor og isolert cerebella 5 dager senere. Immunhistokjemi av 40 mikrometer koronale cryosections avslørte at 86% GFP-positive nevroner nedstammet fra EGL inn i IGL (figur 5A). Blant disse, ble 50% observert i den øvre del av EGL og 36% migrerte lenger inn i den nedre del av IGL. Vi har også bestemt Dendritt vekst på tre uavhengige electroporated cerebella og sammenlignet gjennomsnittslengder (Figur 5B).

Figur 5
Figur 5. Analyse av neuronal migrasjon og Dendritt lengde i in vivo electroporated cerebella. Cerebella avP4 rotteunger ble elektroporert med pSyn-GFP plasmid og isolert 5 dager senere. 40 mikrometer koronale seksjoner ble underkastet immunhistokjemi hjelp av GFP-antistoff. (B) Lokalisering av CGNs i cerebellum ble vurdert. (Kruskal Wallis, Mann Whitney korreksjon, * p <0.05, *** p <0,001) (B) Total Dendritt lengde ble målt ved hjelp av Imaris programvare (ANOVA, Bonferronikorreksjon, ns = nonsignificant, mener + sem). Pilene angir CGN celle organer. Pilspisser tyder dendritter. Scale bar lik 50 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordeler og ulemper ved den beskrevne in vitro-og in vivo-metoder:

Dyrkede CGNs fra mus og rotter er like godt egnet for morfologiske analyser. På grunn av større størrelse med en rotte lillehjernen, utbyttet av CNG og står fra rotteunger overgår museunger 3-4x. Bortsett fra CGNs kan kortikale og hippocampus-neuroner bli brukt som kultursystem i tillegg. Den kalsiumfosfatmetoden resulterer i en lav (0,01 til 5%) transfeksjon effektivitet, noe som er ønsket å analysere morfologi av individuelle neuroner. Alternative lipofile transfeksjonsmetoder kan anvendes også, men er svært dyre uten ytterligere forsterkning. Viral transfeksjonsmetoder av høy tetthet kulturer som CGNs bør unngås så høye effektivitet vil gjøre det svært vanskelig å skille enkeltprosesser. I CGNs, vi vanligvis finne en korrelasjon av transfeksjon effektivitet og dager in vitro. Jo lenger nervecellene har blitt dyrket, Jo mindre påvirket vil de være ved transfeksjon induserte stress. Som en konsekvens transfeksjon effektivitet vil gå opp. Også, for å fokusere på iboende mekanismer for axon vekst og utelukke innflytelsen av vekstfaktorer avledet fra serum til stede i mediet, CGNs kan dyrkes i overlevelse media supplert med insulin, et billig surrogat for insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF-1 ), som fremmer neuronal overlevelse 35.. En medie endring fra full media til insulin inneholder media må være enten på DIV 0 eller DIV en å hindre serum / KCl-uttak-indusert apoptose. Analysen av dendritt vekst kan utføres analogt med axon vekst assay. Det er imidlertid viktig å holde CGNs i medier supplert med KCl for å simulere neuronal aktivitet, noe som fremmer dendrittiske utvikling. Analyse av nevronal migrasjon bør utføres ved hjelp av in vivo elektroporering teknikk.

Transfeksjon av dyrkede nevroner vil vanligvis medførecotransfection av minst to plasmider: et plasmid som koder for transfeksjon markør, som kan være et plasmid som koder for ett fluorescerende protein (f.eks GFP) eller b-Galactosidase, og enten RNAi-eller overekspresjon plasmider. For å sikre en vellykket coexpression av plasmider, bør den anbefalte mengde av transfeksjon da være 10% av den totale mengde DNA (2-2,5 ug / brønn av en 24-brønns plate). Vi har tidligere fastslått at transfeksjon av like mengder DNA (GFP sammen med DsRed) resulterer i mer enn 85% av nevroner coexpressing de to plasmider 22,24. Skulle knockdown, overuttrykk eller eksponering for små molekyler indusere neuronal celledød, kan et plasmid som koder BCL-XL bli kotransfekteres å sikre nevronale overlevelse uten effekter på morfologi 20. Cotransfection på opp til tre eller fire plasmider som også er uproblematisk, som er nyttig for å utføre epistasis analyser for å etablere en lineær bane eller synergi av to proteiner i axon eller dendrite growth. Her kan to uavhengige RNAi eller overekspresjon plasmider eller en kombinasjon av begge kan kotransfekteres sammen med en transfeksjon markør.

Den in vivo elektroporering teknikk er en ideell metode for analyse av neuronal migrasjon i å utvikle cerebellar cortex. Det er av fordel å bruke avkom fra en albino belastningen i forhold til en belastning med mørkt utseende. Dessuten er det lettere å jobbe med rotteunger på grunn av sin større størrelse cerebella. I våre hender, nesten alle cerebella er GFP-positive, men i forskjellig grad. En godt electroporated lillehjernen har mange hundre GFP-positive nevroner, en dårlig-transfektert cerebellum mindre enn 100. Med litt øvelse, er det også mulig å anvende mus hvis transgene mus som er nødvendig for undersøkelsen. Denne metoden er betydelig raskere enn den generasjonen av transgene mus, og det gir mulighet for analyse av ulike forhold (tap-av-funksjon, gevinst-av-funksjon og struktur-funksjon-analyser). IVE ikke require Stereotaxis, er en svanehals lampe tilstrekkelig til å oppdage lillehjernen av en ganske gjennomsiktig albino valp. Dette vil også bli forkortet prosedyre tid per valp og en kort anestesi med isofluran tilstrekkelig. Det krever imidlertid litt øvelse å målrette den riktige regionen og dermed til å mestre teknikken.

Utviklingsproblemer forårsaket av knockdown eller overekspresjon er ubetydelig på grunn av regionalisert genetisk manipulering av lillehjernen. Dette gjør det mulig for analyse av iboende mekanisme som electroporation resulterer i et mosaikkmønster av genetisk-modifiserte nerveceller innleiret i et villtype-omgivelse. Ulempen er at de electroporated rotter eller mus ikke kan bli utsatt for atferds test på grunn av den lave mengden av transfekterte nevroner. For å sikre coexpression av plasmider i nevroner, anbefaler vi cotransfection med et plasmid koding GFP (eller hvilken som helst annen fluorescerende protein) under et nevron-promoter for å unngå visualizasjon av transfekterte gliaceller. Effekter som resulterer i en reduksjon av aksonal lengden kan lett oppdages og målte 24. I motsetning til dette er det ikke teknisk mulig å kvantifisere stimulerende virkninger på aksoner som hele sin lengde ikke kan spores. Defasciculation av parallelle fibre er imidlertid measureable 20. Det samme gjelder for vurderingen av dendrite lengde og neuronal migrasjon 23,24,30. Vi vanligvis utfører våre analyser fem dager etter electroporation. Det er selvsagt mulig å utføre analysen tidligere og senere. En senere tidspunkt er det anbefalt å undersøke dannelsen av dendrittiske klør 29, som representerer den synaptiske forbindelsen mellom CGNs og mose fibre.

For å sluttføre analysene, er det viktig å velge riktig statistisk test. For dette må man ta hensyn til hvis verdiene av gruppene følge en normalfordeling (f.eks aksonal eller dendritter lengder), og hvis to eller mmalm enn to grupper er inkludert i analysen. For to grupper, vi bruker Student test, for mer enn to grupper ANOVA. Dersom verdiene følge en ikke-normalfordeling (f.eks migrering avstand), Mann-Whitney U-test og Kruskal Wallis test må benyttes for to eller flere enn to grupper, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker N. Schwedhelm-Domeyer for utmerket teknisk assistanse, C. Hammer og S. Papiol for hjelp med statistiske analyser. Vårt arbeid er finansiert av Max Planck Society, Deutsche Forschungsgemeinschaft, Senter for nanoskala Mikros, og molekylær fysiologi av hjernen (CNMPB), Göttingen, Tyskland og ved GGNB Junior Gruppe stipend på Universitetet i Göttingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 11960-044
BME Gibco 41010-026
Insulin Sigma-Aldrich Si-1-4011
Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich P-2533
CaCl2 Appli-Chem A3652
Isoflurane Actavis Deutschland
Tissue-Tek OCT Sakura
ECM 830 and tweezertrodes Harvard Apparatus
Epifluorescence microscope and camera Nikon
SP2 confocal microscope Leica
ImageJ NIH
Imaris 7.4.2 Bitplane, Inc.
GraphPad Prism GraphPad Software, Inc.
MS Excel Microsoft
Loading tip 1-200 µl Costar 4853
Pipette tip 200 µl Sarstedt 70.760.502
Microlance 3 needle, 30 G BD 302200
50 µl gastight Syringe 1705 Hamilton
Glass coverslips  Thermo Scientific Menzel Glaeser CB00120RA1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cajal, S. R. Histology of the nervous system of man and vertebrates. , Oxford University Press. (1995).
  2. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
  3. White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. , (2012).
  4. Palay, S. L., Chan-Palay, V. Cerebellar cortex: cytology and organization. , Springer. (1974).
  5. Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation. Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum. Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).
  8. Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
  9. Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
  10. Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes. Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).
  11. Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. Cellular and molecular neuroscience. , MIT Press. 419-41 Forthcoming.
  12. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J. Vis. Exp. , (2009).
  13. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Rivas, R. J., Hatten, M. E. Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).
  15. Kuhar, S. G., et al. Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation. Development. 117, 97-104 (1993).
  16. Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro. J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).
  17. Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).
  18. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
  19. Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells. Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).
  20. Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain). Science. 303, 1026-1030 (2004).
  21. Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis. J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).
  22. Stegmuller, J., et al. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-400 (2006).
  23. Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation. PLoS One. 7, (2012).
  24. Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth. Development. 139, 3600-3612 (2012).
  25. Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis. Neuron. 41, 229-241 (2004).
  26. Yang, Y., et al. A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation. Science. 326, 575-578 (2009).
  27. Litterman, N., et al. An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning. PLoS Biol. 9, (2011).
  28. Kim, A. H., et al. A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons. Cell. 136, 322-336 (2009).
  29. Shalizi, A., et al. A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation. Science. 311, 1012-1017 (2006).
  30. Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration. PLoS One. 8, (2013).
  31. Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nat. Neurosci. , (2011).
  32. Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).
  33. Huynh, M. A., et al. An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain. Neuron. 69, 930-944 (2011).
  34. de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain. Neuron. 72, 22-40 (2011).
  35. Calissano, P., et al. Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).

Tags

Neuroscience aksoner dendritter neuronal migrasjon lillehjernen kultiverte nevroner transfeksjon,
Genetisk manipulering av Lillehjernen Granule Neuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em&gt; Å studere nevrale morfologi og migrasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holubowska, A., Mukherjee, C.,… More

Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmüller, J. Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration. J. Vis. Exp. (85), e51070, doi:10.3791/51070 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter