Summary
Нейронов морфогенез и миграция являются важными события, лежащие в основе правильного развития мозга. Здесь мы описываем методы, чтобы генетически манипулировать культивируемые мозжечка гранул нейронов и развивающийся мозжечок для оценки морфологии и миграционных характеристик нейронов.
Abstract
Развивающие события в мозге в том числе нейронов формообразования и миграции высоко организованы процессы. В пробирке и в естественных анализирует позволяют для характеризации углубленного выявления путей, вовлеченных в эти события. Мозжечка гранул нейроны (КСГН), которые получены из развивающихся мозжечка являются идеальной моделью системы, которая позволяет морфологического анализа. Здесь мы опишем метод того, как генетически манипулировать КСГН и как учиться axono-и dendritogenesis отдельных нейронов. С помощью этого метода эффекты интерференции РНК, повышенной экспрессией или малых молекул может быть по сравнению с контрольными нейронов. Кроме того, грызун коры мозжечка является доступным в системе естественных условиях в связи с его преимущественным развитием послеродовой. Мы также представляем естественных условиях технику электропорации в генетически манипулировать развивающийся мозжечка и описать последующую мозжечка анализирует оценить нейронов морфологии Aй миграции.
Introduction
Мозжечок является отличной системой для изучения механизмов роста аксона и миграции. Мозжечок является предметом анатомических исследований с незапамятных неврологии 1. Современная микроскопия и иммуногистохимические методы значительно расширили и уточнили первоначальные открытия, Сантьяго, Рамон, и Cajal 2-4. Генетика мыши и молекулярные исследования обнаружили существенный рост и транскрипционных факторов в контроле развития мозжечка, что привело к большему пониманию важнейших событий, необходимых для правильного подключения различных типов нейронов в том числе мозжечка гранул нейронов (КСГН) 5-7.
Мозжечок является производным ромбомере 1 развивающегося заднего мозга 8. Ромбическая губа, которая является частью крыши 4-го желудочка, приводит к мозжечка гранул нейронных клеток-предшественников, которые будут составлять самую многочисленную нейронов населения ввзрослых мозжечок 9. После ростральной миграции, они располагаются в коре зачатка. Здесь, митоз гранула нейронных предшественников приводит к резкому расширению внешнего зернистого слоя (EGL), который проходит после рождения у грызунов. Из EGL, нейроны начинают мигрировать внутрь через молекулярного слоя (ML), мимо слой клеток Пуркинье в конечном итоге поселяются во внутреннем зернистого слоя (IGL 2). Во время этого миграционного процесса, они приобретают биполярную форму с двумя аксоны, проходящий в ML. После дальнейшей миграции, тело клетки мигрируют от аксонов и эти два процесса сливаются, образуя один раздвоенный, Т-образные аксон 10. Впоследствии эти аксоны расположенный пучком и называются параллельными волокнами. Поселившись в IGL, КСГН расти дендриты, которые образуют дендритные когти установить синапсы с мшистых волокон. Чтобы исследовать фундаментальные процессы в развивающемся мозжечке, объединены в пробирке и в естественных условиях approacч позволяет надежных результатов и выводов.
КСГН не только самые многочисленные нейроны мозжечка, но из всей мозга и может быть культурным в высокой степени чистоты 11-13. В культуре, однако это весьма однородной нейронов население становится быстро постмитотическими и приобретает полярный морфологию с легко идентифицируемых аксонов и дендритов. Искусственный КСГН оказались чрезвычайно полезными для изучения различных аспектов развития нейронов включая пролиферацию предшественников, дифференциации аксонов и дендритов развития, миграции нейронов, апоптоз и электрофизиологических свойств (14-19 и многие другие). Использование генетических манипуляций расширила универсальность культивируемых КСГН и позволил для дальнейшего механистического понимания вышеупомянутых событий. Трансфекция культивируемых нейронов использованием низким кпд фосфат кальция или липофильные методы следуют иммуноцитохимии с полярностью маркеров или программного обеспечения при поддержке анализа FaciliTates оценку например морфологии отдельных нейронов в плотной нейронов культуры. При таком подходе роль представляющих интерес белков в аксонов или дендритов роста могут быть изучены 20-25,26-28. Эта система культуры, однако, менее полезны для анализа миграцию нейронов, как миграция очень ограничена в культурах с высокой плотностью и потребует совместных культурах. Анализ в пробирке аксона и роста дендритов также позволяет рассмотрении взаимосвязанных белков сигнального пути с использованием комбинации РНК-интерференция (I), сверхэкспрессии или малых молекул.
Для установления актуальность интересующего белка в аксона и регуляции роста дендритов или миграции нейронов, электропорации в естественных условиях (IVE) метод позволяет для анализа в развивающихся коры мозжечка. Благодаря тому, что мозжечковая развитие у грызунов проходит путь в первых двух недель постнатального, мозжечок представляет собой accessibструктура мозга ле для генетических манипуляций с целью рассмотрения развития аксонов и дендритов, миграцию нейронов, синаптогенез и апоптоз 20-24,29,30,26,27,31-34. Кроме того, эта модель системы также полезно для других аспектов развития нейронов, которые требуют неповрежденную коры мозжечка например аксона поиска пути, проводки и подключения нейронов и нейронов-глии взаимодействий, вместе взятых, этот протокол обеспечивает в пробирке и в естественных условиях методы для решения дополнительный подход в отношении нейронов формообразования и миграции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
КСГН могут быть получены либо из послеродовой день (P) 5 щенков мыши или P6 крысят. Мы следуем протокол, описанный Bilimoria и коллег, в которой используется ингибитор митоза, чтобы выбрать для постмитотических КСГН 13.
Этика заявление:
Все эксперименты с живых животных были проведены в соответствии с протоколом животных, утвержденной "Verbraucherschutz унд Lebensmittelsicherheit" Нижней Саксонии, Германия.
В пробирке анализа:
1. Подготовка ДНК плазмиды, СМИ, и буферов для фосфата кальция трансфекции Method
- Растворите ДНК плазмиды в стерильной, эндотоксинов воде; DMEM (с высоким содержанием глюкозы); сделать 2,5 М CaCl 2; сделать 2x ССРХ (растворить 4 г NaCl, 0,1775 г KCl, 0,095 г Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,675 г глюкозы и 2,5 г HEPES в 250 мл воды высокой степени очистки и доведения рН до 7,05, 7,08 и 7,11). Примечание: При подготовкерешение 2x ССРХ, тест, рН дает лучшие результаты в отношении эффективности трансфекции данной комбинации плазмид.
2. Трансфекция культивируемых нейронов
Рисунок 1. Блок-схема аксона в пробирке и дендритов анализе роста. Искусственный КСГН (24-луночный планшет с покровные стекла), изолированный от P6 крысят, трансфицируют в DIV 0 или 1 с осадка ДНК, содержащего флуоресцентный маркер трансфекции (например, GFP). После фиксации и иммуноцитохимии, нейроны изображаются слепым методом. Изображения импортируются в ImageJ и процессы измеряются. Измерения затем обрабатываются с использованием статистической программы.
- Семенной КСГН (20 х 10 6 на 24-луночный планшет; BME, 10% сыворотки теленка, 2 мМ пенициллин-Streptomycin-глютамин (PSG), 25 мМ KCl) на азотной кислоты промывают, полиорнитин покрытием 12 мм покровные стекла в 24-луночный планшет с 500 мкл среды на лунку.
- В день в пробирке (DIV) 0 (по крайней мере 8 часов после нанесения покрытия) или DIV 1, собирать средства массовой роста и держать при температуре 37 ° С. Промыть нейроны дважды 500 мкл DMEM нагретого и добавить 500 мкл DMEM.
- Место нейроны в инкубаторе (37 ° C, 5% CO 2) в течение 45 мин.
- Подготовка 40 мкл осадка ДНК для каждой скважины путем смешивания: ДНК (2-2,5 мкг / лунку, 10% от общего ДНК должна быть трансфекции маркер например GFP визуализировать трансфицированными нейроны), вода (до 18 мкл), добавить 2 мкл 2,5 М CaCl 2, хорошо перемешать и добавить 20 мкл 2х HBSS.
- Инкубировать осадок ДНК в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавить осадок ДНК в каждую лунку и инкубировать нейроны в течение 18 минут в инкубаторе.
- Удаление смесь DMEM / ДНК и мыть нейроны дважды 500 мкл нагретого DMЕ.М..
- Добавить собранную СМИ, начиная с шага 2.2 обратно в нейронах. Если нейроны будут в культуре в течение более 3 дней, Дополнение СМИ с 25 мМ глюкозы в DIV 3 пополнить источник углерода.
- После 1-5 дней, при условии нейроны в иммуноцитохимии помощью GFP антител.
- Изображение не менее 30 отдельные нейроны в состоянии в слепым методом с использованием флуоресцентного микроскопа.
3. Измерьте аксонов и дендритов с NeuronJ, в NIH ImageJ Plugin
Важно: Убедитесь, что изображения масштабируются correctluy с помощью соответствующего пикселя: соотношение мкм в зависимости от увеличения и разрешения изображения.
- Преобразование изображения в 8-битных с ImageJ: Открытое изображение, выберите «образ» -> «тип» -> '8 немного '->' изображение Save '.
- Запустите NeuronJ плагин и открыть 8-битное изображение.
- Используйте опцию "Добавить обводка" для отслеживания аксон: CLИк левую кнопку мыши один раз в начале аксона и переместите мышь вдоль процесса. Дважды щелкните на кончике аксона, если след соответствует аксонов форму.
Примечание: В случае, если предложил след отличаться от аксонов форме, один раз нажать на аксонов процесса на якорь след, затем дважды щелкните на кончике аксона. - Нажмите на "Мера начертаний", выбрать "Показать трассировки измерения" пункт и нажмите "Выполнить". Измерения Axon все отображается в новом окне. Для дендритов, выбрать 'измерений Группа индикации опцию' и нажмите 'Run'.
Всего дендритные измерения все отображается в новом окне. Сохранить их в виде отдельного файла, который можно открыть в любой программе электронных таблиц. - В качестве альтернативы для ручной трассировки, использовать программное обеспечение Фиджи: Щелкните правой кнопкой мыши на гоэ опция 'Прямая линия', выберите 'Freehand линию »,
держать левую кнопку мыши и вручную отследить процесс, нажмите 'Ctrl + M "для измерения. - Рассчитать среднюю аксонов / дендритных длину для одного состоянии и использовать соответствующий статистический тест.
В естественных условиях электропорации:
1. Оборудование и Подготовка реагентов
- Вам нужно 30 г иглы, прокладку (1-2 мм), шприц, мертвый объем редуктор (DVR), электропоратора и tweezertrodes, грелку или инфракрасного тепла лампы, гусиная шея лампу и изофлуран.
- Положите DVR в иглу, затем прикрепить иглу в шприц, и, наконец, положить прокладку на иглу (рис. 2).
Фигура2. Подготовка иглы. DVR отрезан пипетки 200 мкл и помещают в иглу, чтобы уменьшить мертвое пространство. Spacer получают из 200 мкл наливного наконечника с и помещают на конце иглы, чтобы регулировать глубину проникновения в мозжечке до приблизительно 2 мм. Единиц измерения: см - Растворите ДНК в PBS/0.03% Быстрый зеленый. Примечание: В трансфекции маркера, выгодно использовать флуоресцентный белок, который находится под нейрона-специфического промотора (например, Synapsin) визуализировать только нейроны. 25% от общего количества плазмидной должно быть плазмидой, кодирующей трансфекции маркер.
- Сделать 70% этанола.
- Смешайте равные объемы октября и 30% сахарозы, растворенного в PBS.
- Заполните шприц с 4 мкл ДНК (4 мкг / мкл плазмидной ДНК в PBS/0.03% Быстрый зеленый).
2. IVE крысят
Блок-схема IVE: см. рисунок 3
Рисунок 3. Блок-схема в естественных условиях электропорации. Щенков P4 крыс анестезируют изофлураном и плазмидной ДНК, кодирующей флуоресцентный маркер трансфекции (например, GFP) вводят в мозжечке, с последующим воздействием электрических импульсов 5. Пять дней спустя, изолированных GFP-положительных мозжечка подразделяются и подвергали иммуногистохимии. Изображения получены с помощью конфокальной микроскопии и проанализированы с помощью программного обеспечения Imaris. Данные обрабатываются с статистической программы.
- Используйте P4 крысят из альбиноса деформации (Вистар или Long Evans).
- не Обезболить щенков (один за другим) изофлураном в небольшой коробке (например P1000 пипетки коробка) с 200 мкл изофлураном (смоченной в ткани) в течение 1-2 мин, пока щенок больше не движется. Позаботьтесь о том, щенки не попасть в контакте соIth Iiquid изофлурана. Монитор время близко, насколько отдельные щенки-разному реагируют на наркоз.
- Стерилизовать затылок щенка с 70% этанола.
- Fix глава щенка между большим и указательным пальцами и использовать гусиная шея лампу, чтобы найти мозжечка альбиноса щенка. Поперечный синус резко разграничивает средний мозг (верхняя и нижняя бугорок) от корковых полушарий (рис. 3). Мозжечок находится рядом с мозга и появляется в более темный оттенок. Используйте несмываемый маркер для обозначения мозжечок с точкой. Важно: Держите щенка в фиксированном положении! Примечание: Если анестезия стираться во время этой процедуры, подвергать щенка изофлураном до инъекционных ДНК.
- Вставьте иглу (рис. 3) и медленно вдохнуть 3 мкл ДНК в мозжечке.
- Пусть решение ДНК диффузного течение 30-60 сек.
- Поместите голову щенка между tweezertrodes так, чтобы отрицательный полюс вступает в контакт с задней части головы (мозжечкаг область) и, что плюс полюсные контакты в противоположную стенку голову (рис. 3).
- Тема щенок до 5 электрических импульсов. Регулировка напряжения на вес детенышей, чтобы обеспечить хорошую эффективность электропорации без ущерба их выживание (табл. 1).
Таблица 1. Электропорация P4 крысят.Вес Напряжение Импульс Интервал 8-9 г 160 В 50 мс 950 мс 9-10 г 165 В 50 мс 950 мс > 10 г 170 В 50 мс 950 мс - Пусть щенки восстановить на нагретой панели или под инфракрасной лампой. Вернуться щенков в Дам. Важно: Убедитесь, что источник нагрева не наносит никаких ожогов.
- Жертвоприношение щенков через 5 дней после электропорации, помещая их в СО 2 с последующим обезглавливания.
- Изолировать мозжечка и экран для GFP-положительных мозжечка с помощью флуоресцентного микроскопа.
- Исправить мозжечка в 4% PFA O / N при 4 ° С, а затем инкубируют в 30% сахарозы при 4 ° С до мозжечка раковиной в нижней части трубки.
- Вставить мозжечка в OCT/30% сахарозы и сократить 40 мкм корональные разделы, используя криостат. Примечание: Раздел каждый мозжечок в слепым методом.
- Тематические секции для иммуногистохимии с использованием GFP антитела. Контрастирующая с ядерным красителем (DAPI или Hoechst 33258) и определить локализацию не менее 200 трансфектированных нейронов на одно животное.
- Для углубленного анализа, разделить IGL пополам, в результате чего в верхней IGL обращенной к ОД и более низкую IGL с видом на белое вещество и считать GFP-положительных нейронов, проживающих в каждом из таймов. Примечание: графа GFP-положительных нейронов каждого раздела слепым методом.
3. Измерение дендритов Длина, Приобретать Изображения Секции по х, у, г Plane Использование конфокальной микроскопии
Примечание: например, использовать 40 изображений на разделе с г-stwp 1 мкм 40 мкм.
- Открыть серии изображений в программном обеспечении, Imaris, для создания 3D-изображение дендритов.
- Нажмите на режиме "Превзойти ', чтобы посмотреть нейрон в 3D.
- Выберите "Добавить новый нить" и нажмите "Перейти автоматическое создание", чтобы начать полуавтоматической трассировки.
Примечание: Анализ каждого 3D-изображения в слепым методом - Выберите вкладку "Ничья" и "Автодорожка '.
- Наведите курсор мыши на слокоть тело и Shift + Щелчок правой кнопкой мыши, чтобы выбрать тело клетки. Примечание: Autocalculation программным обеспечением может потребоваться несколько минут.
- Добавить пути к нити (дендритов) с помощью Shift + Щелчок левой кнопкой мыши. Примечание: Пути могут быть визуализированы в реальном времени.
- Перейдите в окно статистики накаливания и нажмите на кнопку "детальной», «конкретные значения» и «нитей длиной дендритов (сумма)» для суммы общей протяженностью дендритов.
- Используйте соответствующие статистические тесты для анализа данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для анализа морфологии КСГН в ответ на различных условиях культивирования, мы трансфицировали нейроны на DIV 0, как описано выше. После трансфекции мы поместили один набор нейронов в полный среды (BME, 10% телячьей сыворотки, 2 мМ PSG, 25 мМ KCl) и другой набор в минимальной среде, содержащей инсулин (BME, 25 мМ глюкозы, 2 мМ PSG, 10 мкг / мл инсулина). Мы подвергли нейроны в иммуноцитохимии с использованием GFP антитела в DIV 1, 2 и 3, с последующим измерением аксонов и дендритов для набора 1 и аксонов только для набора 2. Благодаря сыворотке и KCl, которые обеспечивают факторы роста и имитировать активность нейронов, соответственно, аксонов и дендритов разработаны и быстро росла в течение временного окна, указанного (рис. 4А). Рост аксонов сета № 2, в основном, следствием внутренней стимуляции и таким образом значительно снижается. Дендриты однако не смог правильно развиваться из-за отсутствия сыворотки и KCl, которые стимулируют роста дендритов (рис. 4б).
Рисунок 4. Анализ аксона и роста дендритов в КСГН (A, B) КСГН, трансфицировали плазмидой, кодирующей GFP в DIV 0, культивировали в течение 1, 2, или 3 дней в любом полной среде (а) или BME с добавлением инсулина (B). После фиксации нейроны подвергали иммуногистохимии с использованием GFP антитела и аксонов и дендритов длины были измерены. В общей сложности 82 (А) и 65 (B) были измерены нейронов (ANOVA, * р <0,05, *** р <0,001, среднее + SEM). Белые стрелки и желтые стрелки указывают аксонов и дендритов, соответственно. Шкала бар составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотретьувеличенное рисунке.
Для выполнения морфологический анализ крыс мозжечка, мы подвергали P4 щенков в IVE, как описано выше и изолированные мозжечка 5 дней спустя. Иммуногистохимия 40 мкм корональных криосрезов показало, что 86% GFP-положительных нейронов сошел с EGL в IGL (Рисунок 5А). Среди тех, 50% наблюдались в верхней части EGL и 36% мигрировали дальше в нижней части IGL. Мы также определили рост дендритов из трех независимых электропорации мозжечка и по сравнению среднюю длину (рис. 5б).
Рисунок 5. Анализ миграции нейронов и длины дендритов в в естественных условиях электропорации мозжечка. МозжечкаP4 крысят были электропорации с плазмиды pSyn-GFP и изолированы 5 дней спустя. 40 мкм Коронарные срезы подвергали иммуногистохимии с использованием GFP антитела. Оценивали (А) Локализация КСГН в мозжечке. (Крускала Wallis, коррекция Манна-Уитни, * р <0,05, *** р <0,001) (B) Общая длина дендритов измеряли, используя программное обеспечение Imaris (ANOVA, коррекция Бонферрони, нс = незначительное, среднее + SEM). Стрелки указывают клеточных тел ХГН. Стрелки указывают дендритов. Шкала бар составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущества и ограничения описаны в пробирке и в естественных условиях методов:
Искусственный КСГН от мыши и крысы одинаково хорошо подходит для морфологического анализа. В связи с большим размером мозжечка крыс, выход АГНКС от крысят превышает щенков мыши 3-4x. Кроме КСГН, корковые нейроны гиппокампа и может использоваться в качестве культуральной системе, а также. Способ фосфат кальция приводит к низкому (0,01-5%) эффективность трансфекции, которые требуется проанализировать морфологию отдельных нейронов. Альтернативные способы трансфекции липофильные можно использовать также, но чрезмерно дороги без дополнительной выгоды. Вирусные способы трансфекции культур с высокой плотностью, таких как КСГН следует избегать, поскольку высокие КПД будет делать это очень трудно отличить отдельные процессы. В КСГН, мы, как правило, найти корреляцию эффективности трансфекции и дней в пробирке. Чем дольше нейроны были культивированы, Менее подвержен влиянию они будут путем трансфекции-индуцированной стрессом. Как следствие, эффективность трансфекции пойдут вверх. Кроме того, чтобы сосредоточиться на внутренних механизмов роста аксонов и исключить влияние факторов роста, полученных из сыворотки, присутствующей в средствах массовой информации, КСГН можно культивировать в среде выживания с добавлением инсулина, дешевого суррогата инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1 ), что способствует выживаемость нейронов 35. Изменение средств массовой информации из полных СМИ инсулин-средах должно произойти либо в DIV 0 или DIV 1, чтобы предотвратить / апоптоз KCl-вывода, вызванной сыворотки. Анализ роста дендритов может быть выполнена аналогично анализе роста аксонов. Однако важно, чтобы держать КСГН в среде с KCl имитировать активность нейронов, что способствует дендритных развития. Анализ миграции нейронов должна осуществляться с использованием естественных условиях технику электропорации в.
Трансфекцию культивируемых нейронов, как правило, влечет за собойкотрансфекция по крайней мере двух плазмид: плазмидой, кодирующей трансфекции маркер, который может представлять собой плазмиду, кодирующую флуоресцентного белка (например, GFP) или б-галактозидазы и либо RNAi или избыточная экспрессия плазмиды. Чтобы обеспечить успешное совместная экспрессия плазмид, рекомендуемое количество трансфекции маркера должно быть 10% от общего количества ДНК (2-2,5 мкг / лунку 24-луночного планшета). Ранее мы установили, что трансфекция равных количеств ДНК (GFP вместе с DsRed) приводит к более 85% нейронов совместной экспрессии двух плазмид 22,24. Если нокдаун, избыточная экспрессия или воздействия малых молекул вызывают гибель нейронов, плазмиды, кодирующие Bcl-XL можно котрансфицировали обеспечить выживаемость нейронов без воздействия на морфологию 20. Котрансфекция до трех или четырех плазмид также беспроблемным, что полезно проводить эпистаз анализов для определения линейного пути или синергию двух белков в аксона или дендритов Грут-й. Здесь два независимых RNAi или избыточная экспрессия плазмиды или сочетание того и другого может быть трансфицировали вместе с трансфекции маркера.
Естественных техника электропорации в является идеальным методом для анализа миграции нейронов в развивающихся коры мозжечка. Это является преимуществом использовать щенков от альбиноса деформации по сравнению с штамма с темным цветом кожи. Кроме того, это упрощает работу с крысят в силу их большим размером мозжечка. В наших руках, почти все мозжечка являются GFP-положительных, но в разной степени. Хорошо электропорации мозжечок имеет много сотен GFP-положительных нейронов, ужасно-трансфицированную мозжечок меньше, чем 100. После небольшой практики, это также можно использовать мышей, если трансгенные мыши, необходимых для исследования. Этот метод значительно быстрее, чем поколения трансгенных мышей, и это позволяет для анализа различных условиях (с потерей функции, получить-из-функции и структурно-функциональных-анализов). IVE не тэквайеру стереотаксис, гусиная шея лампы достаточно для обнаружения мозжечка довольно полупрозрачного альбиноса щенка. Это также сократит время процедуры за щенком и краткое анестезии изофлураном хватает. Она тем не менее требуют немного практики целевой правильный регион и, таким образом, чтобы освоить технику.
Проблемы развития, вызванные нокдаун или избыточной экспрессии незначительны из-за регионализации генетических манипуляций мозжечка. Это позволяет для анализа внутренней механизма в результатах электропорации в мозаики генетически модифицированных нейронов, погруженных в среду дикого типа. Недостатком является то, что электропорации крысы или мыши не могут быть подвергнуты испытанию поведенческой из-за низкого количества трансфицированных нейронов. Для обеспечения коэкспрессия плазмид в нейронах, мы рекомендуем котрансфекции плазмидой, кодирующей GFP (или любой другой флуоресцентного белка) при нейрона конкретных промоутер избежать визуализацияния трансфектированных глиальных клеток. Эффекты, которые приводят к уменьшению длины аксонов могут быть легко обнаружены и измерены 24. Напротив, это технически невозможно дать количественную стимулирующие воздействие на аксонов как целые их длины не могут быть прослежены. Defasciculation из параллельных волокон, однако, измеримыми 20. То же самое справедливо для оценки длины дендритов и миграции нейронов 23,24,30. Как правило, мы выполняем свои анализы через 5 дней после электропорации. Это, конечно, можно провести анализ раньше и позже. Более позднем этапе рекомендуется изучить образование дендритных когтями 29, которые представляют собой синаптическую связь между КСГН и замшелых волокон.
Чтобы завершить анализ, важно выбрать подходящий статистический тест. Для этого, нужно учитывать, если значения групп следовать нормальному распределению (например аксонов или длин дендриты) и если 2 или мруда чем 2 группы включены в анализ. Для 2 группы, мы используем критерий Стьюдента, в течение более 2 групп ANOVA. Если значения следовать не-нормальное распределение (например, расстояние миграция), тест Манна-Уитни U и тест Крускала Уоллис должны быть использованы для 2 или более 2 групп, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Н. Schwedhelm-Domeyer за отличную техническую помощь, С. Серп и С. Papiol за помощь в статистическом анализе. Наша работа финансируется за счет Общества Макса Планка, в Deutsche Forschungsgemeinschaft, Центра наноразмерных микроскопии и молекулярной физиологии головного мозга (CNMPB), Геттингене, Германия и по GGNB младшая группа стипендию в Геттингенском университете.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isoflurane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 G | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
References
- Cajal, S. R. Histology of the nervous system of man and vertebrates. , Oxford University Press. (1995).
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. , (2012).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. Cerebellar cortex: cytology and organization. , Springer. (1974).
- Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation. Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum. Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes. Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).
- Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. Cellular and molecular neuroscience. , MIT Press. 419-41 Forthcoming.
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Rivas, R. J., Hatten, M. E. Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).
- Kuhar, S. G., et al. Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation. Development. 117, 97-104 (1993).
- Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro. J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells. Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain). Science. 303, 1026-1030 (2004).
- Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis. J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).
- Stegmuller, J., et al. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-400 (2006).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation. PLoS One. 7, (2012).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth. Development. 139, 3600-3612 (2012).
- Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis. Neuron. 41, 229-241 (2004).
- Yang, Y., et al. A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation. Science. 326, 575-578 (2009).
- Litterman, N., et al. An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning. PLoS Biol. 9, (2011).
- Kim, A. H., et al. A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons. Cell. 136, 322-336 (2009).
- Shalizi, A., et al. A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation. Science. 311, 1012-1017 (2006).
- Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration. PLoS One. 8, (2013).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nat. Neurosci. , (2011).
- Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).
- Huynh, M. A., et al. An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain. Neuron. 69, 930-944 (2011).
- de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain. Neuron. 72, 22-40 (2011).
- Calissano, P., et al. Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).
