Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon Published: March 17, 2014 doi: 10.3791/51070
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Cellular and Molelcular Neurobiology, Max Planck Institute of Experimental Medicine, 2Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB)

Summary

Nöronal morfogenezine ve göç doğru beyin gelişimi altında yatan çok önemli olaylardır. Burada, genetik olarak kültürlenmiş nöronlar ve serebellar granül morfolojisi ve nöronların göç özelliklerinin değerlendirilmesi için gelişmekte olan beyincik işlemek için yöntemleri tarif eder.

Abstract

Nöronal morfolojilerinden ve göç de dahil olmak üzere beyinde gelişimsel olaylar son derece In vitro. Süreçlerini yönetti ve in vivo bu olaylara karışan yolları belirlemek için derinlemesine bir nitelemeye imkan analiz edilmektedir. Gelişen beyincikte türetilen serebellar nöronlar granül (CGNs) morfolojik analiz için ideal bir model sağlayan bir sistemi vardır. Burada, bir genetik CGNs işlemek için bir yöntem ve ne kadar bireysel nöronların axono ve dendritogenesis çalışma açıklar. Bu yöntemle RNA girişim, aşırı ifadesi ya da küçük moleküllerin etkileri nöronlar kontrol ile karşılaştırılabilir. Buna ek olarak, kemirgen serebellar korteks baskın sonrası gelişim sayesinde vivo sistemde kolay erişilebilir. Ayrıca, genetik olarak gelişen cerebella işlemek ve daha sonra serebellar tanımlamak için bir in vivo elektroporasyon tekniği mevcut nöronal morfoloji değerlendirmek için analiznd göç.

Introduction

Beyincik akson büyüme ve göç mekanizmaları incelemek için mükemmel bir sistemdir. Beyincik nörobilim 1 çağlarından itibaren anatomik çalışmaların konusu olmuştur. Modern mikroskobu ve immunohistokimyasal teknikler önemli ölçüde genişletilmiş ve Santiago, Ramon ve üreter, 2-4 ile ilk keşifler rafine var. Fare genetik ve moleküler çalışmalar serebellar granül nöronların (CGNs) 5-7 gibi nöronlar farklı düzgün kablolama için gerekli önemli olayların daha iyi anlaşılmasına yol açan, serebellar gelişme kontrolünde temel büyüme ve transkripsiyon faktörlerini ortaya çıkardı.

Beyincik gelişmekte olan arka beyin 8 rhombomere 1 bir türevidir. 4. ventrikül çatı parçası olan eşkenar paralel dudak, en çok nöron popülasyonu oluşturacak serebellar granül nöron progenitörlerinin, yol açaryetişkin beyincik 9. Rostral göç, onlar serebellar anlage yerleşmek. Burada, granül nöron öncülerin mitoz kemirgenlerde doğumdan yer alan granüler tabaka, dış (EGL), dramatik genişlemesine yol açar. EGL itibaren, nöronlar Purkinje hücre tabakası sonuçta iç granüler tabaka (IGL 2) ikamet almak için geçmiş, moleküler tabakası (ML) ile içe göç başlar. Bu göç işlemi sırasında iki aksonlar ML içine uzanan iki kutuplu bir şekil kazanır. Ayrıca geçiş üzerine, hücre gövdesi uzakta aksonlardan göç ve iki işlem, bir çatallı, T-şekilli bir akson 10 oluşturmak için sigorta. Daha sonra, bu bölümler halinde ve akson olarak paralel lifler adlandırılır. IGL yerleşince, CGNs yosunlu lifleri ile sinaps kurmak dendritik pençeleri oluşturur dendrit, büyür. , Gelişen beyincikte temel süreçleri incelemek için, bir in vitro ve in vivo yaklaşımların bir arayah güvenilir sonuçlar ve sonuçlar sağlar.

CGNs sadece beyincik ancak tüm beynin en çok nöronlardır ve yüksek saflıkta 11-13 için kültürlenebilir. Kültürde, bu son derece homojen nöronal nüfusu hızla postmitotic olur ve kolayca tanımlanabilir akson ve dendritler ile bir polar morfoloji kazanır. Kültürlü CGNs progenitör çoğalma, farklılaşma, akson ve dendrit gelişim, nöronal göç, apoptoz ve elektrofizyolojik özellikleri (14-19 ve diğerleri) içeren sinirsel gelişimin çeşitli yönlerini incelemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Genetik manipülasyon kullanımı kültürlü CGNs çok yönlülüğünü genişletilmiş ve yukarıda belirtilen olayların içine daha fazla mekanik içgörü için izin verdi. Verimliliği düşük kalsiyum fosfat veya kutup işaretleri veya yazılım destekli analiz olanakları ile immünsitokimya ardından lipofilik yöntemleri kullanarak kültürlü nöronların transfeksivonuyoğun bir nöronal kültüründe bireysel nöronların örneğin morfolojisinin değerlendirilmesi tates. Bu yaklaşımla, akson ve dentrit büyümesi ilgi konusu olan proteinlerin rolü 20-25,26-28 incelenebilir. Bu kültür sistemi, bununla birlikte göç çok yüksek yoğunluklu kültürde sınırlı olduğu nöronal göç analiz etmek için daha az yararlıdır ve alt kültürleri olarak gerektirir. Akson ve dentrit büyümesi in vitro analiz, RNA girişim (i) kombinasyonlarını kullanarak bir sinyal yolunun bağlantılı proteinlerin inceleme sağlar, fazla sentezlenme ya da küçük moleküller.

Akson ve dentrit büyümesi düzenleme ya da nöronal göç ilgilenilen proteinin ilişkisini kurmak için, in vivo elektroporasyon (İVE) tekniği gelişmekte serebellar korteks analizi sağlar. Kemirgenlerde serebellar gelişme ilk iki doğum sonrası haftalara şekilde uzanan gerçeği nedeniyle, beyincik bir accessib temsil ederakson ve dendrit, nöronal göç, sinaptogenez ve apoptoz 20-24,29,30,26,27,31-34 gelişmekte incelemek için genetik manipülasyonlar le beyin yapısı. Buna ek olarak, bu model sistemi, aynı zamanda, akson yol bulma, kablo ve Birlikte alındığında nöronlar ve nöron-glia etkileşimlerinin bağlantısı gibi sağlam serebellar korteks gerektiren nöronal gelişimin diğer yönleri için faydalıdır, bu protokol, in vitro ve in vivo teknikler mücadele sağladığı nöronal morfolojilerinden ve göç konusunda tamamlayıcı bir yaklaşım.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

CGNs ya da doğum sonrası gün (P) 5 fare yavrular ya da P6 sıçan yavrularından hazırlanabilir. Biz postmitotic CGNs 13 seçmek için bir mitoz inhibitörü kullanan Bilimoria ve meslektaşları tarafından açıklanan bir protokol, izleyin.

Etik beyanı:
Canlı hayvanlar içeren tüm deneyler Aşağı Saksonya, Almanya "Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit" tarafından onaylanan hayvan protokole göre yapılmıştır.

Vitro tahlilde:

1.. Örneğin kalsiyum fosfat transfeksiyonu için yöntem Plazmid DNA, medya ve Tamponlar hazırlanması

  1. Steril, endotoksin içermeyen su içinde plasmid DNA içinde çözündürülür, DMEM (yüksek glukoz), 2.5 M CaCI2 yapmak, 2x HBSS (4 g NaCl, 0,1775 g KCI, 0.095 g 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0.675 g glikoz Na çözülür yapmak ve 2.5 g 250 ml ultra saf su içinde HEPES ve 7.05, 7.08 ve 7,11) pH ayarlanır. Not: hazırlarken2x HBSS çözeltisi ile, verilen plazmidlerin kombinasyonunun transfeksiyon verimi ile ilgili olarak en iyi sonuçları verir testi.

2. Kültür Nöronlar transfeksivonu

Şekil 1
Şekil 1. In vitro akson ve dentrit büyümesi tahlilinin akış şeması. Kültürlü CGNs P6 sıçan yavrularından izole edilmiş (cam kapak slipleri ile 24-çukurlu plaka), bir fluoresan işaretleyici transfeksiyon (örneğin GFP) ihtiva eden bir çökelti ile DIV DNA, 0 ya da 1 ile transfekte edilir. Tespit ve İmmünositokimya sonra, nöronlar kör bir şekilde görüntülenmiş. Görüntüler ImageJ içine alınır ve işlemler ölçülür. Ölçümler, daha sonra bir istatistik programı kullanılarak işlenir.

  1. Tohum CGNs (20 x 10 6 24-çukurlu plaka başına, BME,% 10 dana serumu, 2 mM Penisilin-Streptomycin-Glutamin (PSG), 25 mM KCl) ortam 500 ul, 24 oyuklu bir plaka içerisinde nitrik asitle yıkanmış, poliornitin-kaplanmış 12 mm cam lameller üzerinde oyuk başına.
  2. In vitro olarak günde (DIV) 0 (en az 8 saat sonra kaplama) ya da DIV 1, büyüme ortamı toplamak ve 37 ° C de tutmak Önceden ısıtılmış 500 ul DMEM içinde iki kere yıkayın nöronlar ve DMEM içinde 500 ul ekleyin.
  3. Kuluçka makinesi içinde yer nöronlar (37 ° C,% 5 CO2) 45 dakika boyunca karıştırılır.
  4. Karıştırılarak her bir oyuk için 40 ul DNA çökeltisinin hazırlanması: DNA (2-2.5 ug / gözenek, toplam DNA itibarıyla% 10 transfekte nöronlar görselleştirmek için bir transfeksiyon işaretleyici, örneğin GFP olmalıdır), su (18 ul kadar), 2 ul ilave edin 2.5 M CaCl2, iyice karıştırın ve 2x HBSS 20 ul ekle.
    1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DNA çökeltisi inkübe edin.
  5. Her bir oyuğa DNA çökeltisi ekleme ve kuluçka makinesi içinde 18 dakika boyunca inkübe nöronlar.
  6. DMEM / DNA karışımı çıkarın ve önceden ısıtılmış DM 500 ul ile iki kez yıkayın nöronlarEM.
  7. Nöronlara geri adım 2.2 den toplanan ortam ekleyin. Nöronlar fazla 3 gün, karbon kaynağı doldurmak DIV 3 25 mM glükoz ile ek ortam kültür içinde olacaksa.
  8. 1-5 gün sonra, GFP antikor immünsitokimya tabi nöronları kullanarak.
  9. Bir floresan mikroskop kullanılarak kör yöntemle durumun başına Görüntü en az 30 bireysel nöronlar.

3. NeuronJ, bir NIH ImageJ tapa ile ölçün Aksonlar ve Dendritler

Önemli: um oran büyütme ve görüntü çözünürlüğüne bağlı: Görüntüler uygun piksel kullanılarak correctluy ölçekli emin olun.

  1. ImageJ ile 8-bit görüntüleri dönüştürün: Açık görüntü, 'resim' seçin -> 'Tür' -> '8-bit '->' Kaydet 'görüntü.
  2. NeuronJ eklentisi çalıştırmak ve 8-bit görüntü açın.
    ekran görüntüsü
  3. Cl: akson izlemek için 'Ekle iz' seçeneğini kullanınakson başında bir kez sol fare düğmesi ick ve süreç boyunca fareyi hareket ettirin. Akson ucunda çift tıklama iz akson şekli eşleşirse.
    ekran görüntüsü
    Not: Önerilen iz akson şekli farklı,, akson ucunda sonra çift tıklayın iz demirlemek için aksonal süreci üzerinde bir kez tıklayın.
  4. Seçeneğini basın 'Çalıştır' 'Görüntü izleme ölçümleri' seçin, 'Ölçü trasların' üzerine tıklayın. Akson ölçümleri her yeni bir pencerede görüntülenir. Dendritlerin için, 'Görüntü grup ölçümleri seçeneğini' basın 'Çalıştır' seçeneğini seçin.
    ekran görüntüsü
    Toplam dendrit ölçümleri tüm yeni bir pencerede görüntülenir. Herhangi bir elektronik tablo programı açılabilir ayrı bir dosya olarak kaydedebilirsiniz.
  5. Alternatif manuel izleme için, Fiji yazılımı kullanın: Sağ inci tıklayınE 'Düz çizgi' seçeneği, 'Freehand çizgi' seçin,
    ekran görüntüsü
    basılı sol fare düğmesi tutmak ve elle sürecini izlemek, basın 'Ctrl + M' ölçmek için.
  6. Durum başına ortalama akson / dendritik uzunluğunu hesaplamak ve uygun istatistiksel testi kullanın.

    Vivo elektroporasyon:

1.. Ekipman ve Reaktifler hazırlanması

  1. 30 G iğne, boşluk (1-2 mm), şırınga, ölü hacim düşürücü (DVR), elektrogözenekleme ve tweezertrodes, ısıtma pedi veya kızılötesi ısı lambası, boynu lamba ve izofluran gerekir.
  2. Iğne içine DVR koymak, sonra şırıngaya iğne takılır, ve nihayet (Şekil 2) iğne üzerine boşluk koymak.
    Şekil 2,
    Rakam2. Iğne. DVR hazırlanması 200 ul pipet kesti ve ölü hacmini azaltmak için iğne yerleştirilir. Spacer 200 ul yükleme ucundan elde edilen ve yaklaşık olarak 2 mm beyincik içine nüfuz derinliğini düzenleyen iğnenin ucuna yerleştirilir. Cetvel birimleri: cm
  3. PBS/0.03% Hızlı Green DNA çözülür. Not: Bir transfeksiyon bir işaretleyici olarak, sadece nöronlar görselleştirmek için bir nörona özgü promoter (ör synapsin) altında olan bir floresan proteini kullanmak avantajlıdır. Toplam plazmid miktarın% 25'i transfeksiyon işaretleyicisini kodlayan plazmid olmalıdır.
  4. % 70 etanol olun.
  5. Ekim eşit hacimleri ve PBS içinde çözülmüş% 30 sukroz karıştırın.
  6. DNA (PBS/0.03% Fast Green plazmid DNA'nın 4 ug / ul), 4 ul şırınga doldurun.

2. Sıçan Yavrularının ive

İVE Akış Şeması: Şekil 3'e bakın


Şekil 3,. In vivo elektroporasyon. P4 sıçan yavrularının Akış Şeması beyincik içine enjekte edilir 5 elektrik sinyalleri maruz bırakılarak, ardından, izofluran ve bir fluoresan işaretleyici transfeksiyon (örneğin GFP) kodlayan plasmid DNA ile anestezi edilmiştir. Beş gün sonra, izole edilmiş GFP-pozitif cerebella kesitli ve immünohistokimya tabi tutulur. Görüntüler bir konfokal mikroskop kullanılarak yakalandı ve Imaris yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Veriler istatistiksel program ile işlenir.

  1. Albino suşu (Wistar veya Long Evans) P4 sıçan yavrular kullanın.
  2. Yavru hareketli artık kadar 1-2 dakika boyunca izofluran (doku içinde ıslatılmış) 200 ul küçük kutu (örn. P1000 pipet ucu kutusu) izofluran ile yavrular (birbiri ardına) anestezisi. Yavrular w temas alamadım dikkat edinith isofluranın sıvı duyarlılık. Bireysel yavrular anestezi farklı yanıt olarak yakından zaman izleyin.
  3. % 70 etanol ile geri yavrunun kafası sterilize.
  4. Başparmak ve işaret parmağı arasında yavru başını düzeltmek ve albino yavru beyincik bulmak için boynu lamba kullanabilirsiniz. Transvers sinüs keskin kortikal hemisferden Ortabeyin (üst ve alt kollikulus) (Şekil 3) demarcates. Beyincik Ortabeyinde bitişiğinde bulunan ve koyu bir gölge belirir. Bir nokta ile beyincik belirtmek için kalıcı bir kalem kullanın. Önemli: Sabit pozisyonda yavru tutun! Not: Bu işlem sırasında anestezi kapalı giymeli, önce DNA enjekte izoflurana yavruyu maruz.
  5. İğneyi (Şekil 3) takın ve yavaş yavaş beyincik DNA'nın 3 ul enjekte.
  6. DNA solüsyonu, 30-60 saniye için yaygın olsun.
    1. Eksi kutup başının arkasına (serebella'sı ile temas yapar o kadar tweezertrodes arasında yavru başını yerleştirinr bölgesi) ve artı kutup temas kafanın karşı tarafına (Şekil 3) bu.
    2. 5 elektriksel darbeleri tabi yavru. Hayatta kalma (Tablo 1) ödün vermeden iyi bir verim sağlamak için elektroporasyon yavruların ağırlığına gerilimi ayarlar.
      Ağırlık Gerilim Nabız Aralık
      8-9 g 160 V 50 msn 950 ms
      9-10 g 165 V 50 msn 950 ms
      > 10 g 170 V 50 msn 950 ms
      Tablo 1. P4 sıçan yavruların eîektroporasyonu.
    3. Yavrular ısıtılmış pad üzerinde veya kızılötesi lamba altında kurtarmak edelim. Baraj yavrular dönün. Önemli: Isıtma kaynağı herhangi yanıklara vermek olmadığından emin olun.
  7. CO başı kesilerek 2 izledi onları yerleştirerek 5 gün elektroporasyon sonra yavrular kurban.
    1. Bir floresan mikroskop kullanılarak serebella'sı GFP pozitif olanlar için cerebella ve ekran izole.
  8. O cerebella lavabo kadar tüpün dibine 4 ° C'de% 30 sukroz içinde inkübe, 4 ° C 'de% 4 PFA O / N cerebella düzeltildi.
  9. OCT/30% sakaroz cerebella embed ve sirostat kullanılarak 40 mikron koronal bölümleri kesti. Not: Bir kör bir şekilde Bölüm her beyincik.
  10. Konu bölümleri GFP antikor kullanarak immünohistokimyaya. Nükleer boya (DAPI veya Hoechst 33258) Counterstain ve hayvan başına en az 200 transfekte nöronların lokalizasyonu belirler.
  11. Derinlemesine bir analizi için, ML ve beyaz madde bakan bir düşük değerli IGL bakan bir üst IGL sonuçlanan parçaya IGL bölmek ve her yarım ikamet GFP-pozitif nöronların sayısı. Not: Bir kör bir şekilde her bölümün GFP pozitif nöronlar Kont.

    3. Dendrite Uzunluk Ölçme, bir konfokal mikroskop kullanılarak x, y, z Düzlem Bölüm görüntüleri Edinme

    Not: örneğin, 1 um bir z-stwp ile 40 mikron bölüm için 40 görüntüleri kullanır.

    1. Dendritler bir 3D görüntü oluşturmak için yazılım, Imaris açık resim serisi.
    2. 3D nöron görüntülemek için 'aşmak' moduna tıklayın.
      ekran görüntüsü
    3. 'Yeni filamanın Ekle' seçeneğini seçin ve yarı otomatik izlemeyi başlatmak için 'otomatik oluşturulmasını yap' ı tıklatın.
      ekran görüntüsü
      Not: Bir kör bir şekilde her 3D görüntü analiz
    4. 'Beraberlik' sekmesini ve 'autopath' seçeneğini seçin.
      ekran görüntüsü
    5. C fare imleciell vücut ve Shift + fare sağ hücre gövdesini seçmek için tıklatın. Not: yazılım tarafından Autocalculation birkaç dakika gerekebilir.
      ekran görüntüsü
    6. Shift + fare sol tıklama kullanarak filamanın (dallantı) yol eklemek. Not: Yollar gerçek zamanlı olarak görülebilir.
      ekran görüntüsü
    7. Filament istatistik pencereye gidin ve 'Ayrıntılı', 'Belirli değerleri' ve toplam dendrit uzunluğu toplamı için 'Filament dendrit uzunluğu (toplamı)' üzerine tıklayın.
      ekran görüntüsü
    8. Verileri analiz etmek için uygun istatistiksel testler kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıda tarif edildiği gibi, farklı kültür koşullarına göre CGNs morfolojisini analiz etmek için, DIV 0 üzerindeki nöronların transfekte edildi. Transfeksiyondan sonra, tam bir ortam (BME,% 10 dana serumu, 2 mM PSG, 25 mM KCl) ve minimum ortamı ihtiva eden, insülin başka bir grubu (BME, 25 mM glukoz, 2 mM PSG, 10 ug / içine nöronların bir takım yerleştirilmiştir ml insülin). Biz, Bölüm 1, 2 de GFP antikoru kullanılarak, bağışıklık kimyası için, nöronların tabi tutuldu ve 3, sadece bir dizi 2 grubu 1 ve akson boyunca aksonlar ve dentritler ölçülmesiyle izlenmiştir. Büyüme faktörleri ve taklit nöronal aktivite, sırasıyla, akson ve dendrit sağlamak serum ve KCl, sayesinde geliştirilen ve (Şekil 4A) belirtilen zaman penceresi üzerinde hızla büyüdü. Kümesinin 2 aksonal büyüme esas içsel uyarım bir sonucuydu ve böylece çok azalır. Dendritler Ancak dendrit büyüme (Şekil 4B) uyaran eksikliği serum ve KCl, nedeniyle düzgün geliştirmek için başarısız oldu.


Şekil 4,. Analizi akson ve CGNs (A, B) DIV 0 ° C'de bir plazmid kodlayan GFP ile transfekte CGNs, ya tam ortamında (A) ya da BME'de 1, 2 ya da 3 gün boyunca insülin ile takviye kültürlenmiştir içinde dendrit büyüme (B). Tespit edildikten sonra, nöronlar GFP antikoru kullanılarak immunositokimya tabi tutulmuş ve akson ve dentrit uzunlukları ölçülmüştür. 82 (A) ve 65 (B) nöronların toplam (ortalama ± SEM, *** p <0.001, * p <0.05, ANOVA) ölçüldü. Beyaz oklar ve sarı ok ucu akson ve dendrit gösterir, sırasıyla. Ölçek çubuğu 100 mikron eşittir. görmek için buraya tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonu.

Sıçan cerebella morfolojik analizini gerçekleştirmek için, biz 5 gün sonra cerebella yukarıda ve izole açıklandığı gibi ive P4 yavrular tabi. 40 mikron koronal cryosections İmmünohistokimyası% 86 GFP pozitif nöronlar IGL (Şekil 5A) içine EGL soyundan olduğunu ortaya koydu. Bunlar arasında,% 50 EGL üst kısmında gözlendi ve% 36 IGL alt kısmı içine daha uzağa göç etti. Ayrıca, dendrit üç bağımsız Elektroporasyona cerebella büyümesini ve kıyasla ortalama uzunlukları (Şekil 5B) tespit edilmiştir.

Şekil 5,
Şekil 5,. In vivo olarak elektroporate cerebella. Cerebella nöronal göç ve dendrit uzunluğunun analiziP4 sıçan yavrulanna Psyn-GFP plazmidi ile elektropore ve 5 gün sonra izole edilmiştir. 40 um koronal kesitler GFP antikoru kullanılarak immünohistokimyasal tabi tutuldu. Beyincik CGNs (A) Localization değerlendirildi. (Kruskal Wallis, Mann Whitney düzeltme, * p <0.05, *** p <0.001) (B) Toplam dendrit uzunluğu Imaris yazılımı kullanılarak ölçüldü (ANOVA, Bonferroni düzeltmesi, ns = anlamlı olmayan, ortalama ± SEM). Oklar CGN hücre gövdeleri göstermektedir. Ok uçları dendrit göstermektedir. Ölçek çubuğu 50 mikron eşittir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Avantajları ve in vitro ve in vivo metotları tarif sınırlamaları:

Fare ve sıçan Kültür CGNs eşit derecede iyi morfolojik analizler için uygundur. Bir sıçan beyincik büyük boyutu sayesinde, sıçan yavrularından CNGs verim fare yavrularının 3-4x o aşıyor. Kenara CGNs gelen, kortikal ve hipokampal nöronların yanı sıra kültür sistemi olarak kullanılabilir. Kalsiyum fosfat yöntemi bireysel nöronların morfolojisini analiz etmek için arzu edilen bir düşük (% 0.01-5) transfeksiyon verimi ile sonuçlanır. Alternatif lipofilik transfeksiyon yöntemleri de kullanılabilir, ancak daha fazla kazanç olmadan aşırı pahalı olabilir. Yüksek verimlilik çok zor ayrı işlemleri ayırt yapacak gibi CGNs gibi yüksek yoğunluklu kültürlerinin viral transfeksiyon yöntemleri kaçınılmalıdır. CGNs, biz genellikle in vitro transfeksiyon verimlilik ve gün ilişki bulmak. Nöronlar kültürlenmiştir daha, Daha az etkilenen da transfeksiyonu ile uyarılan strese olacaktır. Sonuç olarak transfeksiyon verimi yukarı gidecek. Ayrıca, akson büyüme iç mekanizmaları odaklanmak ve ortam içinde mevcut serumundan türetilen büyüme faktörlerinin etkisini dışta bırakmak için, CGNs, insülin, insülin benzeri büyüme faktörü 1 için ucuz bir vekil ile takviye edilmiş ortam içinde hayatta kalma kültürlenebilir (IGF-1 ) e sahip ve 35, nöronun hayatta kalışını teşvik etmektedir. Insulin içeren ortamda tam ortamdan bir ortam değiştirme serum / KCl-çekme-kaynaklı apoptosisi engellemek için DIV 0 ya da 1 ya da DIV gerçekleşmelidir. Dendrit büyüme analizi akson büyümesi deneyine benzer şekilde gerçekleştirilebilir. Bu dendritik gelişimini teşvik nöron aktivitesi, simüle etmek için KCI ile takviye edilmiş ortam içinde CGNs tutmak ancak önemlidir. Nöronal migrasyon analizi in vivo elektroporasyon tekniği kullanılarak yapılmalıdır.

Kültürlenmiş nöronların transfeksiyon genellikle gerektirecektirbir plazmid, bir floresan proteini (örneğin GFP) veya b-galaktosidaz için kodlama ve RNAi ya da aşın ya da plazmidler olabilir transfeksiyon işaretleyicisini kodlayan bir plazmid,: en az iki plasmidin birlikte transfeksiyonu. Plasmidlerin yakımının birlikte başarılı olmak için, transfeksiyon marker önerilen miktarda DNA (bir 24-çukurlu plaka içinde 2-2.5 ug / çukur) toplam miktarının% 10 olmalıdır. Daha önce kurulmuş olması DNA (GFP ile birlikte DsRed) her iki plazmid 22,24 coexpressing nöronların% 85 daha fazla sonuçları eşit miktarlarının transfeksiyon. Aşın ya da küçük moleküllere maruz nöronal hücre ölümünü teşvik, demonte halinde, Bcl-XL kodlayan bir plasmid morfolojisi 20 üzerinde etki nöronal hayatta kalmasını sağlamak için birlikte transfekte edilebilir. En fazla üç veya dört plazmid kotransfeksiyonu epistasi gerçekleştirmek için yararlı olduğu da sorunsuz bir düz yol veya sinerji iki proteinin akson bölgesi veya dendrit Gro kurmak için analizlerwth. Burada, iki bağımsız RNAi veya aşırı ifadesi plazmidler ya da her ikisinin bir kombinasyonu bir transfeksiyon işaretleyici ile birlikte ko-transfekte edilirler.

In vivo elektroporasyon tekniği serebellar korteks gelişmekte olan nöronal göç analizi için ideal bir yöntemdir. Bu, koyu tenli bir yük ile karşılaştırıldığında bir albino suşundan yavrular kullanmak avantajlıdır. Ayrıca, sıçan yavrular onların daha büyük boyutlu cerebella nedeniyle çalışmak daha kolaydır. Bizim ellerde, hemen hemen tüm serebella'sı GFP pozitif fakat farklı derecelerde vardır. İyi elektroporate beyincik yüz çok GFP pozitif nöron, 100 den az bir kötü-transfekte beyincik vardır. Küçük bir uygulama ile, bu transgenik fareler, çalışma için gerekli olup olmadığını fareler kullanmak da mümkündür. Bu yöntem, transgenik farelerin üretilmesi çok daha hızlı olduğunu ve farklı koşullar analizine izin verir (zararı-fonksiyon, kazanç-fonksiyon ve yapı-fonksiyon analizi.) IVE r yokequire stereotaksi bir boynu lamba oldukça saydam albino yavru beyincik tespit etmek için yeterlidir. Bu da yavru başına işlem süresini ve izofluran kısıtlamasını ile kısa bir anestezi kısaltacaktır. Ancak doğru bölgeyi hedef ve böylece tekniği ana biraz pratik gerektirir.

Nakavt veya aşırı ekspresyonuna neden gelişimsel problemler beyincik bölgeselleştirilmiş genetik manipülasyon nedeniyle önemsizdir. Bu, yabani tip bir ortamda yerleştirilmiştir genetik olarak modifiye edilmiş nöronların bir mozaik deseni elektroporasyon sonucu olarak iç mekanizmasının analizi sağlar. Olumsuz Elektroporasyona sıçan ve farelerin nedeniyle transfekte nöronların düşük miktarda davranış testine tabi olamaz olmasıdır. Nöronlarda plasmidlerin birlikte ekspresyonuna sağlamak için, görsellestirme önlemek için bir nörona özgü promotörün kontrolü altında bir plazmid kodlayan GFP (veya başka bir flüoresan protein) ile birlikte transfeksiyon tavsiyetransfekte edilmiş glial hücre tion. Aksonal uzunlukta bir azalmaya neden etkileri kolaylıkla tespit edilir ve 24 ölçülebilir. Buna karşılık, onların bütün uzunlukları takip edilemez gibi aksonlar uyarıcı etkilerini ölçmek teknik olarak imkansızdır. Paralel liflerin Defasciculation ancak 20 ölçülebilir olduğunu. Aynı dendrit uzunlukta ve nöronal göç 23,24,30 değerlendirilmesi için de geçerlidir. Biz genellikle 5 gün elektroporasyon sonra bizim analizler yürütmek. Bu kadar erken ve geç analizi gerçekleştirmek için tabii ki mümkün değildir. Daha sonraki bir zaman noktası CGNs mossy ve elyaflar arasındaki sinaptik bağlantıyı temsil dendritik pençeleri 29 oluşumunu incelemek için tavsiye edilir.

Analizleri sonuçlandırmak için, uygun istatistiksel testi seçmek önemlidir. Bunun için, bir grupların değerleri normal dağılım (örneğin akson veya dendritlerin uzunlukları) izleyin eğer dikkate almak zorundadır ve eğer 2 veya m2 gruba göre cevher analize dahil edilmiştir. 2 grup için, biz fazla 2 grup için ANOVA, Student testi kullanın. Değerleri olmayan bir normal dağılım (örneğin göç mesafesi), Mann Whitney U testi ve Kruskal Wallis testi takip etmeli, sırasıyla 2 veya 2 grup daha, için kullanılması gerekmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Acknowledgments

Biz istatistiksel analizler ile yardım için, mükemmel teknik yardım C. Hammer ve S. Papiol N. Schwedhelm-Domeyer teşekkür ederim. Çalışmalarımız Max Planck Derneği, Deutsche Forschungsgemeinschaft, Nanoseviye Mikroskopi Merkezi ve Beyin Moleküler Fizyoloji (CNMPB), Göttingen, Almanya ve Göttingen Üniversitesi GGNB Gençler Grubu Stipend tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 11960-044
BME Gibco 41010-026
Insulin Sigma-Aldrich Si-1-4011
Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich P-2533
CaCl2 Appli-Chem A3652
Isoflurane Actavis Deutschland
Tissue-Tek OCT Sakura
ECM 830 and tweezertrodes Harvard Apparatus
Epifluorescence microscope and camera Nikon
SP2 confocal microscope Leica
ImageJ NIH
Imaris 7.4.2 Bitplane, Inc.
GraphPad Prism GraphPad Software, Inc.
MS Excel Microsoft
Loading tip 1-200 µl Costar 4853
Pipette tip 200 µl Sarstedt 70.760.502
Microlance 3 needle, 30 G BD 302200
50 µl gastight Syringe 1705 Hamilton
Glass coverslips  Thermo Scientific Menzel Glaeser CB00120RA1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cajal, S. R. Histology of the nervous system of man and vertebrates. , Oxford University Press. (1995).
  2. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
  3. White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. , (2012).
  4. Palay, S. L., Chan-Palay, V. Cerebellar cortex: cytology and organization. , Springer. (1974).
  5. Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation. Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum. Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).
  8. Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
  9. Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
  10. Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes. Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).
  11. Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. Cellular and molecular neuroscience. , MIT Press. 419-41 Forthcoming.
  12. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J. Vis. Exp. , (2009).
  13. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Rivas, R. J., Hatten, M. E. Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).
  15. Kuhar, S. G., et al. Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation. Development. 117, 97-104 (1993).
  16. Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro. J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).
  17. Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).
  18. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
  19. Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells. Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).
  20. Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain). Science. 303, 1026-1030 (2004).
  21. Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis. J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).
  22. Stegmuller, J., et al. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-400 (2006).
  23. Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation. PLoS One. 7, (2012).
  24. Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth. Development. 139, 3600-3612 (2012).
  25. Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis. Neuron. 41, 229-241 (2004).
  26. Yang, Y., et al. A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation. Science. 326, 575-578 (2009).
  27. Litterman, N., et al. An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning. PLoS Biol. 9, (2011).
  28. Kim, A. H., et al. A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons. Cell. 136, 322-336 (2009).
  29. Shalizi, A., et al. A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation. Science. 311, 1012-1017 (2006).
  30. Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration. PLoS One. 8, (2013).
  31. Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nat. Neurosci. , (2011).
  32. Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).
  33. Huynh, M. A., et al. An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain. Neuron. 69, 930-944 (2011).
  34. de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain. Neuron. 72, 22-40 (2011).
  35. Calissano, P., et al. Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).

Tags

Nörobilim Sayı 85 aksonlar dendritler nöronal migrasyon beyincik kültürlü nöronlar transfeksiyon,
Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holubowska, A., Mukherjee, C.,… More

Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmüller, J. Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration. J. Vis. Exp. (85), e51070, doi:10.3791/51070 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter