Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

קל מדידה של מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה פלזמה מתויגים-EGFP באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונת k-Space

doi: 10.3791/51074 Published: May 10, 2014

Summary

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד למתאם טכניקת ניתוח תנודות k-Space תמונת ספקטרוסקופיה (kICS) למדידת מקדמי דיפוזיה של כותרתו fluorescently חלבוני קרום פלזמה בתאי יונקים חיים.

Abstract

דיפוזיה ומידור של חלבוני קרום פלזמה לרוחב מוסדרים בחוזקה בתאים ובכך, לומדות את התהליכים האלה יגלו תובנות חדשות לפונקציה פלזמה קרום חלבון ורגולציה. לאחרונה, מתאם תמונת k-Space ספקטרוסקופיה (kICS) 1 פותח כדי לאפשר מדידות שגרתיות של מקדמי דיפוזיה ישירות מתמונות של חלבוני קרום פלזמה מתויגים פלורסנטי, שנמנעו מהטיות שיטתיות הוצגו על ידי photophysics בדיקה. למרות הבסיס התיאורטי לניתוח הוא מורכב, השיטה יכולה להיות מיושמת על ידי nonexperts באמצעות קוד זמין באופן חופשי למדידת מקדמי דיפוזיה של חלבונים. kICS מחשבת פונקציית מתאם זמן מערימת תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר שינוי פורייה של כל תמונה למרחב גומלין (k-). בהמשך לכך, מיצוע מעגלי לוגריתם, טבעי ולהפוך ליניארי מתאים לפונקציית המתאם מניב את מקדם הדיפוזיה. זהנייר מספק מדריך צעד אחר צעד לניתוח התמונה והמדידה של מקדמי דיפוזיה דרך kICS.

ראשית, תמונה ברצף במסגרת שיעור גבוהה של חלבון קרום פלזמה שכותרתו fluorescently נרכש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, באזור של עניין (ROI) הימנעות אברונים תאיים, נע שלפוחית ​​או בולטות אזורי קרום נבחר. ערימת ההחזר על ההשקעה מיובאת לקוד זמין באופן חופשי וכמה פרמטרים שהוגדר (ראה סעיף שיטה) נקבעים לניתוח kICS. התכנית לאחר מכן יוצרת "מדרון של מדרונות" עלילה מפונקציות קורלציה זמן k-המרחב, ומקדם הדיפוזיה מחושב מהשיפוע של העלילה. להלן הליך kICS צעד אחר צעד כדי למדוד את מקדם הדיפוזיה של חלבון בממברנה באמצעות תעלת המים aquaporin-3 הכליות מתויגות עם EGFP כדוגמא הקנונית.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ארגון ארבעה ממדי החלל ובזמן והניידות לרוחב של חלבוני קרום פלזמה בחוזקה מוסדרות ועשויים לשחק תפקיד בתפקוד חלבון, פעילות ואינטראקציות בין חלבונים. דיפוזיה רוחבית של חלבוני קרום פלזמה, באופן מסורתי נחקרה על ידי חישוב מקדמי דיפוזיה עבור חלקיקים בודדים מהזמן לשגות הדמיה של נקודה קוונטית או לצבוע את חלבוני קרום הפלזמה שכותרתו 2-4. גישה זו דורשת החדרת תג תאי בחלבון הפלזמה הממברנה לנקודה קוונטית או תיוג צבע, אשר יכול לסכן את קיפול חלבונים ותפקוד ובכך, לא ניתן להשיג עבור חלק מחלבונים. הנפח הסטרי של נקודה קוונטית הוכח להאט דיפוזיה של החלבון 5 ויותר מכך, רק חלק זעיר של החלבונים באוכלוסייה מסומנים עם נקודות קוונטיות, וזה לא ידוע אם חלק קטן הזה הוא נציג לסך בריכה של חלבוני קרום פלזמה. טרה חלקיק יחידהמדידות cking (SPT) של מקדמי דיפוזיה סדרת תמונה של חלבוני שכותרת נקודה קוונטית מכרוכות במיפוי עמדות שיא הדמיה של חלקיקים עם שני גאוס ממדי מתאים אחרי אלגוריתמי ניתוח נרחבים. הניתוח הוא המחשוב מאוד אינטנסיבי, הדורש עקומה שאינה ליניארי נרחב הולמת בכל מסגרת תמונה של רצף הזמן לשגות לקירובים של פונקצית התפשטות נקודת מיקרוסקופ (בדרך כלל שני Gaussians מרחבי ממדי) וקישור הבא של עמדות חלקיקים למסלולי חלקיקים המתאר את תנועה של מולקולות בודדות 6,7.

טכניקת מתאם תמונה שפותחה לאחרונה, מתאם תמונת k-Space ספקטרוסקופיה (kICS) מאפשרת מדידות פשוטות היחסית של מקדמי דיפוזיה של חלבונים מתויגים fluorescently קרום פלזמה. האפשרות לחשב באופן שגרתי מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה שכותרתו עם חלבוני ניאון על ידי kICS היא כלי ייחודי המחזיקמספר יתרונות על פני קוונטים מסורתיים מנקדים ניתוח SPT: אין כניסה של תגים תאיים וזמן רב תיוג תאי נדרש (ניתן להשתמש בשורות תאים לבטא חלבוני ניאון); מקדמי דיפוזיה מופקים מכלל המאגר של חלבוני ניאון בהשוואה לקבוצת משנה שכותרתו עם נקודות קוונטיות; הניתוח הוא פשוט ללא הצורך לעקוב אחר חלבונים יחיד והניתוח יכול להתבצע באמצעות קוד קיים, ללא צורך בתכנות משתמש נוסף. השיטה היא מהירה כי זה טכניקת מיצוע המאפשרת חישוב וחישוב מהירים של מקדמי דיפוזיה. מדידות דיפוזיה המהירה אלה לאוכלוסיית החלבון משלימות את מידע תחבורה המולקולרי מפורט יותר שהושג לקבוצת משנה של כלל האוכלוסייה על ידי שיטות SPT מדקדק.

זמן kICS קורלציה רצפי תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי שראשון הפכו למקום פורייה, ובכך מפריד flתנודות uorescence עקב photophysics מאלו כתוצאה מההובלה מולקולרית 1. כתוצאה מכך, kICS יכול לקבוע את צפיפות המספר, מהירות זרימה, ודיפוזיה של כותרתו fluorescently מולקולות בעת היותו בלתי משוחד על ידי photobleaching המורכב או מהבהב של fluorophores. זה עושה kICS כלי שימושי לקביעת מהירות דינמיקת דיפוזיה של חלבוני קרום תא fluorescently שהכותרת ללא הצורך בכתיבת האלגוריתמים מותאמים אישית. חלבונים חוץ מכותרתו fluorescently, יכול להיות מיושמים גם kICS לחלבוני קרום קוונטים שכותרת נקודה 8.

מאמר זה מספק מבוא צעד אחר הצעד כיצד להשתמש kICS לחלץ מקדמי דיפוזיה של חלבוני קרום פלזמה מתויגים-EGFP ידי המדגים כיצד למקם את היבול, את אופן השימוש בקוד וכיצד להעריך את החלקות שנוצרו, שממנו דיפוזיה מקדמים מחולצים. כדוגמא, נתונים המתקבלים על ידי ספינינג סט דיסק מיקרוסקופיה בהשתקפות פנימית למחצה כוללת לזרוחמצב NCE (TIRF), של חלבון תעלת המים aquaporin-3 כליות (AQP3) מתויגים עם EGFP מוצג.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

רכישה של חלבונים מתויגים EGFP בקרום הפלזמה לניתוח kICS יכולה להיעשות על מיקרוסקופ epifluorescence, התקנת TIRF או על מיקרוסקופ דיסק מסתובב מוגדר לרכוש תמונות של הקרום של עניין. גודל פיקסל המצלמה, כמו גם את הזמן בין מסגרות תמונה הוא זקוק לניתוח. רצפי תמונה של 100-1,200 מסגרות במסגרת שיעור של 4-30 הרץ יכולים לשמש לניתוח. במהלך הרכישה, חשוב לשמור על הקרום בפוקוס לאורך כל תקופת ההדמיה ולהתמקד בחלק של הקרום השטוח שבו הקרינה היא מפוזרת באופן אחיד. העברת שלפוחית, בולט אזורי קרום ואברונים בתא יכול להיות קצוץ מאוחר יותר בתהליך הניתוח. יש לבחור בזמן הרכישה, כך שאין להיסחף או תנועה של התא.

כדי להשיג את תסריטי קוד kICS לMATLAB, פנה לפול וייסמן (Paul.Wiseman @ McGill.ca). בפעם הראשונה קוד kICS משמשת, MAT הפתוחLAB ולחץ על קובץ, נתיב ולאחר מכן קבע, לאחר מכן לחץ על הוספה בתיקיות משנה ולמצוא את התיקייה במחשב שבו קוד kICS ממוקם. לאחר מכן לחץ על OK, לשמור ולסגור. כעת המשכתי עם הניתוח של גידולים מתוארים בנקודות הבאות.

1. ייבא את התמונה ברצף של ריבית לתוכנית ההדמיה ניתוח כסטאק TIFF

שמור את הקובץ בשם: stack1.tif.

  1. בחר אזור מלבני של עניין (ROI) בחלק השטוח של הקרום לא כולל אברונים בתא מרגשים ובולטים אזורי הממברנה. גודל היבול נבחר כך מספיק נתונים סטטיסטיים המופקים עבור k טוב 2 מגרשים.
  2. לחתוך את האזור ולשמור את היבול כקובץ TIFF בתיקייה מתאימה. אם יש כמה יבולים מאותו הסרט, השתמש בתוספת מספר, "stack1crop.tif" לדוגמא ", stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
  3. מניחים את התיקייה המכילה את הגידולים מקומייםבמחשב, לא בשרת, בעת עושה ניתוח kICS.

2. ייבא את הגידולים לתוכנת אחת ניתוח אחד כדי לבצע את ניתוח

  1. MATLAB הפתוח והסוג "icsgui" בחלון הפקודה ולחץ על ENTER. ICS GUI הוא שם ההפעלה עבור תכנית ממשק מתאם ספקטרוסקופיה תמונת המשתמש גרפית.
  2. בGUI ICS לחץ על כרטיסיית "kICS". צילום מסך של חלון הניתוח מוצג באיור 1.
  3. מצא את התיקייה עם שם התיקייה "קוד MATLAB" ונווט עד הקובץ בשם הקובץ "סקריפטים" ולפתוח את זה על ידי לחיצה הכפולה עליו. לחלופין, לחץ לחיצה ימנית על הקובץ ובחר באפשרות "לפתוח עם MATLAB" או ללכת לקובץ, פתח בMATLAB ולפתוח את קובץ התסריטים. קובץ זה נקרא עורך.
  4. בגלילה לעורך "kICS טען ערכות נתונים", ואז להעתיק או שם קובץ של סוג ומיקום תיקייה לשורת הפקודה שמתחילהעם "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif" img = למשל. בשורת הפקודה שלהלן את מיקום התיקייה לקבוע את מספר המסגרות להיות מנותחים - למשל [1:500]. השתמש באותן הגדרות עבור כל הסרטים ברציפות בסדרת הנתונים. אם יש סחיפת התמקדות במסגרות מאוחר יותר, אלה צריכים להיות נכללים בניתוח.
  5. בעורך לחץ על "שמור" ולאחר מכן לחץ על "להעריך תא". בסיס הנתונים כעת נטען לתוך לתוך תוכנת הניתוח.
  6. בחלון kICS ניתוח בGUI, הזן את ההגדרות עבור הניתוח:
    1. בטל תיבות "תא T".
    2. הזן את המספר של זמן מפגר להיות מנותח. מספר פיגורי זמן (τ) יהיה השפעה על עלילת דיפוזיה וחייב להיבחר כך שעלילת דיפוזיה היא ליניארי. התחל עם כניסת 25 ולאחר מכן ירידה למקום שבי עלילת דיפוזיה היא ליניארי. τ הוא מספר בזמן מפגר ניתוח kICS משווה ולעתים חולפים זמן הוא ב הזמןetween מסגרת אחד למשנו. הערך הקטן ביותר שנותן עלילה ליניארית יש לבחור. המספר המרבי של זמן מפגר נבחר כך ליניארי בכושר מתקבל, בחירת ערך גבוה יותר יהיה לייצר נתונים שלא ניתן להתקין קו.
    3. הזן את k 2 הערך המרבי (ראה עיגול 1 באיור 1), זה בדרך כלל 20-50. K 2 עלילה טובה היא עלילה שבה קיימות נקודות נתונים רבות אשר מופצות לאורך קו. התחל עם כניסת 70 ולאחר מכן ירידה לאחר שהעריך את מגרשי k 2 ודיפוזיה ובחר את הערך הנמוך ביותר שבו נקודות נתוני המקבץ סביב קו ישר. ערך 2 k הוא גודל הריבוע של k-הווקטור המרחבי במרחב פורייה.
      בתחילה, הניתוח יש לחזור עד לערכים הטובים ביותר נקבעים, ואז להשתמש באותן הגדרות עבור כל הסרטים ברציפות בסדרת נתונים, אבל תמיד לבדוק שההגדרות שנבחרו לתת בכושר טוב לנתונים: k טוב 2 חלקותועלילת דיפוזיה ליניארי.
    4. לחץ על "הגדרות חנות ולהמשיך".
    5. לחץ על "כן" כדי להציג את כל הגרפים.
    6. לחץ על "סדרה טען תמונה" (ראה עיגול 2 באיור 1), ולאחר מכן לחץ על "סביבת עבודה".
    7. בחר "imgSerCrop", ולאחר מכן לחץ על "יבוא מסביבת העבודה".
    8. הזן את הגדרות אוסף מערכת הדמיה. ב" גודל פיקסל "תיבה להזין את גודל פיקסל מוקרן למערכת ההדמיה שבה ערימות התמונה נרכשות. לAQP3-EGFP, 0.111 היו בשימוש. בתיבה "הזן את השעה (ים) בין מסגרות", 0.1150 שימשו לAQP3-EGFP.
    9. לחץ על "בחר ROIs", הזן "1", לחץ על אישור ו" להשתמש בתמונה כולה ".
    10. לחץ על "ניתוח Do kICS" ולחץ כן לעשות "סינון נייח". תוצאות ייפתחו באופן אוטומטי כתמונות.
    11. למזער את חלון הגדרות, למזער את Windo מידע תאw, ולמזער את חלון photophysics. בחלון הדינמיקה, בדוק שעלילת דינמיקת תערוכות יניארי התאמה של הנתונים לקו עם שיפוע שלילי, כלומר נקודות נתונים לתאם ודיפוזיה חופשית ניתן להניח. רשום את מקדם הדיפוזיה לפיגור זמן המסוים וk 2 הגדרות (זה לא הכרחי לציין את סטיית התקן של הכושר). נקודות נתונים בk 2 המגרשים חייבים להיות התקבצו סביב הקו בזמן נתון מפגר.
    12. סמן את התיבה "שמור דמויות פתוחות כתמונות", לאחר מכן לחץ על "שמור דמויות פתוחות כתמונות" כדי לשמור לגרום קבצים. לשמור בתיקייה חדשה תחת C: Users Documents AQP3diffusion. לחץ על "הנתונים הנוכחיים ברורים" ותמשיך עם ניתוח של היבול הבא.

3. הממוצע של המקדם הדיפוזיה מחושבת מחושב כדי לקבל סקירה כללית של הנתונים שנותחו

  1. הזן את מקדמי דיפוזיה הבודדים מהחזר על השקעה בspreadsheet (הקפד לציין τ וk 2 ערכים), השתמש בשמות של הגידולים כאמור לעיל.
  2. לחשב את מקדם הדיפוזיה הממוצע וסטיית התקן באמצעות תכנית גיליון אלקטרוני.
  3. לבצע בדיקת קולמוגורוב-סמירנוב או סטודנטים מבחן t להעריך הבדלים סטטיסטיים באמצעות רמה מובהקת של 5%. השוואות Quantitave בין תאים (לדוגמא שטופלה לעומת nontreated) יכולות להתבצע.
  4. פתח את הגיליון האלקטרוני הגרסה של חלקות דיפוזיה שנוצרה על ידי תוכנת הניתוח עבור כל יבול, ומחשבים את ממוצע הנתונים עבור כל מצב עבור כל זמן השהיה. ליצור עלילת דיפוזיה ממוצע חדשה להצגת במסמכים או מצגות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לרכישת ערימות תמונה מתאימות להיות מנותח עם kICS, ניתן להשתמש מיקרוסקופ מערכות שונות. אפשר לנתח רצפי תמונה ממיקרוסקופ עלית הקרינה, כמו גם דיסק התקנת TIRF או ספינינג. הממברנה חייבת להיות שטוחה ללא כל האברונים בתא מרגש גדולים או העברת שלפוחית ​​/ אובייקטים. מאמר זה מציג תמונה ברצף הזמן לשגות של AQP3 מתויג עם EGFP בתאי MDCK חיים צילמו על מיקרוסקופ דיסק מסתובב עם פוקוס מוגדר קרום הפלזמה במסגרת שיעור של 9.2 הרץ. המוקד הוקם בקרום הפלזמה הבסיסי (תחתון). לאחרונה פורסמו נתונים בAJP נייד 13.

איור 2 א מראה תמונה של התא. Scalebar הוא 10 מ"מ וגידולי דוגמא את ההחזר על ההשקעה מודגשים במלבנים. לבחירה של גידולים חשוב לחתוך בפריפריה של התא שבו הקרום הוא אחיד ושטוח, כך שרק דיפוזיה דו ממדים היא מדמיין. Celאברונים ליטר, שלפוחית ​​ותחזיות קרום יש להימנע, וזה חשוב לניתוח כי אין להיסחף בזמן לשגות. דוגמאות לגידולים שהיו נכללו בניתוח מוצגות ב2B דמויות ו2C. שלפוחית ​​נעה לתרום למתאם (איור 2) וחורים בקרום אשר במקרה זה לנוע מעט (איור 2C) ברור שלא צריך להיות כלול בניתוח. כמו כן, חשוב שיבול ההחזר על ההשקעה הוא גדול מספיק כדי להיות דגימה מרחבית מספיקה לניתוח (להדמיה עם עדשה אובייקטיבית NA גבוה גודל ליניארי מינימאלי של 32 פיקסלים הוא קו מנחה סביר). למערך זה 60x (NA 1.40) היה בשימוש.

איור 3 א מציג את עלילת דיפוזיה של יבול אחד שנוצר עם kICS. בשיטה זו ניתן להשתמש בם כדי למצוא את מקדם הדיפוזיה של חלבון מתויג עם EGFP (או אחר חלבון פלואורסצנטי), צבעאו נקודות קוונטיות. שיפוע העקום בעלילת דיפוזיה הוא פשוט השלילי של מקדם הדיפוזיה. במקרה זה, מקדם דיפוזיה של AQP3-GFP היה .0104 ± .0040 מיקרומטר 2 / s. איור 3 הוא עלילת דיפוזיה מחושבת עם יותר מדי זמן בפיגור, במקרה זה הניתוח היה redone אבל עם פחות זמן מפגרים כל כך שעלילת דיפוזיה הוא ליניארי.

איור 4 א מציג k 2 עלילה טיפוסית. זוהי עקומת מתאם רדיאלית בממוצע וLN הפך לפער זמן שנבחר. מk 2 חלקות אלה המדרון זממו לעומת הזמן מפגר והתוצאה היא עלילת דיפוזיה כפי שמוצג באיור 3 א. כאשר בודקים 2 חלקות k, חשוב שהכושר מוערך. איור 4 היא דוגמא לak עלילה 2 שלשמה ניתן להסיק כי היבול הוא קטן מדי ולא יכולה להיות מנותחת כמו שצריך יש שיפוע שלילי וריקבון באופן ליניארי לרצפת רעש. איור 4C הוא דוגמא לעלילת ak 2 אשר צריכה להיות ניתוח מחודש עם k המרבי יופחת ערך 2 ככשיר הוא כבר לא טוב (כפי שנשפט על ידי השאריות גדלו בk הגדול יותר 2 ערכים). במקרה זה הניתוח יש להפעיל שוב נכנסים k 2 ערך מרבי נמוך יותר, במקרה זה 25.

איור 5 מראה עלילת דיפוזיה בממוצע בממוצע לכל 10 יבולים. עלילת דיפוזיה נמצאה בקובץ אקסל מהניתוח, וכל חלקות דיפוזיה כעת ניתן בממוצע לכל גידולים מאותו הניסוי. בעלילת דיפוזיה וכתוצאה מכך טיפולים שונים של התא יכולים להיות משולבים באותה הדמות. קווי מגמה מקבילים הם מקדמי דיפוזיה שווים וקווי מגמה מקבילים שאינם מצביעים על דיפוזיה לא שוויונית. בנתון זה, מקדם הדיפוזיה AQP3-EGFP מחושב (נתונים מAJP נייד 13).

= "Jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 1
איור 1. צילום מסך של חלון ניתוח kICS. בחלון זה ניתוח kiCS נעשה. החוגים מצביעים על אילו כפתורים ללחוץ לצעדים הבודדים בפרוטוקול. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. ספינינג תמונת דיסק של תא להביע GFP. (א) תמונה מייצגת של תא MDCK יציבות להביע AQP3-GFP וגידולי נציג שמוצגים. התמונה נרכשה על מיקרוסקופ דיסק מסתובב עם קרוב מוקד לקרום הפלזמה הבזליים. Repres (ב ') יבול entative, שלא נכלל בניתוח בkICS שכן יש שלפוחית ​​נעות, אשר יכול לתרום למקדם הדיפוזיה. (ג) דוגמא לחיתוך שיש בו חור בקרום, ובכך, היבול הזה לא נכלל בניתוח. כל הברים בקנה מידה הם 10 מיקרומטר. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. חלקות דיפוזיה. עלילת דיפוזיה נציג שבו כל הנקודה קרובה לקו המתאים (). זוהי עלילת דיפוזיה טובה, כי הנתונים הם ליניארי. (ב) דוגמא לעלילת דיפוזיה שלניתוח חייב להיות redone באמצעות מספר נמוך יותר של timelags. 3highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
איור 4. דוגמאות של k 2 מגרשים. (א) דוגמא של עלילת k 2 טובה שבה נקודות נתונים מופצות באופן שווה משני צדדיו של הקו לנכון. (ב) דוגמא של ak 2 מגרש ליבול קטן יותר מהגודל האופטימלי. בk 2 עלילה זו, השיפוע של הקו בכושר הוא חיובי, זה צריך להיות שלילי, ולכן היבול נכלל בניתוח. (C) עלילת 2 k זה מראה כי הניתוח חייב להיות redone עם k 2 ערך מרבי נמוך יותר כדי לבחור את החלק של עלילת k 2 היו נתונים מופצים באופן שווה משני צדיו של הקו לנכון.oad/51074/51074fig4highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5
איור 5., בממוצע עלילת דיפוזיה. ממוצע עלילת דיפוזיה שממוצע לכל 10 יבולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מאמר זה הציג סקירת צעד אחר צעד מפורטת של איך ליישם את שיטת ניתוח kICS לקבוע מקדמי דיפוזיה מתמונות מיקרוסקופית של חלבונים מתויגים עם חלבוני ניאון. הניתוח אינו תלוי בבחירת בדיקה עם טווח דינמי רחב מאוד בצפיפות תיוג ולכן יכול להיות מיושם גם לחלבונים שכותרתו עם נקודות קוונטיות, כמו גם צבעים וחלבונים ניאון כגון EGFP.

כדי לחשב את מקדמי דיפוזיה תקף לחלבונים, יש כמה שלבים קריטיים, אשר היה מותאמים. זה חיוני לחלבוני שכותרתו תמונה על הממברנה בלבד. אם יש חפצים נוספים כמו העברת שלפוחית ​​או אברונים בתא בתמונה ברצף כדי להיות מנותחים, אלה יתרמו למקדם הדיפוזיה מחושב שתוצאת מגזים בהערכה מתחת או של מקדם הדיפוזיה.

בצע את הצעדים המפורטים לעיל, קוד GUI עבור kICS רק משתמש ידידותיnd ניתוח הוא מהיר. היא כוללת מספר צעדים בממוצע: כולל הן את המיצוע המעגלי וחישוב השיפוע של עלילת דיפוזיה מדרונות כפונקציה של זמן מפגר, המאפשר לדור מהיר של ערך ממוצע ומובהק סטטיסטי למקדם הדיפוזיה. כך, בהשוואה לניתוח הנרחב הדרוש כדי לחשב מקדמי דיפוזיה מהניסויים SPT, kICS הוא ידידותי למשתמש, מהיר ויכול להתבצע ללא הכשרה מיוחדת בביופיזיקה.

אם ניתוח תוצאות במקדם הדיפוזיה שלילי או עלילת דיפוזיה אופקית, בעיות ירי כולל בדיקה ויזואלית של היבול כדי לראות אם הוא ממלא את כל הדרישות שתוארו כאן. גידולים שהם קטנים מדי יכולים להניב מקדמי דיפוזיה שליליים unphysical וחייבים להיות מושלכים. על מנת לחשב את מקדם הדיפוזיה, הוא לעתים קרובות ניתן לבצע יבול חדש במקומות אחרים בבסיס הנתונים אשר מתאים לניתוח או פשוט להגדיל את היבולגודל, אם אפשר.

טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על רוב מערכי נתונים, אך כיום, ניתוח kICS יכול רק לחשב מקדם הדיפוזיה ממוצע ולא מבחינים בין דפוסי נדידת חלבון שונים או ליצור מסלולים. שימוש kICS, יכולים בקלות להיות מופקים מקדמי דיפוזיה ודיפוזיה של חלבון ניתן להשוות למשל בין תאים שטופלו ולא טופלו או בין wild-type ו מוטציה בחלבון, שיגלה אם טיפול של מוטציות לגרום להבדלים בדיפוזיה ולכן פוטנציאל בחלבונים ו / או אינטראקציות חלבון שומנים בדם. דיפוזיה קרום פלזמה של AQP2 נמדדה על ידי FRAP הוצגה יורדת עם תוספת של forskolin, אגוניסט cAMP 10, ויותר מכך, בחדר המיון, גרסת מוטציה של AQP2 גרימת סוכרת תפלה nephrogenic, מתפזרת באופן שונה מאשר wildtype AQP2 9.

למרות שניתן לחשב מקדמי דיפוזיה מד החלקיק יחידאתא באמצעות תזוזה ממוצעת בריבוע, ניתוח גודל צעד או מתאם ספקטרוסקופיה תמונת חלקיקי 2,11,12, שיטות ניתוח אלה ניתן המחשוב תובעני ולעתים קרובות דורשות שנכתבו אלגוריתמי מחשב מותאם אישית. היתרון של פרוטוקול kICS שהוצג כאן הוא שזה הוא עצמאי יחסית של צפיפות תיוג וקל המחשוב. וכך הטיול הזה באמצעות ניתוח kICS יהיה שימושי עבור ביולוגים סלולריים רבים, שיכול בקלות ליישם אותו לחלבון קרום עניין שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מלגה לונדבק Junior קבוצת לידר לLNN. PWW מכיר בתמיכה במימון מענק ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC). אנו מודים גם מולקולרי מרכז bioimaging הדנית באוניברסיטת דרום דנמרק לגישה לספינינג מיקרוסקופ דיסק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 31600-083
FBS Invitrogen 10082147
Penicilin   Sigma 13752
Kanamycin Gibco 15160070
Streptomycin Gibco 11860038
Phenol red free medium Gibco 11880-028
DMSO Sigma D8418
HEPES Gibco 15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope Nikon Ti Eclipse
EMCCD Camera Andor Ixon+

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
  2. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
  3. Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
  4. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
  5. Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
  6. Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
  8. Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
  9. Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
  10. Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
  11. Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
  12. Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
  13. Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
קל מדידה של מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה פלזמה מתויגים-EGFP באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונת k-Space
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).More

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter