Summary
Questo documento fornisce una guida passo per passo per la tecnica di analisi fluttuazione k-Image Space Correlation Spectroscopy (CCI) per misurare i coefficienti di diffusione delle fluorescente proteine di membrana plasmatica in cellule di mammifero vive.
Abstract
Diffusione laterale e la compartimentalizzazione delle proteine di membrana del plasma sono strettamente regolati nelle cellule e, quindi, lo studio di questi processi saranno rivelare nuovi spunti per la funzione delle proteine di membrana plasmatica e la regolamentazione. Recentemente, k-spazio correlazione Immagine Spectroscopy (CCI) 1 è stato sviluppato per consentire misurazioni di routine di coefficienti di diffusione direttamente dalle immagini delle proteine di membrana plasmatica con targhetta modo fluorescente, che evitate distorsioni sistematiche introdotte dal fotofisica sonda. Sebbene la base teorica per l'analisi è complessa, il metodo può essere implementato da non esperti utilizzando un codice liberamente disponibile per misurare coefficienti di diffusione di proteine. CCI calcola una funzione di correlazione tempo da una pila di microscopia a fluorescenza dopo trasformazione di Fourier di ogni immagine reciproca spazio (k-). Successivamente, media circolare, logaritmo naturale trasformare e lineare adatta per la funzione di correlazione produce il coefficiente di diffusione. Questodocumento fornisce una guida step-by-step per l'analisi delle immagini e la misurazione dei coefficienti di diffusione via CCI.
In primo luogo, un frame rate elevato sequenza di immagini di una proteina di membrana plasmatica fluorescente viene eseguita utilizzando un microscopio a fluorescenza. Poi, è selezionata una regione di interesse (ROI) evitando organelli intracellulari, vescicole mobili o sporgenti regioni di membrana. Lo stack ROI viene importato in un codice liberamente disponibile e diversi parametri definiti (vedi sezione Method) sono impostati per l'analisi CCI. Il programma genera quindi un "pendio di piste" complotto dalle funzioni di tempo di correlazione k-spazio, e il coefficiente di diffusione è calcolato dalla pendenza del grafico. Qui di seguito è una procedura step-by-step CCI per misurare il coefficiente di diffusione di una proteina di membrana utilizzando l'renale canale di acqua aquaporin-3 con etichetta EGFP come un esempio canonico.
Introduction
L'organizzazione spazio-temporale quadridimensionale e mobilità laterale delle proteine di membrana di plasma sono strettamente regolati e possono svolgere un ruolo nella funzione della proteina, l'attività e le interazioni proteina-proteina. Diffusione laterale delle proteine di membrana del plasma, è tradizionalmente stata studiata calcolando i coefficienti di diffusione per singole particelle di time-lapse imaging di quantum dot o tingere etichettati proteine della membrana plasmatica 2-4. Questo approccio richiede l'inserimento di un tag extracellulare della proteina di membrana plasmatica per quantum dot o etichettatura colorante, che può compromettere folding e la funzione e, quindi, non può essere raggiunto per alcune proteine. Il volume sterico di un punto quantico ha dimostrato di rallentare la diffusione della proteina 5 ed inoltre, solo una piccola frazione delle proteine nella popolazione rechino punti quantici, e non è noto se la frazione è rappresentativa del totale pool di proteine di membrana plasmatica. TRA singola particellacking (SPT) misurazioni dei coefficienti di diffusione di immagine serie di proteine marcate quantum dot coinvolge la mappatura delle posizioni di punta impressi delle particelle con bidimensionale gaussiano si adatta seguiti da ampie algoritmi di analisi. L'analisi è computazionalmente molto intenso, che richiede un'ampia curva non lineare adatta in ogni fotogramma l'immagine di una sequenza di time-lapse per approssimazioni della funzione microscopio punto di spread (tipicamente bidimensionale gaussiane spaziale) e il successivo collegamento delle posizioni delle particelle in traiettorie delle particelle descrive l' moto delle singole molecole 6,7.
Un'immagine tecnica di correlazione sviluppata di recente, k-spazio Image Correlation Spectroscopy (CCI) permette semplici misurazioni relative di coefficienti di diffusione di fluorescenza tagged proteine di membrana del plasma. La possibilità di calcolare regolarmente coefficienti di diffusione delle proteine di membrana marcate con proteine fluorescenti da CCI è uno strumento unico che tienediversi vantaggi rispetto quantum dot tradizionale analisi SPT: Non è richiesto alcun inserimento di tag extracellulari e richiede tempo etichettatura extracellulare (linee cellulari che esprimono proteine fluorescenti possono essere utilizzati); coefficienti di diffusione sono estratti dal pool totale di proteine fluorescenti rispetto a un sottoinsieme etichettato con punti quantici; analisi è semplice, senza la necessità di monitorare singole proteine e l'analisi può essere eseguita utilizzando un codice esistente senza necessità di programmazione utente aggiuntivo. Il metodo è veloce perché è una tecnica che permette il calcolo della media veloce e calcolo dei coefficienti di diffusione. Queste misure diffusione rapidi per la popolazione proteina completano le informazioni più dettagliate trasporto molecolare ottenuto per un sottoinsieme della popolazione dai metodi SPT scrupoloso.
tempo CCI correla microscopia a fluorescenza sequenze di immagini che sono stati prima trasformati in spazio di Fourier, e quindi separa flfluttuazioni uorescence dovute a fotofisica da quelli dovuti al trasporto molecolare 1. Come risultato, CCI possono determinare la densità numerica, velocità di flusso, e la diffusione di fluorescente molecole marcate pur essendo distorti da fotoscolorimento complesso o lampeggiante dei fluorofori. Questo rende CCI uno strumento utile per determinare rapidamente la dinamica di diffusione di proteine della membrana cellulare fluorescenza marcata senza la necessità di algoritmi di scrittura personalizzati. Proteine Oltre fluorescente, CCI possono essere applicate anche a Quantum Dot-marcato proteine di membrana 8.
Questo documento fornisce un'introduzione step-by-step di come usare CCI per estrarre i coefficienti di diffusione delle proteine di membrana plasmatica EGFP-taggate dimostrando come posizionare il raccolto, come utilizzare il codice e come valutare le trame generate, da cui diffusione coefficienti vengono estratti. Come esempio, i dati ottenuti facendo girare insieme di dischi-microscopia a riflessione interna totale semi-fluorescenzaModalità nce (TIRF), di una proteina renale canale di acqua aquaporin-3 (AQP3) con etichetta EGFP è presentato.
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Protocol
Acquisizione di proteine EGFP-tag nella membrana plasmatica di analisi CCI può essere fatto su un microscopio a epifluorescenza, una configurazione TIRF o su un microscopio disco rotante impostato per acquisire immagini della membrana di interesse. La dimensione pixel fotocamera così come il tempo tra i fotogrammi immagine è necessario per l'analisi. Sequenze di immagini di 100-1,200 fotogrammi a una frequenza di 4-30 Hz possono essere utilizzate per l'analisi. Durante l'acquisizione, è importante mantenere la membrana a fuoco per tutta la durata della rappresentazione e concentrarsi su una frazione della membrana piatta in cui la fluorescenza è distribuita uniformemente. Spostamento di vescicole, sporgenti regioni di membrana e organelli cellulari può essere tagliata fuori più avanti nel processo di analisi. Il tempo di acquisizione dovrebbe essere scelta in modo che non vi è nessuna deriva o movimento della cellula.
Per ottenere gli script di codice CCI per MATLAB, contattare Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). La prima volta che il codice CCI viene utilizzato, MAT apertoLAB e fare clic su File, quindi impostare il percorso, quindi aggiungere con sottocartelle e trovare la cartella nel computer in cui si trova il codice CCI. Quindi fare clic su ok, salvare e chiudere. Continuare ora con l'analisi di colture descritte nei punti successivi.
1. Importare la sequenza di immagini d'interesse in un programma di analisi di imaging come TIFF Stack
Salvare il file con il nome: stack1.tif.
- Selezionare una regione rettangolare di interesse (ROI) in corrispondenza della parte piatta della membrana escluse organelli cellulari mobili e sporgente regioni di membrana. La dimensione raccolto è scelto in modo che un numero sufficiente di statistiche vengono generati per il bene k 2 terreni.
- Ritagliare la regione e salvare il raccolto come file TIFF in una cartella appropriata. Se ci sono più colture dal film stesso, utilizzare un numero minimo, per esempio "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
- Posizionare la cartella contenente i raccolti a livello localesul computer, non su un server, mentre si fa l'analisi CCI.
2. Importare le colture nel software di analisi One by One per eseguire l'analisi
- Aprire MATLAB e digitare "icsgui" nella finestra di comando e premere INVIO. ICS GUI è il nome del file eseguibile del programma di grafica dell'interfaccia utente spettroscopia di correlazione di immagine.
- Nella GUI ICS fare clic sulla scheda "CCI". Una schermata della finestra di analisi è illustrata nella Figura 1.
- Trovare la cartella con il nome della cartella "codice MATLAB" e scorrere fino al file con il nome del file "Script" e aprire con un doppio clic su di esso. In alternativa, fate clic destro sul file e selezionare "Apri con MATLAB" o vai su File, Apri in MATLAB e aprire il file script. Questo file si chiama Editor.
- Sul rotolo Editor per "CCI carico set di dati", quindi copiare o nome file tipo e la posizione della cartella nella linea di comando che iniziacon img = ad esempio "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". Nella riga di comando sotto il percorso della cartella impostare il numero di fotogrammi da analizzare - per esempio [1:500]. Utilizzare le stesse impostazioni per tutti i film consecutivi nella serie di dati. Se c'è deriva fuoco in frame successivi, questi dovrebbero essere esclusi dall'analisi.
- Nell'editor fare clic su "salva" e poi cliccare su "valutare cella". Il set di dati viene caricato in nel software di analisi.
- Nella finestra Analisi CCI nella GUI, immettere le impostazioni per l'analisi:
- Deselezionare le caselle "cellule T".
- Inserisci il numero di scarti temporali da analizzare. Il numero di intervalli di tempo (τ) avrà effetto sulla trama di diffusione e deve essere scelta in modo che la trama diffusione è lineare. Inizia con l'immissione di 25 per poi diminuire al punto in cui la trama diffusione è lineare. τ è il numero di Tempi di attesa dell'analisi CCI confronta e un tempo di ritardo è il tempo bra un fotogramma e il successivo. Dovrebbe essere selezionato il valore più piccolo che dà una trama lineare. Il numero massimo di sfasamenti temporali è scelto in modo da ottenere una misura lineare, scegliendo un valore elevato produce dati che non possono essere montati linea.
- Inserire il valore massimo k 2 (vedi cerchio 1 in figura 1), è di solito 20-50. Un buon k 2 trama è una trama in cui ci sono molti punti di dati che sono distribuiti lungo una linea. Inizia all'entrata 70 e poi diminuire dopo aver valutato le k 2 e diffusione trame e selezionare il valore più basso in cui il cluster punti dati attorno ad una linea retta. Il valore k 2 è la grandezza quadrata della k-vettore spaziale nello spazio di Fourier.
Inizialmente, l'analisi deve essere ripetuta fino a quando vengono determinati i valori migliori, quindi utilizzare le stesse impostazioni per tutti i film consecutivi nella serie di dati, ma sempre verificare che le impostazioni selezionate danno una buona misura per i dati: buona k 2 piazzolee una trama diffusione lineare. - Fare clic su "Impostazioni negozio e procedere".
- Fare clic su "sì" per visualizzare tutti i grafici.
- Fare clic su "serie di immagini Load" (vedi cerchio 2 in Figura 1), poi cliccare su "area di lavoro".
- Selezionare "imgSerCrop", quindi fare clic su "Importa da lavoro".
- Immettere le impostazioni della raccolta sistema di imaging. Nella "dimensione pixel" casella immettere la dimensione dei pixel previsto per il sistema di imaging in cui le pile di immagini vengono acquisite. Per AQP3-EGFP, 0.111 è stato utilizzato. Nella casella "Immettere il tempo (s) tra i fotogrammi", 0,1150 è stato utilizzato per AQP3-EGFP.
- Fare clic su "seleziona ROI", inserire "1", fare clic su ok e "usare tutta l'immagine".
- Fare clic su "Analisi Do CCI" e fare clic su Sì per fare "filtraggio immobile". I risultati si apriranno automaticamente le immagini.
- Minimizzare la finestra delle impostazioni, ridurre al minimo le informazioni cellule window, e ridurre al minimo la finestra fotofisica. Nella finestra dinamiche, verificare che la trama dinamica mostra un fit lineare dei dati a una linea con una pendenza negativa significa che i punti dati correlano e libera diffusione può essere assunta. Registrare il coefficiente di diffusione per l'intervallo di tempo specifico e k 2 impostazioni (non è necessario rilevare la deviazione standard del fit). I punti dati in k 2 terreni devono essere raggruppati attorno alla linea per il tempo determinato ritardi.
- Barrare la casella "Salva figure aperte come immagini", quindi fare clic su "Salva figure aperte come immagini" per salvare i file risultato. Salvare in una nuova cartella in C: Users Documenti AQP3diffusion. Fare clic su "dati attuali chiara" e proseguire con l'analisi del prossimo raccolto.
3. Medio del coefficiente di diffusione calcolata è calcolato per ottenere una panoramica dei dati analizzati
- Immettere i coefficienti di diffusione individuali di ogni ROI in un SPREadsheet (assicuratevi di annotare il τ e k 2 valori), utilizzare i nomi delle colture, come stabilito in precedenza.
- Calcolare il coefficiente medio di diffusione e la deviazione standard utilizzando un foglio di calcolo.
- Eseguire un test di Kolmogorov-Smirnov o studenti t-test per valutare le differenze statistiche utilizzando un livello di significatività del 5%. Confronti Quantitave tra le cellule (per esempio trattati vs non trattati) possono essere fatte.
- Aprire la versione foglio delle piazzole di diffusione che è stato generato dal software di analisi per ciascuna coltura, e nella media dei dati per ciascuna condizione per ogni intervallo di tempo. Genera una nuova trama diffusione media per la presentazione di documenti o presentazioni.
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Representative Results
Per acquisire stack di immagini adatte ad essere analizzati con CCI, possono essere utilizzati diversi sistemi microscopio. È possibile analizzare sequenze di immagini da un microscopio epi-fluorescenza, nonché una configurazione disco TIRF o filatura. La membrana deve essere piatta, senza grandi organelli cellulari in movimento o lo spostamento di vescicole / oggetti. Questo articolo presenta una sequenza di immagini lasso di tempo di AQP3 con etichetta EGFP in cellule MDCK vive impressi su un microscopio disco rotante con messa a fuoco impostato alla membrana plasmatica ad un frame rate di 9.2 Hz. La messa a fuoco è stato fissato al livello della membrana plasmatica basale (in basso). I dati sono stati recentemente pubblicato in AJP Cella 13.
Figura 2A mostra un'immagine della cella. La barra di scala è di 10 mm e coltivazioni esempio ROI sono evidenziate in rettangoli. Per la selezione delle coltivazioni è importante ritagliare alla periferia della cella in cui la membrana è uniforme e piana in modo che solo una diffusione bidimensionale viene visualizzato. Celorganelli L, vescicole e proiezioni di membrana dovrebbe essere evitata ed è importante per l'analisi che non c'è deriva durante il lasso di tempo. Esempi di colture che sarebbero esclusi dall'analisi sono presentati nelle Figure 2B e 2C. Vescicole spostano contribuiscono alla correlazione (Figura 2B) e fori nella membrana che in questo caso si muovono leggermente (Figura 2C) ovviamente non dovrebbero essere inclusi nell'analisi. E 'anche importante che il raccolto ROI è abbastanza grande per avere campionamento spaziale sufficiente per l'analisi (per l'imaging con un elevato lente obiettivo NA una dimensione minima lineare di 32 pixel è un'indicazione ragionevole). Per questo insieme di dati è stato utilizzato un 60X (NA 1,40).
Figura 3A mostra la trama diffusione di una coltura generata con le CCI. Questo metodo può essere utilizzato per individuare il coefficiente di diffusione di una proteina marcata con EGFP (o un'altra proteina fluorescente), un coloranteo punti quantici. La pendenza della curva nel grafico diffusione è semplicemente il negativo del coefficiente di diffusione. In questo caso, il coefficiente di diffusione di AQP3-GFP era 0,0104 ± 0,0040 micron 2 / s. Figura 3B è un grafico diffusione calcolata con troppi sfasamenti temporali, in questo caso è stato rifatto l'analisi, ma con meno sfasamenti temporali in modo che la trama diffusione è lineare.
Figura 4A presenta una tipica k 2 trama. Questa è la curva di correlazione radialmente media e ln trasformata per un intervallo di tempo selezionato. Da questi k 2 trame la pendenza è tracciata in funzione del tempo ritardo e il risultato è la trama diffusione come mostrato nella Figura 3A. Quando si controlla la k 2 terreni, è importante che la misura viene valutata. Figura 4B è un esempio di ak 2 trama per cui si può concludere che il raccolto è troppo piccola e non poteva essere analizzato come dovrebbeha una pendenza negativa e decadimento lineare ad un rumore di fondo. Figura 4C è un esempio di ak 2 trama che deve essere rianalizzato con un valore ridotto k massimo 2 come la misura non è più buona (come giudicato dalle crescenti residui in formato grande k 2 valori). In questo caso l'analisi deve essere eseguito nuovamente immettendo un valore più basso massimo k 2, in questo caso 25.
La Figura 5 mostra un diagramma di diffusione media in media oltre 10 colture. La trama di diffusione è stato trovato nel file excel dall'analisi, e tutte le trame di diffusione può essere media per tutte le colture dello stesso esperimento. Nella trama diffusione risultante diversi trattamenti della cella possono essere combinati nella stessa figura. Linee di tendenza parallele sono coefficienti uguali diffusione e linee di tendenza non parallele indicano la diffusione disuguale. In questa figura, il coefficiente di diffusione AQP3-EGFP è calcolato (dati AJP cellulare 13).
Figura 1. Schermata della finestra di analisi CCI. In questa finestra l'analisi CCI è fatto. I cerchi indicano i pulsanti da premere per le singole fasi del protocollo. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Immagine disco di una cellula che esprime GFP Spinning. (A) immagine rappresentativa di una cellula MDCK esprimono stabilmente AQP3-GFP e colture rappresentative indicate. L'immagine viene acquisita su un microscopio disco rotante con messa a fuoco vicino alla membrana plasmatica basale. (B) Repres coltura sentante, che è stato escluso dall'analisi in CCI in quanto ci sono vescicole in movimento, che possono contribuire al coefficiente di diffusione. (C) Un esempio di una coltura in cui vi è un foro nella membrana, quindi, questa coltura è stata esclusa dall'analisi. Tutte le barre di scala sono 10 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Appezzamenti di diffusione. (A) Una trama di diffusione rappresentativo in cui tutti i punti sono vicini alla linea di misura. Questa è una buona trama di diffusione, perché i dati sono lineari. (B) Un esempio di un diagramma di diffusione per cui l'analisi deve essere rifatta utilizzando un numero inferiore di timelags. 3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 4. Esempi di k 2 terreni. (A) Un esempio di un buon k 2 trama in cui i punti sono distribuiti uniformemente su entrambi i lati della linea di misura. (B) Un esempio di ak 2 trama di un raccolto inferiore alla dimensione ottimale. In questo k 2 trama, la pendenza della retta interpolante è positivo, dovrebbe essere negativa e quindi la coltura viene esclusa dall'analisi. (C) k 2 Questo grafico mostra che l'analisi deve essere rifatta con un valore più basso massimo k 2 per selezionare la parte della trama k 2 erano i dati sono distribuiti uniformemente su entrambi i lati della linea di misura.oad/51074/51074fig4highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 5. Averaged trama diffusione. Una media di trama diffusione che è stata in media più di 10 colture.
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Discussion
Questo documento presenta una panoramica dettagliata passo-passo su come applicare il metodo di analisi CCI per determinare i coefficienti di diffusione di immagini di microscopia di proteine marcate con proteine fluorescenti. L'analisi è indipendente dalla scelta sonda con una ampia gamma dinamica della densità etichettatura e può quindi essere applicato anche per proteine marcate con punti quantici così come coloranti e proteine fluorescenti come la EGFP.
Per calcolare coefficienti di diffusione validi per le proteine, ci sono diversi passaggi critici, che sono ottimizzate. È essenziale immagine proteine marcate su solo la membrana. Se ci sono oggetti aggiuntivi come movimento vescicole o organelli cellulari in sequenza immagini da analizzare, questi contribuiscono al coefficiente di diffusione calcolato che si traduce in sotto-o sovrastima del coefficiente di diffusione.
Seguendo i passi di cui sopra, il codice GUI per CCI è facile da usare unnd analisi è rapida. Esso comprende diversi passaggi in media compresi sia la media circolare e il calcolo della pendenza di trama piste diffusione come funzione del tempo di ritardo, che facilita pratica generazione di un valore medio e statisticamente significativa per il coefficiente di diffusione. Così, rispetto alla vasta analisi necessari per calcolare i coefficienti di diffusione da esperimenti SPT, CCI è facile da usare, rapida e può essere eseguita senza una formazione specializzata in biofisica.
Se l'analisi si traduce in un coefficiente di diffusione negativo o una trama diffusione orizzontale, trouble-shooting comprende ispezione visiva della coltura per vedere se soddisfa tutti i requisiti qui descritti. Coltivazioni che sono troppo piccole possono produrre coefficienti di diffusione negativi unphysical e devono essere scartati. Per calcolare il coefficiente di diffusione, è spesso possibile creare un nuovo raccolto altrove nel set di dati che è adatto per l'analisi o semplicemente aumentare il raccoltoformato se possibile.
Questa tecnica può essere applicata alla maggior parte dei gruppi di dati ma attualmente, analisi CCI può solo calcolare un coefficiente medio di diffusione e non possono distinguere diversi modelli di migrazione proteina o generare traiettorie. Utilizzando CCI, coefficienti di diffusione possono essere facilmente estratti e diffusione di una proteina può essere paragonato ad esempio tra cellule trattate e non trattate o tra un wild-type e una proteina mutante, che rivela se il trattamento di mutazioni indurre differenze di diffusione e quindi potenzialmente in proteina-proteina e / o le interazioni proteina-lipide. Membrana plasmatica diffusione di AQP2 misurata da FRAP ha dimostrato di diminuire in seguito all'aggiunta di forskolina, un agonista cAMP 10, e inoltre, nel ER, una versione mutata di AQP2 causando diabete insipido nefrogenico, diffusa diverso rispetto tipo selvatico AQP2 9.
Anche se è possibile calcolare i coefficienti di diffusione da sola particella data utilizzando media cilindrata quadrata, analisi passo o la particella immagine spettroscopia di correlazione 2,11,12, questi metodi di analisi possono essere computazionalmente impegnativi e spesso richiedono personalizzata scritta algoritmi informatici. Il vantaggio del protocollo CCI qui presentato è che è relativamente indipendente dalla densità etichettatura e computazionalmente facile. Questa passeggiata attraverso analisi CCI sarà quindi utile per molti biologi cellulari, che possono facilmente applicare alla loro proteina di membrana di interesse.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una Lundbeck Junior Capo Gruppo Fellowship a LNN. PWW riconosce il sostegno finanziamenti provenienti scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC). Ringraziamo anche il danese Molecolare Bioimmagini Center presso University of Southern Denmark di accesso a spinning microscopio disco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 31600-083 | |
| FBS | Invitrogen | 10082147 | |
| Penicilin | Sigma | 13752 | |
| Kanamycin | Gibco | 15160070 | |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | |
| Phenol red free medium | Gibco | 11880-028 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Apparatus | |||
| Spinning Disk Microscope | Nikon | Ti Eclipse | |
| EMCCD Camera | Andor | Ixon+ |
References
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
