Easy Måling av diffusjonskoeffisienter av EGFP-merket plasma membran Proteiner Bruke k-Space Bilde Korrelasjon spektroskopi

Summary

Denne artikkelen gir en trinnvis guide til svingninger analyseteknikken k-Space Bilde Korrelasjon spektroskopi (kICS) for å måle diffusjonskoeffisienter av fluorescensmerkede plasma membran proteiner i levende pattedyrceller.

Abstract

Lateral spredning og compartmentalization av plasma membran proteiner er strengt regulert i celler og dermed vil studere disse prosessene avsløre nye innsikter til plasma membran protein funksjon og regulering. Nylig, k-Space Bilde korrelasjon spektroskopi (kICS) ¹ ble utviklet for å muliggjøre rutinemålinger av diffusjonskoeffisienter direkte fra bilder av fluorescently merkede plasma membran proteiner, som unngikk systematiske skjevheter introdusert av probe photophysics. Selv om det teoretiske grunnlag for analysen er komplekse, kan fremgangsmåten gjennomføres ved nonexperts ved hjelp av en fritt tilgjengelig kode for å måle diffusjonskoeffisienter i proteiner. kICS beregner en tid korrelasjon funksjon fra en fluorescens mikrosbildestakk etter Fourier transformasjon av hvert bilde til gjensidige (k-) plass. Deretter sirkulær gjennomsnitt, naturlig logaritme transformere og lineær passer til korrelasjonen funksjonen gir den diffusjonskoeffisienten. DetteArtikkelen gir en steg-for-steg guide til bildeanalyse og måling av diffusjonskoeffisienter via kICS.

Først blir en høy bildefrekvens bildesekvens fra et fluorescensmerkede plasmamembranprotein ervervet ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Så, er en region av interesse (ROI) unngå intracellulære organeller, flytting vesikler eller utstående membran regioner valgt. Den avkastningen stabelen importeres til en fritt tilgjengelig kode og flere definerte parametere (se metode kapittel) er satt for kICS analyse. Programmet genererer deretter en "skråningen av bakkene" plottet fra k-space tid korrelasjonsfunksjoner, og spredningen koeffisienten beregnes fra skråningen av tomten. Nedenfor er en steg-for-steg kICS prosedyre for å måle spredningen koeffisient av en membran protein ved hjelp av nedsatt vann kanal aquaporin-3 tagget med EGFP som en kanonisk eksempel.

Introduction

Den firedimensjonal tid og rom organisering og lateral mobilitet av plasmamembranproteiner er strengt regulert, og kan spille en rolle i proteinfunksjon, aktivitet og protein-protein interaksjoner. Lateral spredning av plasma membran proteiner, har tradisjonelt blitt studert ved å beregne diffusjonskoeffisienter for enkeltpartikler fra time-lapse avbildning av quantum dot eller dye merket plasma membran proteiner ^2-4. Denne tilnærmingen krever innsetting av et ekstracellulært tag i plasmamembranprotein for quantum prikk eller fargestoff merking, som kan kompromittere proteinfolding og funksjon og derved kan ikke oppnås for noen proteiner. Den sterisk volum av et kvantesprang dot har vist seg å forsinke diffusjonen av proteinet ⁵ og dessuten bare er en liten brøkdel av proteinene i populasjonen merket med quantum prikker, og det er ikke kjent om denne fraksjon er representativt for den totale pool av plasma membran proteiner. Enkelt partikkel tracking (SPT) målinger av diffusjonskoeffisienter fra bildeserie av quantum dot merkede proteiner innebærer kartlegging de fotografert topposisjonene av partiklene med todimensjonal Gaussian passer fulgt av omfattende analyse algoritmer. Analysen er beregningsmessig svært intensiv, som krever omfattende ikke-lineær kurvetilpasning i hvert bilderammen fra en intervallsekvensen til tilnærmelser av mikroskopet punktspredefunksjon (typisk to-dimensjonal romlig Gaussians), og etterfølgende kobling av partikkelposisjoner i partikkelbaner som beskriver bevegelse av enkle molekyler ^6,7.

En nylig utviklet bilde korrelasjon teknikk, k-Space Bilde Korrelasjon spektroskopi (kICS) gjør relative enkle målinger av diffusjonskoeffisienter av fluorescently tagget plasma membran proteiner. Muligheten til rutinemessig beregne diffusjonskoeffisienter av membran proteiner merket med fluorescerende proteiner ved kICS er et unikt verktøy som holderflere fordeler fremfor tradisjonelle quantum dot SPT-analyse: Ingen innsetting av ekstracellulære koder og tidkrevende ekstracellulære merking er nødvendig (cellelinjer som uttrykker fluorescerende proteiner kan anvendes); diffusjonskoeffisienter blir trukket ut fra den totale pool av fluorescerende proteiner sammenlignet med en delmengde som er merket med kvanteprikker; Analysen er enkel, uten behov for å spore enkle proteiner, og analysen kan utføres ved å bruke en eksisterende kode uten krav om økt brukerprogrammering. Metoden er hurtig, fordi det er en midlingsteknikk som muliggjør rask beregning og beregning av diffusjonskoeffisienter. Disse raske diffusjon målinger for protein befolkningen utfylle mer detaljert molekylær transport informasjon innhentet for en undergruppe av befolkningen av de møysommelig SPT metoder.

kICS tid korrelerer fluorescens mikrosbildesekvenser som har første blitt forvandlet til Fourier plass, og dermed skiller fluorescence svingninger som følge av photophysics fra de som skyldes molekylære transport ^en. Som et resultat, kan kICS bestemme antall tetthet, strømningshastighet, og spredning av fluorescensmerkede molekyler som samtidig er objektivt ved komplekse fotobleking eller blinking av fluoroforer. Dette gjør kICS et nyttig verktøy for raskt å bestemme diffusjon dynamikken i fluorescently-merket celle membran proteiner uten å måtte tilpassede skrive algoritmer. Foruten fluorescensmerkede proteiner, kan kICS også brukes på quantum dot-merket membran proteiner ^åtte.

Denne artikkelen gir en trinn-for-trinn innføring av hvordan du bruker kICS å trekke diffusjonskoeffisienter av EGFP-tagget plasma membran proteiner ved å demonstrere hvordan man skal plassere beskjære, hvordan å bruke koden, og hvordan man skal vurdere de genererte tomter, som diffusjon koeffisientene er hentet. Som et eksempel av data som oppnås fra den roterende disk-mikroskopi-apparatet i semi-total intern refleksjon fluoresceNCE (TIRF) modus, av en nedsatt vann kanal protein aquaporin-3 (AQP3) merket med EGFP presenteres.

Protocol

Oppkjøp av EGFP-merket proteiner i plasmamembranen for kICS analyse kan gjøres på en epifluorescence mikroskop, en TIRF oppsett eller på en roterende disk mikroskop satt til å hente bilder av membranen av interesse. Kameraet pikselstørrelse, så vel som tiden mellom bilderammer som er nødvendig for analysen. Bilde sekvenser av 100-1,200 rammer ved en frekvens på 4-30 Hz kan anvendes for analyse. Under kjøpet, er det viktig å holde membranen i fokus gjennom hele varigheten av avbildning, og fokusere på en brøkdel av den flate membran der fluorescens er jevnt fordelt. Flytte vesikler, utstående membran regioner og celleorganeller kan beskjæres ut senere i analyseprosessen. Ervervet tid bør velges slik at det ikke er noen drift eller bevegelse av cellen.

For å få kICS kode skript for MATLAB, kontakt Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). Den første gangen kICS koden brukes, åpner MATLAB og klikk på Fil, og deretter sette banen, klikk deretter legge med undermapper og finn mappen på datamaskinen der kICS kode er lokalisert. Deretter klikker ok, lagre og lukke. Nå fortsetter med analysen av avlinger er beskrevet i de neste punktene.

En. Importer bildesekvens av interesse i en Imaging Analysis Program som en TIFF Stack

Lagre filen med navnet: stack1.tif.

1. Velg et rektangulært område av interesse (ROI) ved den flate delen av membranen uten bevegelige celleorganeller og utstikkende membranregionene. Avlingen størrelse er valgt slik at nok statistikk genereres for god k ^to tomter.
2. Beskjær regionen og redde avlingen som en TIFF-fil i en passende mappe. Hvis det er flere avlinger fra samme film, kan du bruke en nummerøkning, for eksempel "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
3. Plasser mappen som inneholder avlinger lokaltpå datamaskinen, ikke på en server, mens de gjør kICS analyse.

2. Importer Avlinger inn i Analysis Software One by One å utføre analysen

1. Åpne MATLAB og type "icsgui" i kommandovinduet og trykker ENTER. ICS GUI er den kjørbare navn for bildet korrelasjon spektroskopi grafisk brukergrensesnitt program.
2. I ICS GUI klikker du på "kICS"-kategorien. Et skjermbilde av analysevinduet er vist i figur 1..
3. Finn mappen med mappenavnet "MATLAB koden" og bla til filen med filnavnet "Scripts" og åpne denne ved å dobbeltklikke på den. Du kan også høyreklikke på filen og velg "åpne med MATLAB" eller gå til fil, åpne i MATLAB og åpne skript fil. Denne filen kalles Editor.
4. I Editor bla til "Last kICS datasett", deretter kopiere eller skriv filnavn og mappeplassering i kommandolinjen som begynnermed img = f.eks "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". I kommandolinjen under mappeplasseringen angi antall bilder som skal analyseres - f.eks [1:500]. Bruk de samme innstillingene for alle påfølgende filmer i dataseriene. Hvis det er fokus drift i senere rammer, bør disse være ekskludert fra analysen.
5. I redigereren klikker du på "lagre" og deretter "evaluere celle". Datasettet er nå lastet inn i analysen programvare.
6. I kICS Analyse vinduet i GUI, angi innstillingene for analyse:
   1. Unclick "T cell" bokser.
   2. Oppgi antall etterslep som skal analyseres. Antallet tidsetterslep (τ) vil ha effekt på spredningen tomten og må velges slik at spredningen tomten er lineær. Begynn med å legge inn 25 og deretter reduseres til hvor diffusjon tomten er lineær. τ er antallet av tidsforsinkelser i kICS analyse sammenligner og en tidsforskyvning er tiden between en ramme og den neste. Den minste verdi som gir et lineært plott bør velges. Det maksimale antall av tidsforsinkelse er valgt slik at en lineær tilpasning er oppnådd, å velge en høyere verdi vil produsere data som ikke kan linje montert.
   3. Angi maksimal k ² verdi (se sirkel 1 i figur 1), er det vanligvis 20-50. En god k ² plottet er en grafisk fremstilling hvori det er mange datapunkter som er fordelt langs en ​​linje. Begynn med å legge inn 70 og deretter avta etter å ha vurdert de k ² og diffusjon tomter og velg den laveste verdien der datapunktene klynge rundt en rett linje. Den k ² Verdien er den kvadrerte omfanget av den romlige k-vektor i Fourier plass.
      I utgangspunktet bør analysen gjentas til de beste verdiene er bestemt, deretter bruke de samme innstillingene for alle påfølgende filmer i dataserier, men alltid sjekke at de valgte innstillingene gi en god tilpasning til dataene: god k ^to tomterog en lineær diffusjon tomten.
   4. Klikk på "Lagre innstillinger og gå videre".
   5. Klikk på "ja" for å vise alle grafer.
   6. Klikk på "Load bildeserie" (se sirkel 2 i figur 1), klikk deretter på "arbeidsområde".
   7. Velg "imgSerCrop", klikk deretter "Importer fra Workspace".
   8. Skriv inn bildesystem samling innstillinger. I "størrelse pixel" boksen angi projisert pikselstørrelse for imaging system hvor de bildestakker er ervervet. For AQP3-EGFP, 0.111 ble brukt. I boksen "Skriv inn tid (s) mellom rammer", 0,1150 ble brukt for AQP3-EGFP.
   9. Klikk "velg Rois", skriv "1", klikk ok og "bruke hele bildet".
   10. Klikk på "Do kICS analyse" og klikk ja til å gjøre "immobile filtrering". Resultater åpnes automatisk som bilder.
   11. Minimer innstillingsvinduet, minimere celleinfo utstillingsviw, og minimere photophysics vinduet. I den dynamikken vinduet, sjekk at den dynamikken plottet viser en lineær tilpasning av data til en linje med en negativ helling som betyr at datapunktene korrelerer og fri diffusjon kan antas. Noter diffusjonskoeffisienten for den spesifikke tidsetterslep og k ² innstillinger (det er ikke nødvendig å være oppmerksom på standardavviket på passform). Datapunktene i de k ^to tomter må være gruppert rundt linjen for den gitte tidsetterslep.
   12. Tick ​​boksen "Lagre åpne tall som bilder", klikk deretter "Lagre åpne tall som bilder" for å lagre resultatet filer. Lagre i en ny mappe under C: Users Documents AQP3diffusion. Klikk på "Slett gjeldende data" og fortsette med analyse av neste avling.

Tre. Gjennomsnitt av Beregnet diffusjonskoeffisienten er beregnet å få en oversikt over den analyserte data

1. Skriv inn de enkelte diffusjonskoeffisienter fra hver ROI i en rangeladsheet (sørg for å merke den τ og k ² verdier), bruke navnene på avlinger som satt over.
2. Beregn den gjennomsnittlige diffusjonskoeffisienten og standardavviket ved hjelp av et regnearkprogram.
3. Utfør en Kolmogorov-Smirnov test eller studenter t-test for å vurdere statistiske forskjeller ved hjelp av en 5% signifikansnivå. Kvantitative sammenligninger mellom celler (for eksempel behandlet vs nontreated) kan foretas.
4. Åpne regnearket versjonen av diffusjon tomter som ble generert av programvare for analyse for hver avling, og i gjennomsnitt er dataene for hver tilstand for hver tidsetterslep. Generere et nytt gjennomsnitt diffusjon tomten for å presentere i papirer eller presentasjoner.

Representative Results

Å skaffe egnede bildestakker å bli analysert med kICS, kan ulike mikroskop systemer brukes. Det er mulig å analysere bildesekvenser fra en epi-fluorescens mikroskop samt en TIRF eller en roterende disk oppsett. Membranen må være flat uten noen store bevegelige celleorganeller eller flytte blemmer / objekter. Dette notatet presenterer en tid lapse bildesekvens av AQP3 tagget med EGFP i levende MDCK celler fotografert på en roterende disk mikroskop med fokus satt til plasmamembranen med en bildefrekvens på 9,2 Hz. Fokus ble satt på basal (nederst) plasma membran. Dataene er nylig blitt publisert i AJP Cell ^13.

Figur 2A viser et bilde av cellen. Den scalebar er 10 mm og eksempel ROI avlinger er uthevet i rektangler. For valg av avlinger, er det viktig å beskjære ved periferien av cellen, hvor membranen er jevnt og flatt slik at bare en to-dimensjonal diffusjon er visualisert. Cell organeller, vesikler og membranfremspring bør unngås, og det er viktig at analysen at det ikke er noen drift i løpet av tidsforløp. Eksempler på vekster som ville bli utelukket fra analysen er presentert i figurene 2B og 2C. Bevegelige vesikler bidrar til korrelasjonen (figur 2B), og hull i membranen, som i dette tilfelle beveger seg litt (figur 2C) åpenbart ikke bør inkluderes i analysen. Det er også viktig at ROI avlingen er stor nok til å ha tilstrekkelig romlig sampling for analyse (for avbildning med høy NA objektiv minimum lineær størrelse på 32 piksler er en rimelig snor). For dette datasettet en 60X (NA 1,40) ble anvendt.

Figur 3A viser diffusjon plott av en avling generert med kICS. Denne metoden kan bli brukt for å finne den diffusjonskoeffisienten av et protein merket med EGFP (eller et annet fluorescerende protein), et fargestoffeller kvanteprikker. Helningen på kurven i diffusjon tomten er rett og slett et negativ av diffusjonskoeffisienten. I dette tilfellet er diffusjons koeffisienten for AQP3-GFP var 0,0104 ± 0,0040 mikrometer ² / s. Figur 3B er et beregnet diffusjon tomt med for mange tidsforsinkelser, i dette tilfelle analysen ble gjort om, men med færre tidsforsinkelser, slik at diffusjonen plottet er lineær.

Figur 4A presenterer en typisk k ² tomt. Dette er den radialt gjennomsnitt og ln transformert korrelasjon kurve for en valgt tidsetterslep. Fra disse plottene k ² skråningen er plottet versus tidsforsinkelser, og resultatet er diffusjonen plottet som vist i figur 3A. Ved inspeksjon av de k ^{2 flater,} er det viktig at det passer blir evaluert. Figur 4B er et eksempel på ak ² tomt for hvilke det kan konkluderes at avlingen er for liten og kunne ikke bli analysert som det skalhar en negativ helning og forråtnelse lineært til et støynivå. Figur 4C er et eksempel på ak ² plottet som må analyseres på nytt med en redusert maksimal k ² verdi som passer ikke lenger er god (som bedømt ved de økende residualer i større k ² verdier). I dette tilfelle må kjøres analysen på nytt går inn i en lavere maksimal k ² verdi, i dette tilfelle 25.

Figur 5 viser et gjennomsnitt diffusjon tomten i gjennomsnitt på 10 avlinger. Diffusjonen plottet ble funnet i Excel-fil fra analysen, og alle diffusjon plott kan nå bli tatt i gjennomsnitt for alle avlinger fra det samme eksperiment. I den resulterende diffusjon plottet forskjellige behandlinger av cellen kan kombineres i samme figur. Parallelle trendlinjer er like diffusjonskoeffisienter og ikke parallelle trendlinjer indikerer ulik diffusjon. I denne figuren er AQP3-EGFP diffusjonskoeffisienten beregnet (data fra AJP Cell ^13).

Figur 1. Skjermdump av kICS analyse vinduet. I dette vinduet kiCS analysen er gjort. Sirklene angir hvilke knapper du skal trykke for de enkelte trinnene i protokollen. Klikk her for å se større bilde.

Figur 2. Spinning disk image av en celle som uttrykker GFP. (A) Representant bilde av en MDCK celle stabilt uttrykker AQP3-GFP og representative avlinger vist. Bildet er ervervet på en roterende disk mikroskop med fokus nær basal plasma membran. (B) Repres entative avling som ble ekskludert fra analysen i kICS siden det er bevegelige vesikler, som kan bidra til diffusjonskoeffisienten. (C) Et eksempel på en avling i hvilken det er et hull i membranen, og dermed denne avlingen ble ekskludert fra analysen. Alle skala barer er 10 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.

Figur 3. Diffusion plott. (A) En representant diffusjon plott som alle peker er nær linjen passform. Dette er en god diffusjon tomt fordi dataene er lineære. (B) Et eksempel på en spredningsplott for hvilke analysen må utføres på nytt ved hjelp av et lavere antall timelags. 3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Figur 4 Eksempler på k. ^{2 flater.} (A) et eksempel på en god k ² plott som datapunktene er likt fordelt på hver side av linjen form. (B) Et eksempel på ak ² tomt for en avling som er mindre enn den optimale størrelse. I dette k ² tomt, er positiv skråningen av linjen passform, bør det være negativt, og derfor avlingen er ekskludert fra analysen. (C) Denne k ^to plott viser at analysen må utføres på nytt med en lavere maksimal k ² verdi for å velge den del av ^k-2 tomt var dataene er likt fordelt på hver side av linjen form.oad/51074/51074fig4highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Figur 5. Gjennomsnittet av diffusjon tomten. Et gjennomsnitt diffusjon tomten som ble i gjennomsnitt på 10 avlinger.

Discussion

Denne artikkelen presentert en detaljert steg-for-steg oversikt over hvordan du skal bruke den kICS analysemetode for å bestemme diffusjonskoeffisienter fra mikroskopi bilder proteiner merket med fluorescerende proteiner. Analysen er uavhengig av sonden valg med et meget bredt dynamisk område i etikette densitet og kan således også anvendes på proteiner merket med kvanteprikker samt fargestoffer og fluorescerende proteiner som EGFP.

For å beregne gyldige diffusjonskoeffisienter for proteiner, er det flere kritiske trinn, som har blitt optimalisert. Det er viktig å avbilde merkede proteiner på membranen kun. Hvis det er flere gjenstander som beveger seg vesikler eller celleorganeller i bildesekvensen som skal analyseres, vil disse bidrar til den beregnede diffusjonskoeffisienten noe som resulterer i under eller overvurderinger av diffusjonskoeffisienten.

Følge fremgangsmåten ovenfor, GUI-kode for kICS er brukervennlig ennd analyse er rask. Den omfatter flere snitt trinn: inkludert både den sirkulære i snitt, og beregningen av helningen av bakkene diffusjon plottet som funksjon av tidsforskyvning, noe som letter rask generering av et gjennomsnitt, og statistisk signifikant verdi for diffusjonskoeffisienten. Dermed forhold til den omfattende analysen som trengs for å beregne diffusjonskoeffisienter fra SPT eksperimenter, kICS er brukervennlig, rask og kan utføres uten spesialisert opplæring i biofysikk.

Dersom analysen resulterer i en negativ diffusjon koeffisient eller en horisontal diffusjon tomt, omfatter feilsøking visuell inspeksjon av avlingen for å se om det oppfyller alle krav som er beskrevet her. Avlinger som er for små kan gi unphysical negative diffusjonskoeffisienter og må kastes. For å beregne en diffusjons-koeffisient, er det ofte mulig å foreta en ny avling andre steder i datasettet som er egnet for analyse eller rett og slett øke avlingenstørrelse hvis mulig.

Denne teknikken kan brukes til de fleste datasett, men tiden kan kICS analyse bare beregne en gjennomsnitts diffusjonskoeffisienten og kan ikke skille mellom forskjellige proteinmigreringsmønstre eller generere baner. Ved hjelp kICS kan diffusjonskoeffisienter lett trekkes ut og diffusjon av et protein som kan bli sammenlignet for eksempel mellom behandlede og ikke-behandlede celler, eller mellom en villtype og mutant protein, noe som vil avsløre om behandling av mutasjoner indusere forskjeller i diffusjon og følgelig potensielt i protein-protein og / eller protein-lipid interaksjonene. Plasma membran spredning av AQP2 målt ved FRAP ble vist å redusere ved tilsetning av forskolin, en cAMP agonist ^10, og dessuten på akuttmottaket, en mutert versjon av AQP2 forårsaker nefrogen diabetes insipidus, diffust annerledes enn villtype AQP2 ^ni.

Selv om det er mulig å beregne diffusjonskoeffisienter fra enkelt partikkel data bruker gjennomsnittlig squared fortrengning, trinnstørrelse analyse eller partikkel image korrelasjon spektroskopi ^2,11,12, kan disse analysemetodene beregningsmessig krevende og ofte krever tilpassede skrevet datamaskinalgoritmer. Fordelen med kICS protokoll er presentert her, er at den er relativt uavhengig av merking tetthet og beregningsmessig enkel. Denne spasertur gjennom av kICS analysen vil dermed være nyttig for mange cellebiologer, som lett kan bruke det til sitt membran protein av interesse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+