Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy

Summary

Este documento proporciona una guía paso a paso a la técnica de análisis de fluctuación de imagen k-espacio espectroscopia de correlación (CCI) para la medición de los coeficientes de difusión de la etiqueta fluorescente proteínas de la membrana plasmática en células de mamíferos vivos.

Abstract

Difusión lateral y la compartimentación de proteínas de la membrana de plasma están fuertemente regulados en las células y, por tanto, el estudio de estos procesos se revelan nuevas perspectivas al plasma la función de proteínas de membrana y la regulación. Recientemente, k-espacio de correlación de imágenes de espectroscopia (CCI) ¹ fue desarrollado para permitir mediciones de rutina de los coeficientes de difusión directa a partir de imágenes de proteínas de la membrana plasmática marcados con fluorescencia, que evitaron sesgos sistemáticos introducidos por fotofísica sonda. Aunque la base teórica para el análisis es complejo, el método puede ser implementado por los no expertos utilizando un código libremente disponibles para medir los coeficientes de difusión de las proteínas. CCI calcula una función de correlación de tiempo a partir de una imagen Pila microscopía de fluorescencia después de la transformación de Fourier de cada imagen para recíproca (k-) el espacio. Posteriormente, promediado circular, logaritmo natural transformada lineal y se ajusta a la función de correlación se obtiene el coeficiente de difusión. Estedocumento proporciona una guía paso a paso para el análisis de imágenes y la medición de los coeficientes de difusión a través de las CCI.

En primer lugar, una secuencia de imágenes de alta velocidad de fotogramas de una proteína de membrana plasmática marcada con fluorescencia se adquiere mediante un microscopio de fluorescencia. Entonces, se selecciona una región de interés (ROI) evitando orgánulos intracelulares, vesículas en movimiento o que sobresale regiones de membrana. La pila de retorno de la inversión se importa en un código de libre acceso y varios parámetros definidos (véase la sección Método) se establecen para el análisis de las CCI. Entonces, el programa genera una "pendiente de las laderas" complot de las funciones de correlación de tiempo k-espacio, y el coeficiente de difusión se calcula a partir de la pendiente de la parcela. A continuación se muestra un procedimiento paso a paso las CCI para medir el coeficiente de difusión de una proteína de membrana utilizando el renal canal de agua acuaporina-3 etiquetados con EGFP como un ejemplo canónico.

Introduction

La organización espacio-temporal de cuatro dimensiones y la movilidad lateral de proteínas de membrana de plasma están fuertemente regulados y pueden desempeñar un papel en la función de la proteína, la actividad y de las interacciones proteína-proteína. Difusión lateral de las proteínas de la membrana plasmática, que tradicionalmente se ha estudiado mediante el cálculo de los coeficientes de difusión de las partículas individuales de time-lapse de punto cuántico o teñir las proteínas de membrana plasmática etiquetados ^2-4. Este enfoque requiere la inserción de una etiqueta extracelular en la proteína de la membrana de plasma de punto cuántico o tinte de etiquetado, lo que puede comprometer plegado y función de las proteínas y, por tanto, no pueden ser alcanzados para algunas proteínas. El volumen estérico de un punto cuántico se ha demostrado que reducir la velocidad de difusión de la proteína ⁵ y por otra parte, sólo una pequeña fracción de las proteínas de la población está marcada con puntos cuánticos, y no se sabe si esta fracción es representativa para el total grupo de proteínas de la membrana de plasma. Tra de partículas individualescking (SPT) mediciones de los coeficientes de difusión de imagen de serie de proteínas marcadas puntos cuánticos implica el mapeo de las posiciones de los picos fotografiados de las partículas con dos gaussiana bidimensional encaja seguido de algoritmos de análisis extensos. El análisis es computacionalmente muy intensivo, que requiere extensa de curva no lineal apropiado en cada cuadro de imagen de una secuencia de lapso de tiempo a las aproximaciones de la función de dispersión de punto microscopio (típicamente de dos dimensiones gaussianas espacial) y la posterior unión de las posiciones de partículas en trayectorias de las partículas que describe el movimiento de las moléculas individuales ^6,7.

Una técnica de correlación de imágenes recientemente desarrollada, k-espacio Correlación Imagen Espectroscopía (CCI) permite mediciones sencillas relativas de los coeficientes de difusión de los etiquetados con fluorescencia proteínas de la membrana de plasma. La posibilidad de calcular de forma rutinaria coeficientes de difusión de las proteínas de membrana marcadas con proteínas fluorescentes por las CCI es una herramienta única que mantienevarias ventajas sobre cuántica tradicional salpican análisis SPT: No se requiere la inserción de etiquetas y tiempo extracelulares que consumen etiquetado extracelular (líneas celulares que expresan proteínas fluorescentes se pueden utilizar); los coeficientes de difusión se extraen de la piscina total de proteínas fluorescentes en comparación con un subconjunto marcado con puntos cuánticos; análisis es simple sin la necesidad de realizar un seguimiento de las proteínas individuales y el análisis se puede realizar utilizando un código existente con ningún requisito para la programación de usuario adicional. El método es rápido, ya que es una técnica de promedio que permite el cálculo rápido y cálculo de los coeficientes de difusión. Estas mediciones de difusión rápida para la población de proteínas se complementan la información de transporte molecular más detallada obtenida de un subconjunto de la población por los métodos SPT esmerados.

tiempo CCI correlaciona secuencias de imágenes de microscopía de fluorescencia que primero han sido transformadas para el espacio de Fourier, y por lo tanto separa flfluctuaciones uorescencia debido a fotofísica de las debidas al transporte molecular ^1. Como resultado, las CCI pueden determinar la densidad del número, la velocidad de flujo, y la difusión de moléculas, mientras que la etiqueta fluorescente ser imparcial por fotoblanqueo complejo o parpadeo de los fluoróforos. Esto hace que las CCI una herramienta útil para determinar rápidamente la dinámica de difusión de proteínas de membrana de células con fluorescencia marcado con y sin la necesidad de algoritmos de escritura personalizados. Además de las proteínas marcadas fluorescentemente, CCI también se pueden aplicar a proteínas de membrana de punto marcado cuánticos ^8.

Este documento ofrece una introducción paso a paso de cómo utilizar las CCI para extraer los coeficientes de difusión de las proteínas de la membrana plasmática de etiquetado EGFP mediante la demostración de cómo colocar la cosecha, cómo utilizar el código y cómo evaluar las parcelas generadas, de las cuales la difusión coeficientes se extraen. A modo de ejemplo, los datos obtenidos por hilado conjunto de discos-microscopía en semi-reflexión interna total fluorescenciaModo nce (TIRF), de un canal de agua renal de proteínas acuaporina-3 (AQP3) etiquetados con EGFP se presenta.

Protocol

Adquisición de proteínas EGFP-etiquetados en la membrana de plasma para el análisis de CCI se puede hacer en un microscopio de epifluorescencia, una configuración de TIRF o en un microscopio de disco giratorio fijado para adquirir imágenes de la membrana de interés. El tamaño de los píxeles de la cámara, así como el tiempo entre cuadros de imagen es necesaria para el análisis. Las secuencias de imágenes de 100-1,200 fotogramas a una velocidad de 4-30 Hz se pueden utilizar para el análisis. Durante la adquisición, es importante para mantener la membrana en el foco a lo largo de la duración de la formación de imágenes y centrarse en una fracción de la membrana plana en la que la fluorescencia se distribuye de manera uniforme. Mover vesículas, que sobresale regiones de membrana y orgánulos celulares se pueden recortar más tarde en el proceso de análisis. El tiempo de adquisición debe ser elegido de modo que no hay deriva o el movimiento de la célula.

Para obtener las secuencias de comandos de código de las CCI para MATLAB, póngase en contacto con Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). La primera vez que el código de las CCI se utiliza, MAT abiertaLAB y haga clic en archivo, la ruta a continuación, establecer, a continuación, haga clic en añadir a las subcarpetas y busque la carpeta en la computadora en la que se encuentra el código CCI. Haga clic en Aceptar, guardar y cerrar. Ahora hay que continuar con el análisis de los cultivos que se describen en los siguientes puntos.

1. Importe la secuencia de imágenes de interés en un programa de análisis de imagen como TIFF Stack

Guarde el archivo con el nombre: stack1.tif.

1. Seleccione una región rectangular de interés (ROI) en la parte plana de la membrana de exclusión de orgánulos celulares móviles y sobresaliendo regiones de membrana. El tamaño de la cosecha se seleccionará de forma que suficientes estadísticas se generan para el bien k ² parcelas.
2. Recortar la región y salvar el cultivo como un archivo TIFF en una carpeta adecuada. Si hay varios cultivos de la misma película, use un incremento de número, por ejemplo, "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
3. Coloque la carpeta que contiene los cultivos a nivel localen el equipo, no en el servidor, mientras que hace un análisis de las CCI.

2. Importe los Cultivos en el software de análisis de uno en uno para realizar el análisis de

1. Abrir MATLAB y tipo "icsgui" en la ventana de comandos y presione ENTRAR. ICS GUI es el nombre del ejecutable para el programa de interfaz gráfica de usuario de la espectroscopia de correlación de imágenes.
2. En la interfaz gráfica de usuario de ICS, haga clic en la pestaña "CCI". Una captura de pantalla de la ventana de análisis se muestra en la Figura 1.
3. Encuentre la carpeta con el nombre de la carpeta "código MATLAB" y desplácese hasta el archivo con el nombre de archivo "Scripts" y abra esta haciendo doble clic en él. Alternativamente, haga clic derecho en el archivo y seleccione "abrir con MATLAB" o ir a un archivo, se abre en MATLAB y abra el archivo scripts. Este archivo se llama Editor.
4. En el libro del editor de «CCI Cargar conjuntos de datos" y, a continuación, copie o nombre de archivo tipo y ubicación de la carpeta en la línea de comandos que comienzacon img = por ejemplo, "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". En la línea de comandos debajo de la ubicación de la carpeta ajustar el número de fotogramas que se van a analizar - por ejemplo, [1:500]. Utilice los mismos ajustes para todas las películas consecutivas en la serie de datos. Si hay desviación foco en cuadros posteriores, éstos deben ser excluidos del análisis.
5. En el editor, haga clic en "Guardar" y luego haga clic en "evaluar la celda". El conjunto de datos ya está cargado en en el software de análisis.
6. En la ventana de Análisis de las CCI en los GUI, introduzca los valores para el análisis:
   1. Desmarca casillas "células T".
   2. Introduzca el número de retardos a analizar. El número de retardos de tiempo (τ) tendrá efecto en la trama de difusión y debe ser elegido de modo que la trama de difusión es lineal. Comience con la participación en el 25 y después disminuir hasta donde la trama de difusión es lineal. τ es el número de desfases el análisis compara las CCI y un lapso de tiempo es el tiempo de bntre una trama y la siguiente. El valor más pequeño que da una representación lineal debe ser seleccionado. El número máximo de retrasos de tiempo se elige de manera que se obtiene un ajuste lineal, la elección de un valor más alto producirá datos que no pueden ser línea ajustada.
   3. Introduzca el valor máximo k ² (ver Círculo 1 de la figura 1), por lo general es de 20-50. Un buen k ² parcela es un trazado en el que hay muchos puntos de datos que se distribuyen a lo largo de una línea. Comience con la participación en el 70 y luego disminuir después de haber evaluado los k ² y difusión parcelas y seleccione el valor más bajo en el que el grupo de puntos de datos en torno a una línea recta. El valor de k ² es la magnitud al cuadrado de la k-vector espacial en el espacio de Fourier.
      Inicialmente, el análisis debe repetirse hasta que se determinen los mejores valores, a continuación, utilizar la misma configuración para todas las películas consecutivas en la serie de datos, pero siempre asegúrese de que los ajustes seleccionados dan un buen ajuste a los datos: bien k ² parcelasy una trama de difusión lineal.
   4. Haga clic en "Configuración de las tiendas y proceder".
   5. Haz clic en "Sí" para mostrar todos los gráficos.
   6. Haga clic en "imagen de la serie de carga" (véase el círculo 2 de la Figura 1), a continuación, haga clic en "espacio de trabajo".
   7. Seleccione "imgSerCrop", a continuación, haga clic en "Importar de espacio de trabajo".
   8. Introduzca los valores de recogida de sistema de imágenes. En el "tamaño del píxel" cuadro de introducir el tamaño del pixel proyectado para el sistema de imágenes en la que las pilas de imágenes son adquiridas. Para AQP3-EGFP, se utilizó 0.111. En el cuadro "Especifique el tiempo (s) entre bastidores", 0.1150 se utilizó para AQP3-EGFP.
   9. Haga clic en "seleccionar ROI", introduzca "1", haga clic en Aceptar y "utilizar toda la imagen".
   10. Haga clic en "análisis Do CCI" y haga clic en Sí para hacer "filtrado inmóvil". Resultados se abrirán automáticamente como imágenes.
   11. Minimizar la ventana de ajustes, minimizar la información de célula window, y minimizar la ventana fotofísica. En la ventana de la dinámica, compruebe que la trama dinámica muestra un ajuste lineal de los datos a una línea con una pendiente negativa lo que significa que los puntos de datos se correlacionan y difusión libre se puede suponer. Registre el coeficiente de difusión para el lapso de tiempo específico y k ² ajustes (no es necesario tener en cuenta la desviación estándar del ajuste). Los puntos de datos en los k ² parcelas deben ser agrupados en torno a la línea para el momento dado se queda.
   12. Marque la casilla "Guardar figuras abiertas como imágenes", a continuación, haga clic en "Guardar figuras abiertas como imágenes" para guardar los archivos de resultado. Guarda en una nueva carpeta en C: Users Documentos AQP3diffusion. Haga clic en "claro de datos actual" y continuar con el análisis de la próxima cosecha.

3. Promedio del Coeficiente de Difusión Calculado está calculado para obtener una visión general de los datos analizados

1. Introduzca los coeficientes de difusión individuales de cada ROI en un spreadsheet (asegúrese de tomar nota de la τ y k ² valores), utilice los nombres de los cultivos establecidos anteriormente.
2. Calcule el promedio de coeficiente de difusión y la desviación estándar utilizando un programa de hoja de cálculo.
3. Realice una prueba de Kolmogorov-Smirnov o estudiantes t-test para evaluar diferencias estadísticas con un nivel de significación del 5%. Comparaciones Quantitave entre las células (por ejemplo, tratados vs no tratado) se pueden hacer.
4. Abra la versión de hoja de cálculo de las parcelas de difusión que se generan por el software de análisis para cada cultivo, y un promedio de los datos de cada estado para cada intervalo de tiempo. Generar una nueva trama de difusión promedio de presentación de documentos o las presentaciones.

Representative Results

Para adquirir pilas de imágenes adecuadas para ser analizadas con las CCI, se pueden utilizar diferentes sistemas de microscopio. Es posible analizar secuencias de imágenes de un microscopio de epi-fluorescencia, así como una configuración de disco TIRF o girando. La membrana debe ser plana sin grandes orgánulos celulares móviles o en movimiento vesículas / objetos. En este trabajo se presenta una secuencia de imágenes de lapso de tiempo de AQP3 etiquetados con EGFP en células MDCK en vivo fotografiados en un microscopio de disco giratorio con enfoque ajustado a la membrana plasmática a una velocidad de 9,2 Hz. La atención se fijó en la membrana plasmática basal (parte inferior). Los datos han sido publicados recientemente en AJP celda ^13.

La Figura 2A muestra una imagen de la célula. La barra de escala es de 10 mm y los cultivos ejemplo de ROI se destacan en rectángulos. Para la selección de los cultivos es importante para recortar en la periferia de la célula donde la membrana es uniforme y plana por lo que sólo una difusión de dos dimensiones se visualiza. Cell orgánulos, vesículas y proyecciones de membrana deben evitarse y es importante para el análisis que no hay deriva durante el lapso de tiempo. Los ejemplos de cultivos que serían excluidos del análisis se presentan en las Figuras 2B y 2C. Vesículas en movimiento contribuyen a la correlación (Figura 2B) y agujeros en la membrana que en este caso se mueven ligeramente (Figura 2C) obviamente no debe ser incluido en el análisis. También es importante que el cultivo de retorno de la inversión es lo suficientemente grande como para tener suficiente muestreo espacial para el análisis (para formación de imágenes con una lente de objetivo de alta NA un tamaño lineal mínimo de 32 píxeles es una guía razonable). Para este conjunto de datos se utilizó un 60X (NA 1,40).

Figura 3A muestra la trama de difusión de una cosecha generada con las CCI. Este método se puede utilizar para encontrar el coeficiente de difusión de una proteína marcada con EGFP (proteína fluorescente u otra), un coloranteo puntos cuánticos. La pendiente de la curva en la trama de difusión es simplemente el negativo del coeficiente de difusión. En este caso, el coeficiente de difusión de AQP3-GFP fue 0.0104 ± 0.0040 m ² / s. Figura 3B es un gráfico de difusión calculado con demasiados desfases, en este caso se ha hecho de nuevo el análisis, pero con menos tiempo queda para que la trama de difusión es lineal.

Figura 4A presenta una típica trama k ^2. Esta es la curva de correlación radial promedio y ln transformado por un lapso de tiempo seleccionado. A partir de estos k ² parcelas de la pendiente se representa gráficamente frente al tiempo se retrasa y el resultado es la trama de difusión como se muestra en la Figura 3A. Cuando la inspección de los k ² parcelas, es importante que se evalúa el ajuste. Figura 4B es un ejemplo de AK ² parcela para la que se puede concluir que el cultivo es demasiado pequeña y no se pudo analizar como deberíatiene una pendiente negativa y la decadencia linealmente a un piso de ruido. Figura 4C es un ejemplo de AK ² parcela que hay que volver a analizar con un valor reducido k máximo ² como el ajuste ya no es bueno (como se juzga por los residuos aumentan a mayor K ² valores). En este caso, el análisis se debe ejecutar de nuevo introduciendo un valor máximo más bajo k ^2, en este caso 25.

La figura 5 muestra un gráfico de difusión promedio de media sobre 10 cultivos. La trama de difusión se encuentra en el archivo de Excel a partir del análisis, y todas las parcelas de difusión puede ser ahora un promedio para todos los cultivos desde el mismo experimento. En la trama difusión resultante diferentes tratamientos de la célula se pueden combinar en la misma figura. Líneas de tendencia paralelas son iguales coeficientes de difusión y líneas de tendencia no paralelas indican difusión desigual. En esta figura, el coeficiente de difusión AQP3-EGFP se calcula (datos de AJP de la célula ^13).

Figura 1. Captura de pantalla de la ventana de análisis CCI. En esta ventana se realiza el análisis de las CCI. Los círculos indican los botones que hay que pulsar para los pasos individuales en el protocolo. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. Imagen de disco de una célula que expresa GFP Spinning. (A) Imagen representativa de una célula MDCK que expresan establemente AQP3-GFP y cultivos representativos mostrados. La imagen se adquiere en un microscopio de disco giratorio con el foco cerca de la membrana plasmática basal. (B) Repres sentante de cultivos, que fue excluido del análisis en las CCI, ya que hay vesículas en movimiento, que pueden contribuir al coeficiente de difusión. (C) Un ejemplo de un cultivo en el que hay un agujero en la membrana, por lo tanto, este cultivo se excluyó del análisis. Todas las barras de escala son de 10 micras. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Parcelas difusión. (A) Una parcela difusión representativo en el que todos los puntos están cerca de la línea de ajuste. Esta es una buena trama de difusión porque los datos son lineales. (B) Un ejemplo de una trama de difusión para que el análisis debe ser hecho de nuevo el uso de un menor número de timelags. 3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. Ejemplos de k ² parcelas. (A) Un ejemplo de un buen k ² parcela en la que los puntos de datos se distribuyen por igual a ambos lados de la línea de ajuste. (B) Un ejemplo de ak ² parcela para una cosecha más pequeña que el tamaño óptimo. En esta parcela K ^2, la pendiente de la línea de ajuste es positivo, debe ser negativo y por lo tanto, el cultivo se excluyó del análisis. (C) Este k ² figura muestra que el análisis debe ser hecho de nuevo con un valor máximo menor k ² con el fin de seleccionar la parte de la trama k ² fueron los datos se distribuyen por igual a ambos lados de la línea de ajuste.oad/51074/51074fig4highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 5. Promedió difusión trama. Un promedio de trama de difusión que fue un promedio de más de 10 cultivos.

Discussion

En este trabajo se presenta una descripción detallada paso a paso de cómo aplicar el método de análisis de las CCI para determinar los coeficientes de difusión de imágenes de microscopía de proteínas marcadas con proteínas fluorescentes. El análisis es independiente de la elección de la sonda con un muy amplio rango dinámico en la densidad de etiquetado y puede por lo tanto también se puede aplicar a proteínas marcadas con puntos cuánticos, así como colorantes y proteínas fluorescentes tales como EGFP.

Para calcular los coeficientes de difusión válidas para las proteínas, hay varios pasos críticos, que han sido optimizados. Es esencial imagen proteínas marcadas en sólo la membrana. Si hay objetos adicionales como vesículas o orgánulos celulares se mueve en la secuencia de imágenes para ser analizados, éstos contribuyen al coeficiente de difusión calculado que se traduce en menores-o sobreestimaciones del coeficiente de difusión.

Siguiendo los pasos anteriores, el código de interfaz gráfica de usuario de las CCI es usuario un amistosond análisis es rápido. Incluye varios pasos promedio: incluyendo tanto el promediado circular y el cálculo de la pendiente de la difusión pistas de trama como función del tiempo se retrasa, lo que facilita la generación rápida de un valor medio y estadísticamente significativa para el coeficiente de difusión. Por lo tanto, en comparación con el extenso análisis necesarios para calcular los coeficientes de difusión a partir de experimentos de tubos sin soldadura, las CCI es fácil de usar, rápido y se puede realizar sin una formación especializada en biofísica.

Si el análisis da como resultado un coeficiente de difusión negativo o una trama de difusión horizontal, resolución de problemas incluye la inspección visual del cultivo para ver si cumple con todos los requisitos aquí descritos. Los cultivos que son demasiado pequeños pueden producir coeficientes de difusión no físicos negativos y deben ser descartados. Con el fin de calcular un coeficiente de difusión, a menudo es posible hacer un nuevo cultivo en otro lugar en el conjunto de datos que es adecuado para el análisis o simplemente aumentar la cosechatamaño si es posible.

Esta técnica se puede aplicar a la mayoría de los conjuntos de datos pero en la actualidad, el análisis CCI sólo puede calcular un coeficiente medio de difusión y no puede distinguir diferentes patrones de migración proteína o generar trayectorias. Uso de CCI, los coeficientes de difusión se puede extraer fácilmente y la difusión de una proteína pueden ser comparados por ejemplo, entre las células tratadas y no tratadas o entre una de tipo salvaje y una proteína mutante, que revelará si el tratamiento de las mutaciones inducir diferencias en la difusión y por lo tanto potencialmente en proteína-proteína y / o las interacciones proteína-lípido. Plasma membrana de difusión de AQP2 medido por FRAP demostró que disminuye después de la adición de forskolina, un agonista de cAMP ^10, y por otra parte, en la sala de emergencias, una versión mutada de AQP2 causando diabetes insípida nefrogénica, difusa diferente que de tipo salvaje AQP2 ^9.

Aunque es posible calcular los coeficientes de difusión de partícula data mediante el desplazamiento cuadrático medio, el análisis de tamaño de paso o partícula imagen correlación espectroscopia ^2,11,12, estos métodos de análisis pueden ser computacionalmente exigentes y requieren a menudo de encargo escritas algoritmos informáticos. La ventaja de la CCI protocolo presentado aquí es que es relativamente independiente de la densidad de etiquetado y computacionalmente fácil. Este paseo a través del análisis de las CCI será, pues, útil para muchos biólogos celulares, que fácilmente puede aplicarla a sus proteínas de membrana de interés.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+