Lätt Mätning av diffusionskoefficienter av EGFP-taggade Plasma membranproteiner Använda k-Space Bild korrelationsspektroskopi

Summary

Detta dokument ger en steg för steg guide till fluktuationer analysteknik k-Space Bildcorrelation Spectroscopy (KI-grupper) för att mäta diffusionskoefficienter av fluorescerande plasmamembranproteiner i levande däggdjursceller.

Abstract

Lateral diffusion och uppdelning av plasmamembranproteiner är hårt reglerad i celler och på så sätt kommer att studera dessa processer visar nya insikter till plasmamembranprotein funktion och reglering. Nyligen, k-Space Bild Korrelation spektroskopi (KI-grupper) ¹ utvecklades för att möjliggöra rutinmässiga mätningar av diffusionskoefficienter direkt från bilder av fluorescerande taggade plasmamembranproteiner, som undvek systematiska fel som införs genom sondfotofysik. Även om den teoretiska grunden för analysen är komplex, kan förfarandet genomföras genom nonexperts med hjälp av en fritt tillgänglig kod för att mäta diffusionskoefficienter i proteiner. KI-grupperna beräknar en tidskorrelationsfunktion från en fluorescensmikroskopi bildstapel efter Fourier transformation av varje bild till ömsesidig (k-) utrymme. Därefter cirkulär medelvärdes, naturliga logaritmen omvandla och linjär passar till korrelationsfunktionen ger diffusionskoefficienten. Dettapapper ger en steg-för-steg guide till bildanalys och mätning av diffusionskoefficienter via KI-grupperna.

För det första är en hög bildhastighet bildsekvens av en fluorescensmärkt plasmamembranprotein förvärvas med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Då är en region av intresse (ROI) undvikande intracellulära organeller, flytta blåsor eller utskjutande membranregioner som valts. ROI stack importeras till en fritt tillgänglig kod och flera definierade parametrar (se metod avsnittet) är inställda för KI-grupper analys. Programmet genererar sedan en "lutning på backen" plot från k-space tidskorrelationsfunktioner, och diffusionskoefficienten beräknas från lutningen på tomten. Nedan följer en steg-för-steg KICS förfarande för att mäta diffusionskoefficienten för ett membranprotein med användning av renalt vatten kanal aquaporin-3 etiketten EGFP som en kanonisk exempel.

Introduction

De fyra dimension Spatiotemporal organisation och rörlighet i sidled av plasmamembranproteiner är hårt reglerad och kan spela en roll i proteiners funktion, aktivitet och protein-proteininteraktioner. Lateral diffusion av plasmamembranproteiner, har traditionellt studerats genom att beräkna diffusionskoefficienter för enstaka partiklar från time-lapse avbildning av quantum dot eller färgämne märkta plasmamembranproteiner ^2-4. Detta tillvägagångssätt kräver införing av en extracellulär tagg i plasmamembranprotein för quantum dot eller färgämnesmärkning, som kan kompromissa proteinveckning och funktion, och således kan inte uppnås för vissa proteiner. Den steriska volymen för en quantum dot har visat sig bromsa diffusionen av proteinet ⁵ och dessutom är det bara en liten del av proteinerna i populationen märkt med kvantprickar, och det är inte känt om denna fraktion är representativ för den totala pool av plasmamembranproteiner. Enstaka partikel tracking (SPT) mätningar av diffusionskoefficienter från bildserien av quantum dot märkta proteiner innebär kartläggning de avbildade topppositioner partiklarna med tvådimensionell Gauss passar följt av omfattande analysalgoritmer. Analysen är beräkningsmässigt mycket intensiv, kräver omfattande icke-linjär kurvanpassning i varje bildruta av en time-lapse-sekvens till approximationer av mikroskopet punktspridningsfunktion (normalt tvådimensionell rumslig Gaussians) och efterföljande länkning av partikelpositioner i partikelbanor som beskriver rörelse av enstaka molekyler ^6,7.

En nyutvecklad bildkorrelationsteknik, k-Space Bildcorrelation Spectroscopy (KI-grupper) möjliggör relativt enkla mätningar av diffusionskoefficienter av fluorescerande taggade plasmamembranproteiner. Möjligheten att rutinmässigt beräkna diffusionskoefficienter av membranproteiner märkta med fluorescerande proteiner genom KI-grupperna är ett unikt verktyg som hållerflera fördelar jämfört med traditionella quantum dot SPT-analys: Det krävs ingen insättning av extracellulära taggar och tidskrävande extracellulär märkning (cellinjer som uttrycker fluorescerande proteiner kan användas); diffusionskoefficienter extraheras från den totala poolen av fluorescerande proteiner jämfört med en delmängd märkt med kvantprickar; Analysen är enkel utan behov av att spåra enstaka proteiner och analysen kan utföras med användning av en befintlig kod utan krav på ytterligare användarprogrammering. Metoden är snabb, eftersom det är en medelvärdesteknik som möjliggör snabb beräkning och beräkning av diffusionskoefficienter. Dessa snabba diffusion mätningar för protein befolkningen kompletterar den mer detaljerade molekylära transportinformation för en delmängd av populationen av de mödosamma SPT metoder.

KI-grupperna tid korrelerar fluorescens mikroskopi bildsekvenser som först har transformerats till Fourier-rymden, och därmed separerar fluorescence svängningar som beror på fotofysik från dem som på grund av molekylär transport ^1. Som ett resultat kan KIG bestämma antalet täthet, flödeshastighet, och diffusion av fluorescensmärkta molekyler samtidigt som den är ett idealiskt genom komplexa fotoblekning eller blinkar av fluoroforerna. Detta gör KIG ett användbart verktyg för att snabbt bestämma de diffusion dynamiken i fluorescensmärkta cellmembranproteiner utan att behöva anpassade skriv algoritmer. Förutom fluorescerande proteiner kan KIG även appliceras på quantum dot-märkta membranproteiner ^8.

Detta dokument ger en steg-för-steg införa hur man använder KI-grupperna för att extrahera diffusionskoefficienter av EGFP-märkta plasmamembranproteiner genom att visa hur man placerar grödan, hur man använder koden och hur man ska värdera de genererade tomter, där diffusion Koefficienterna extraheras. Som ett exempel kan data som erhållits genom spinning disk-mikroskopi uppsättning i semi-total inre reflektion fluorescerarnce (TIRF) läget av en njurvattenkanal protein aquaporin-3 (AQP3) taggade med EGFP presenteras.

Protocol

Förvärv av EGFP-märkta proteiner i plasmamembranet för KIG analys kan göras på ett epifluorescensmikroskop, en TIRF uppkoppling eller på en roterande skiva mikroskop inställt att förvärva bilder av membranet av intresse. Kameran pixelstorlek samt tiden mellan bildramar behövs för analysen. Bildsekvenser av 100-1,200 bildrutor på en bildhastighet av 4-30 Hz kan användas för analysen. Under förvärvs, är det viktigt att hålla membranet i fokus under hela varaktigheten av den avbildning och fokusera på en bråkdel av den plana membran i vilket fluorescensen är likformigt fördelad. Moving blåsor, utskjutande membranregioner och cellorganeller kan beskäras ut senare i analysprocessen. Förvärvstiden bör väljas så att det inte finns någon glidning eller rörelse av cellen.

För att få KI-grupperna kod skript för MATLAB, kontakta Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). Första gången KI-grupperna koden används, öppen MATLAB och klicka på filen, sedan ange sökvägen, klicka på lägg med undermappar och hitta den mapp på datorn där KI-grupperna koden ligger. Klicka sedan på OK, spara och stäng. Fortsätter nu med en analys av grödor som beskrivs i de följande punkterna.

1. Importera Bildsekvens av intresse i en Imaging Analysis Program som TIFF Stack

Spara filen med namnet: stack1.tif.

1. Välj ett rektangulärt område av intresse (ROI) hos den plana delen av membranet exklusive rörliga cellorganeller och utskjutande membranregioner. Grödan storlek är vald så att tillräckligt med statistik genereras för bra k ² tomter.
2. Beskär regionen och spara grödan som en TIFF-fil i en lämplig mapp. Om det finns flera grödor från samma film, använda ett antal steg, t.ex. "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
3. Placera den mapp som innehåller grödor lokaltpå datorn, inte på en server, medan du gör KI-grupper analys.

2. Importera Grödor i Analysis Software en efter en att utföra analysen

1. Öppna MATLAB och typ "icsgui" i kommandofönstret och tryck på ENTER. ICS GUI är det körbara namnet för bildkorrelationsspektroskopi grafiskt användargränssnitt program.
2. I ICS GUI klicka på fliken "grupper". En skärmbild av analysfönstret visas i figur 1.
3. Hitta mappen med mappnamnet "MATLAB-kod" och bläddra till filen med filnamnet "Skript" och öppna det genom att dubbelklicka på den. Alternativt kan du högerklicka på filen och välj "öppna med MATLAB" eller gå till filen, öppna i MATLAB och öppna skript-filen. Denna fil kallas Editor.
4. I editorn bläddra till "Ladda KI-grupperna dataset", kopiera eller skriv filnamn och mapp i kommandoraden som börjarmed img = t.ex. "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". På kommandoraden nedanför mappens plats ställa in antalet bildrutor som ska analyseras - t.ex. [1:500]. Använd samma inställningar för alla på varandra följande filmer i dataserien. Om det finns fokus drift i senare ramar, bör dessa undantas från analysen.
5. I redigeraren klickar du på "Spara" och sedan på "utvärdera cell". Den datamängd är nu laddas in i analysprogrammet.
6. I KI-grupperna Analysis fönstret i det grafiska gränssnittet, ange inställningarna för analys:
   1. Klicka ur "T-cell"-boxar.
   2. Ange antalet tidsfördröjningar som skall analyseras. Antalet tidsfördröjningar (τ) kommer att ha effekt på diffusion tomt och måste väljas så att diffusion tomten är linjär. Börja med att skriva in 25 och sedan minska till där diffusion tomten är linjär. τ är antalet tidsfördröjningar KI-grupperna analysen jämförs och en fördröjning är den tid between en ram och nästa. Det minsta värde som ger en linjär kurva bör väljas. Det maximala antalet tidsfördröjningar är vald så att en linjär anpassning erhålls, att välja ett högre värde kommer fram uppgifter som inte kan linjen monteras.
   3. Ange maximalt värde på ^k-2 (se cirkel 1 i figur 1), är det oftast 20-50. En bra k ² plot är en plot i vilken det finns många datapunkter som är fördelade längs en ​​linje. Börja med att skriva in 70 och sedan minska efter att ha utvärderat k ² och diffusion tomter och välj lägsta värdet där datapunkter klustret kring en rak linje. Värdet för k ² är den kvadrerade storleken av det rumsliga k-vektor i Fourierrymden.
      Inledningsvis bör analysen upprepas tills de bästa värdena bestäms, sedan använda samma inställningar för alla på varandra följande filmer i dataserien men alltid kontrollera att de valda inställningarna ger en bra passform till data: bra k ² tomteroch en linjär spridning tomt.
   4. Klicka på "spara inställningar och gå vidare".
   5. Klicka på "Ja" för att visa samtliga grafer.
   6. Klicka på "Load bildserie" (se cirkel 2 i figur 1), klicka sedan på "arbetsyta".
   7. Välj "imgSerCrop", klicka sedan på "Importera från Workspace".
   8. Ange inställningarna för bildsystem för insamling. I rutan "pixelstorleken" anger den beräknade pixelstorleken för avbildningssystemet med vilken bildstaplar förvärvas. För AQP3-EGFP, var 0,111 användas. I rutan "Ange tiden (s) mellan ramar", var 0,1150 använts för AQP3-EGFP.
   9. Klicka på "Välj ROI", skriv in "1", klicka på OK och "använda hela bilden".
   10. Klicka på "Do KICS analys" och klicka ja för att göra "orörliga filtrering". Resultaten kommer att öppnas automatiskt som bilder.
   11. Minimera inställningsfönstret, minimera cell info window, och minimera fotofysik fönstret. I dynamiken fönstret, kontrollera att dynamiken tomten visar en linjär anpassning av data till en linje med en negativ lutning vilket innebär att datapunkterna korrelerar och fri diffusion kan antas. Anteckna diffusionskoefficienten för den specifika tidsfördröjningen och k ^två inställningar (det är inte nödvändigt att notera den standardavvikelse för passning). Datapunkterna i K ² tomter måste samlade kring linjen för given tidsfördröjningar.
   12. Kryssrutan "Spara öppna siffror som bilder", klicka sedan på "Spara öppna siffror som bilder" för att spara resultatet filer. Spara i en ny mapp under C: Users Documents AQP3diffusion. Klicka på "klara nuvarande uppgifter" och fortsätta med analys av nästa gröda.

3. Genomsnittet av den beräknade diffusion koefficienten beräknas att få en översikt över de analyserade data

1. Skriv in de enskilda diffusionskoefficienter från varje ROI i en SPREadsheet (se till att notera τ och k ² värden), använda namnen på de grödor som anges ovan.
2. Beräkna medelvärdet diffusionskoefficienten och standardavvikelse med användning av ett kalkylprogram.
3. Utför en Kolmogorov-Smirnov test eller studenter t-test för att utvärdera statistiska skillnader med hjälp av en 5% signifikansnivå. Quantitave jämförelser mellan celler (t.ex. behandlad vs icke behandlad) kan göras.
4. Öppna kalkyl versionen av diffusion tomter som genereras av analysprogram för varje gröda, och genomsnittliga data för varje tillstånd för varje fördröjning. Skapa ett nytt genomsnitt diffusion tomt för att presentera i tidningar eller presentationer.

Representative Results

Att förvärva lämpliga bildstaplar som skall analyseras med KI-grupperna, kan olika mikroskopsystem användas. Det är möjligt att analysera bildsekvenser från en epi-fluorescensmikroskop samt en TIRF eller spinning disk setup. Membranet måste vara plan utan några stora rörliga cellorganeller eller flytta blåsor / objekt. Denna uppsats presenterar en tid förfaller bildsekvens av AQP3 taggade med EGFP i levande MDCK celler som avbildas på en snurrande skiva mikroskop med fokus inställt på plasmamembranet med en bildfrekvens på 9,2 Hz. Fokus sattes till den basala (nedre) plasmamembran. Datan har nyligen publicerats i AJP Cell ^13.

Figur 2A visar en bild av cellen. Den scalebar är 10 mm och exempelvis ROI grödor är markerade i rektanglar. För urval av grödor är det viktigt att beskära vid periferin av cellen där membranet är likformig och plan så att endast en tvådimensionell diffusion visualiseras. Cell organeller, blåsor och membran prognoser bör undvikas och det är viktigt för analysen att det inte finns någon drift under den tid som förflutit. Exempel på grödor som skulle uteslutas från analysen presenteras i figurerna 2B och 2C. Rörliga blåsor bidrar till korrelationen (Figur 2B) och hål i membranet som i detta fall rör sig något (figur 2C) uppenbarligen inte bör ingå i analysen. Det är också viktigt att ROI grödan är tillräckligt stor för att ha tillräckligt med rumslig provtagning för analys (för avbildning med en hög NA objektiv en minsta linjär storlek på 32 pixlar är en rimlig riktlinje). För detta dataset användes en 60X (NA 1,40).

Figur 3A visar spridningen tomt på en gröda som genereras med KI-grupperna. Denna metod kan användas för att hitta diffusionskoefficienten för ett protein med etiketten EGFP (eller en annan fluorescerande protein), ett färgämneeller kvantprickar. Lutningen på kurvan i diffusionen tomt är helt enkelt den negativa motsvarigheten till diffusionskoefficienten. I detta fall är diffusionskoefficienten för AQP3-GFP var 0,0104 ± 0,0040 ^ m ² / s. Fig. 3B är en beräknad diffusion tomt med alltför många tidsförskjutningar, i detta fall analysen var redone men med färre tidsfördröjningar, så att diffusion tomt är linjär.

Figur 4A visar en typisk ^k2 tomt. Detta är den radiellt genomsnitt och ln transformerad korrelationskurva för en vald tidsfördröjning. Från dessa k ² tomter lutningen avsattes mot tidsförskjutningar, och resultatet är diffusionen tomt, såsom visas i fig. 3A. Vid kontroll av k ² tomter, är det viktigt att passformen utvärderas. Figur 4B är ett exempel på ak ² tomt för vilka det kan man dra slutsatsen att grödan är för liten och kunde inte analyseras som det skahar en negativ lutning och förfall linjärt till en brusnivån. Figur 4C är ett exempel på ak ² tomt som måste analyseras om med ett värde reducerad maximal k ² som passformen är inte längre bra (att döma av de ökande restprodukter vid större k ^två värden). I detta fall måste analysen köras på nytt in ett maximalt värde lägre k ^2, i detta fall 25.

Figur 5 visar ett genomsnitt diffusion tomt i genomsnitt mer än 10 grödor. Spridningen tomt hittades i excel-filen från analysen, och alla diffusion tomter kan nu i genomsnitt för samtliga grödor från samma experiment. I den resulterande diffusion tomt olika behandlingar av cellen kan kombineras i samma figur. Parallella trend linjer är lika diffusionskoefficienter och icke parallella trendlinjer indikerar ojämn spridning. I denna figur är den AQP3-EGFP diffusionskoefficienten beräknades (data från AJP Cell ^13).

Figur 1. Skärmdump av fönstret KI-grupper analys. I detta fönster KI-grupperna analysen är klar. Cirklarna visar vilka knappar att trycka på för de enskilda stegen i protokollet. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Spinning skivavbild av en cell som uttrycker GFP. (A) representant bild av en MDCK cell som stabilt uttrycker AQP3-GFP och representativa grödor som visas. Bilden förvärvas på en snurrande skiva mikroskop med fokus nära den basala plasmamembranet. (B) represen dare gröda, som uteslöts från analysen i KI-grupperna eftersom det finns rörliga blåsor, som kan bidra till diffusionskoefficienten. (C) Ett exempel på en gröda på vilken det finns ett hål i membranet, således denna odling uteslöts från analysen. Alla skal barer är 10 mikrometer. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3. Diffusion tomter. (A) En representant diffusion tomt där alla punkt är nära linjen passform. Detta är en god diffusion tomt eftersom de data som är linjära. (B) Ett exempel på en diffusion tomt där analysen måste göras om med ett lägre antal timelags. 3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4. Exempel på k. ² tomter. (A) Ett exempel på en bra k ² diagram där datapunkterna är jämnt fördelade på vardera sidan av linjen passform. (B) Ett exempel på ak ² tomt för en gröda som är mindre än den optimala storleken. I detta k ² tomt, är positiv lutning av linjen passform bör det vara negativ och därför grödan utesluts från analysen. (C) Denna ^k2 tomten visar att analysen måste göras om med ett maximalt värde lägre k ² för att välja den del av ^k2 tomten var uppgifterna jämnt fördelade på vardera sidan av linjen passform.oad/51074/51074fig4highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5. Genomsnittlig diffusion tomt. Ett genomsnitt diffusion tomt som var i genomsnitt mer än 10 grödor.

Discussion

I dokumentet presenterades en detaljerad steg-för-steg överblick av hur man tillämpar KI-grupperna analysmetod för att bestämma diffusionskoefficienter från mikroskopi bilder av proteiner märkta med fluorescerande proteiner. Analysen är oberoende av sond val med ett mycket brett dynamiskt omfång i märkning densitet och kan därför också tillämpas på proteiner märkta med kvantprickar samt färgämnen och fluorescerande proteiner såsom EGFP.

För att beräkna giltiga diffusionskoefficienter för proteinerna, det finns flera viktiga steg, som har optimerats. Det är viktigt att bild märkta proteiner på endast membranet. Om det finns ytterligare föremål som rör sig blåsor eller cellorganeller i bildsekvensen som skall analyseras, kommer dessa att bidra till den beräknade diffusionskoefficienten vilket resulterar i under-eller överskattningar av diffusionskoefficienten.

Följa stegen ovan, är det grafiska gränssnittet koden för KI-grupperna användarvänlig and analys är snabb. Den innehåller flera genomsnitt steg: inklusive både den cirkulära medelvärdes och beräkningen av lutningen på backarna diffusion tomt som funktion av tidsfördröjningar, vilket underlättar snabb generering av ett genomsnittligt och statistiskt värde för diffusionskoefficienten. Sålunda jämfört med den omfattande analys som behövs för att beräkna diffusionskoefficienter från SPT experiment, KIG är användarvänlig, snabb och kan utföras utan specialiserad utbildning i biofysik.

Om analysen resulterar i en negativ diffusionskoefficienten eller en horisontell diffusion tomt, innehåller felsökning visuell inspektion av grödan för att se om det uppfyller alla krav som beskrivs här. Grödor som är för liten kan ge Unphysical negativa diffusionskoefficienter och måste kasseras. I syfte att beräkna en spridningskoefficient, är det ofta möjligt att göra en ny gröda på annan plats i datamängden som är lämplig för analys eller helt enkelt öka den grödastorlek om möjligt.

Denna teknik kan tillämpas på de flesta datamängder, men för närvarande kan KIG analys endast beräkna en genomsnittlig diffusionskoefficient och kan inte skilja mellan olika proteinmigrationsmönster eller generera banor. Använda KIG kan diffusionskoefficienter lätt extraheras och diffusion av ett protein kan jämföras exempelvis mellan behandlade och icke-behandlade celler eller mellan en av vildtyp och ett mutant protein, vilket kommer att visa om behandlingen av mutationer inducera skillnader i diffusion och därmed potentiellt i protein-protein och / eller protein-lipid-interaktioner. Plasma membran diffusion av AQP2 mätt med FRAP visades minska efter tillsats av forskolin, ett cAMP-agonist ¹⁰ och dessutom i ER, en muterad version av AQP2 orsakar nefrogen diabetes insipidus, spritt annorlunda än vildtyps AQP2 ^9.

Även om det är möjligt att beräkna diffusionskoefficienter från enda partikel data med hjälp av medelkvadrat förskjutning, steg storleksanalys eller partikelbildkorrelationsspektroskopi ^2,11,12, kan dessa analysmetoder vara beräkningsmässigt krävande och ofta kräver anpassade skriven datoralgoritmer. Fördelen med KI-grupperna protokollet presenteras här är att det är relativt oberoende av märkning densitet och beräkningsmässigt lätt. Denna genomgång av KI-grupperna analys kommer således vara användbart för många cellbiologer, som lätt kan använda den till sin membranprotein av intresse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+