Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

من السهل قياس إنتشار معاملات EGFP الموسومة البروتينات عن طريق غشاء البلازما ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي

doi: 10.3791/51074 Published: May 10, 2014

Summary

تقدم هذه الورقة خطوة خطوة الدليل لأسلوب تحليل تذبذب ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي (KICS) لقياس معاملات نشر fluorescently المسمى غشاء بروتينات البلازما في خلايا الثدييات الحية.

Abstract

وينظم انتشار الأفقي وتجزئة بروتينات غشاء البلازما بإحكام في الخلايا، وبالتالي، ودراسة هذه العمليات سوف تكشف عن رؤى جديدة لغشاء البلازما وظيفة البروتين والتنظيم. مؤخرا، ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي (KICS) وقد وضعت 1 لتمكين القياسات الروتينية للمعاملات نشرها مباشرة من صور الموسومة fluorescently البروتينات غشاء البلازما، التي تجنب التحيز المنهجي الذي عرضته photophysics التحقيق. على الرغم من أن الأساس النظري لتحليل معقد، وطريقة يمكن تنفيذها من قبل nonexperts باستخدام رمز متاحة بحرية لقياس معاملات نشر من البروتينات. KICS بحساب دالة الارتباط الوقت من صورة كومة مضان المجهري بعد فورييه تحويل كل صورة إلى المتبادلة (ك) الفضاء. في وقت لاحق، في المتوسط ​​دائرية، اللوغاريتم الطبيعي وتحويل الخطية يناسب إلى وظيفة ارتباط تعطي معامل الانتشار. هذاوتوفر ورقة دليل خطوة بخطوة لتحليل الصورة وقياس معاملات الانتشار عبر KICS.

أولا، يتم الحصول على ارتفاع معدل الإطار تسلسل الصور من البلازما بروتين الغشاء fluorescently المسمى باستخدام المجهر مضان. ثم، يتم تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) تجنب عضيات داخل الخلايا، والانتقال حويصلات أو جاحظ مناطق الغشاء. يتم استيراد المكدس العائد على الاستثمار في مدونة متاحة بحرية ويتم تعيين العديد من المعلمات تحديدا (انظر القسم الطريقة) لتحليل KICS. البرنامج ثم يقوم بإنشاء "المنحدر من المنحدرات" مؤامرة من وظائف الارتباط الوقت ك الفضاء، ويتم حساب معامل الانتشار من المنحدر من المؤامرة. وفيما يلي الإجراء خطوة بخطوة KICS لقياس معامل الانتشار من بروتين الغشاء باستخدام الكلوي قناة المياه aquaporin-3 المفتاحية EGFP كمثال الكنسي.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تنظم المنظمة الزمانية المكانية أربعة الأبعاد والتنقل الجانبي للبروتينات غشاء البلازما بإحكام ويمكن أن تلعب دورا في وظيفة البروتين والنشاط والتفاعل البروتين البروتين. الانتشار الأفقي للبروتينات غشاء البلازما، وقد جرت العادة على درس عن طريق حساب معاملات نشر للجسيمات واحدة من الوقت الفاصل بين التصوير من الكم نقطة أو صبغ المسمى غشاء بروتينات البلازما 2-4. هذا النهج يتطلب إدخال علامة خارج الخلية البروتين في غشاء البلازما لالكم نقطة أو وضع العلامات الصبغة، والتي يمكن أن تمس للطي البروتين وظيفة، وبالتالي، لا يمكن أن يتحقق لبعض البروتينات. وقد تبين حجم الفراغية من الكم نقطة لإبطاء انتشار البروتين 5 وعلاوة على ذلك، وصفت سوى نسبة ضئيلة من البروتينات في عدد السكان مع نقاط الكم، وليس من المعروف ما إذا كان هذا الكسر هو ممثل لمجموع مجموعة من البروتينات غشاء البلازما. هيئة تنظيم الاتصالات جسيم واحدcking يبدو (SPT) قياسات معاملات نشر سلسلة من الصور من الكم نقطة البروتينات المسمى ينطوي على تعيين المناصب ذروة تصوير الجزيئات مع اثنين من الأبعاد التمويه يناسب تليها خوارزميات التحليل واسعة النطاق. التحليل هو حسابيا مكثفة للغاية، وتتطلب منحنى غير الخطية واسعة النطاق المناسب في كل إطار صورة تسلسل الوقت الفاصل بين لتقريب وظيفة انتشار نقطة المجهر (عادة اثنين من الأبعاد المكانية Gaussians) وربط لاحقة من المناصب الجسيمات في مسارات الجسيمات التي تصف حركة الجزيئات واحدة 6،7.

صورة تقنية الترابط وضعت مؤخرا، ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي (KICS) تمكن قياسات بسيطة النسبية للمعاملات نشر الموسومة fluorescently البروتينات غشاء البلازما. إمكانية لحساب معاملات روتينية نشر بروتينات الغشاء المسمى مع البروتينات الفلورية التي كتبها KICS هو أداة فريدة من نوعها التي تتولىالعديد من المزايا التقليدية الكم دوت تحليل SPT: لا يلزم من الأكواد الإدراج خارج الخلية وقتا طويلا خارج الخلية وضع العلامات (خطوط الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية يمكن استخدامها)؛ يتم استخراج معاملات نشر من تجمع مجموعه من البروتينات الفلورية مقارنة فرعية المسمى مع نقاط الكم؛ تحليل بسيط دون الحاجة إلى تتبع البروتينات واحد ويمكن إجراء التحليل باستخدام التعليمات البرمجية الموجودة مع عدم وجود شرط للبرمجة مستخدم إضافي. هذه الطريقة السريعة لأنه هو أسلوب المتوسط ​​والتي تمكن بسرعة حساب وحساب معاملات نشر. هذه القياسات الانتشار السريع للسكان البروتين تكمل المعلومات أكثر تفصيلا النقل الجزيئية التي تم الحصول عليها عن مجموعة فرعية من السكان وفقا للأساليب SPT مضنية.

الوقت KICS يرتبط تسلسلات الصور مضان المجهر الأولى التي تحولت إلى فورييه الفضاء، وبالتالي يفصل فلوريداتقلبات uorescence بسبب photophysics من تلك التي تعزى إلى النقل الجزيئية 1. ونتيجة لذلك، يمكن KICS تحديد كثافة العدد، سرعة التدفق، ونشر fluorescently المسمى الجزيئات في حين يجري غير متحيز من قبل photobleaching من معقدة أو امض من fluorophores. وهذا يجعل KICS أداة مفيدة لتحديد بسرعة ديناميات نشر بروتينات غشاء الخلية fluorescently المسمى من دون الحاجة إلى كتابة الخوارزميات مخصص. إلى جانب البروتينات fluorescently المسمى، KICS يمكن أيضا أن تطبق على الكم دوت المسمى غشاء بروتينات 8.

تقدم هذه الورقة مقدمة خطوة بخطوة لكيفية استخدام KICS لاستخراج معاملات نشر EGFP الموسومة البروتينات غشاء البلازما من خلال إظهار كيفية وضع المحصول، وكيفية استخدام رمز وكيفية تقييم المؤامرات ولدت، الذي نشر يتم استخراج معاملات. على سبيل المثال، البيانات التي حصلت عليها الغزل مجموعة القرص المجهري في شبه الانعكاس الداخلي الكامل يتألقيتم تقديم الامتحانات التنافسية الوطنية (TIRF) واسطة، من البروتين الكلى قناة المياه aquaporin-3 (AQP3) الموسومة مع EGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويمكن أن يتم الحصول على البروتينات الموسومة EGFP في غشاء البلازما لتحليل KICS على مجهر epifluorescence، TIRF الإعداد أو على المجهر القرص الغزل المقرر أن الحصول على صور للغشاء من الفائدة. هناك حاجة إلى حجم بيكسل وكذلك الوقت بين إطارات الصور للتحليل. تسلسل صورة 100-1،200 إطارات بمعدل الإطار من 4-30 هرتز يمكن استخدامها للتحليل. خلال عملية الاستحواذ، فمن المهم للحفاظ على الغشاء في التركيز طوال فترة التصوير، والتركيز على جزء من الغشاء شقة في مضان التي يتم توزيعها بشكل موحد. تتحرك الحويصلات، جاحظ مناطق الغشاء وعضيات الخلية يمكن حصدها في وقت لاحق في عملية التحليل. وينبغي اختيار الوقت الاستحواذ حتى لا يكون هناك أي انحراف أو حركة الخلية.

للحصول على البرامج النصية رمز KICS لMATLAB، اتصل بول وايزمان (Paul.Wiseman @ McGill.ca). أول مرة يتم استخدام رمز KICS، MAT مفتوحةLAB وانقر فوق ملف، ثم تعيين المسار، ثم انقر فوق إضافة مع المجلدات الفرعية والعثور على مجلد على جهاز الكمبيوتر الذي توجد رمز KICS. ثم انقر فوق موافق، وحفظ وإغلاق. الآن تواصل مع تحليل المحاصيل وصفها في النقاط التالية.

1. استيراد صورة تسلسل الاهتمام إلى برنامج تحليل التصوير باعتباره TIFF المكدس

حفظ الملف مع اسم: stack1.tif.

  1. تحديد منطقة مستطيلة ذات الاهتمام (ROI) في الجزء المسطح من الغشاء باستثناء عضيات الخلية تتحرك وجاحظ مناطق الغشاء. يتم اختيار حجم المحاصيل بحيث يتم إنشاؤها بما فيه الكفاية لإحصاءات جيدة ك 2 المؤامرات.
  2. المحاصيل في المنطقة وحفظ المحاصيل كملف TIFF في المجلد المناسب. إذا كان هناك العديد من المحاصيل من نفس الفيلم، واستخدام الزيادة العدد، على سبيل المثال "stack1crop.tif"، "stack1crop2.tif"، "stack1crop3.tif".
  3. وضع المجلد الذي يحتوي على المحاصيل محلياعلى جهاز الكمبيوتر، وليس على الخادم، في حين تقوم التحليل KICS.

2. استيراد المحاصيل في برمجيات تحليل واحدا تلو الآخر لإجراء تحليل

  1. MATLAB مفتوحة ونوع "icsgui" في إطار الأوامر ثم اضغط ENTER. ICS GUI هو اسم التنفيذي للبرنامج واجهة المستخدم الرسومية صورة ارتباط التحليل الطيفي.
  2. في واجهة المستخدم الرسومية ICS انقر على "KICS" علامة التبويب. وأظهرت لقطة شاشة من إطار التحليل في الشكل 1.
  3. العثور على مجلد مع اسم المجلد "رمز MATLAB" وانتقل إلى الملف مع اسم الملف "مخطوطات" وفتح بذلك عن طريق النقر المزدوج عليها. بدلا من ذلك، انقر بزر الماوس الأيمن على الملف واختيار "فتح مع MATLAB" أو انتقل إلى ملف مفتوح في MATLAB وفتح ملف البرامج النصية. ويسمى هذا الملف محرر.
  4. في التمرير لمحرر "KICS تحميل مجموعات البيانات"، ثم نسخ أو اسم نوع الملف وموقع المجلد في سطر الأوامر التي تبدأمع IMG = على سبيل المثال "C: المستخدمين المستندات AQP3dynamics stack1crop.tif". في سطر الأوامر أدناه موقع المجلد تعيين عدد من الأطر ليتم تحليلها - مثل [1:500]. استخدام نفس الإعدادات لكافة الأفلام متتالية في سلسلة بيانات. إذا كان هناك انحراف التركيز في إطارات في وقت لاحق، ينبغي استبعاد هذه من التحليل.
  5. في محرر انقر فوق "حفظ" ثم انقر فوق "تقييم الخلية". يتم تحميل بيانات الآن في البرنامج في التحليل.
  6. في إطار تحليل KICS في واجهة المستخدم الرسومية، أدخل الإعدادات للتحليل:
    1. Unclick صناديق "T الخلية".
    2. أدخل عدد تأخيرات زمنية ليتم تحليلها. وعدد من الفجوات الزمنية (τ) يكون لها تأثير على المؤامرة نشرها ويجب أن يتم اختياره بحيث المؤامرة نشرها هو الخطية. تبدأ مع دخول 25 ثم تنخفض إلى حيث المؤامرة نشرها هو الخطية. τ هو عدد مرات تتخلف التحليل KICS يقارن وتأخر الوقت هو الوقت المناسب بإلى صف إطار واحد والقادمة. وينبغي اختيار أصغر قيمة التي تعطي مؤامرة الخطية. الحد الأقصى لعدد تأخيرات زمنية يتم اختيار بحيث يتم الحصول على تناسب خطي، واختيار وقيمة أعلى إنتاج البيانات التي لا يمكن تركيبها الخط.
    3. أدخل الحد الأقصى لقيمة ك 2 (انظر دائرة 1 في الشكل 1)، فإنه عادة ما يكون 20-50. وخير ك 2 المؤامرة هي مؤامرة التي توجد فيها العديد من نقاط البيانات التي يتم توزيعها على طول الخط. تبدأ مع دخول 70 ثم تنخفض بعد أن قيمت ك 2 ونشر المؤامرات وتحديد أدنى قيمة حيث الكتلة نقاط البيانات حول خط مستقيم. ك 2 القيمة هو حجم التربيعية للالمكانية ك متجه في الفضاء فورييه.
      في البداية، ينبغي تكرار تحليل حتى يتم تحديد أفضل القيم، ثم استخدام نفس الإعدادات لكافة الأفلام التوالي في سلسلة البيانات ولكن دائما التأكد من أن إعدادات اختيار تعطي مناسبا للبيانات: ك جيدة 2 المؤامراتومؤامرة نشر الخطية.
    4. انقر على زر "إعدادات المتجر والمضي قدما".
    5. انقر فوق "نعم" لإظهار كافة الرسوم البيانية.
    6. انقر فوق "تحميل صورة سلسلة" (انظر دائرة 2 في الشكل 1)، ثم انقر فوق "مساحة العمل".
    7. حدد "imgSerCrop"، ثم انقر فوق "استيراد من مساحة عمل".
    8. إدخال الضبط جمع نظام التصوير. في "حجم بكسل" مربع أدخل الحجم المتوقع بيكسل للنظام التصوير الذي يتم الحصول مداخن الصورة. لAQP3-EGFP، استخدمت 0.111. في المربع "أدخل الوقت (ق) بين الإطارات"، وكان يستخدم لAQP3 0.1150-EGFP.
    9. انقر فوق "تحديد رويس"، أدخل "1"، انقر فوق موافق و"استخدام الصورة كاملة".
    10. انقر على زر "التحليل هل KICS" وانقر فوق نعم للقيام به "تصفية متحرك". سوف تفتح تلقائيا النتائج كصور.
    11. تصغير إطار إعدادات، والتقليل من معلومات الخلية يندوث، وتصغير إطار photophysics. في إطار ديناميكية، تحقق من أن المؤامرة ديناميات يظهر تناسب خطية من البيانات إلى خط مع ميل سلبي وهذا يعني أن نقاط البيانات ربط ويمكن الافتراض نشرها مجانا. تسجيل معامل الانتشار لتأخر وقت محدد وك 2 إعدادات (أنه ليس من الضروري أن نشير إلى الانحراف المعياري للصالح). يجب أن تتجمع نقاط البيانات في المؤامرات ك 2 حول خط لوقت معين تتخلف.
    12. مربع التجزئة "حفظ أرقام المفتوحة كصور"، ثم انقر فوق "حفظ أرقام المفتوحة كصور" لإنقاذ يؤدي الملفات. حفظ في مجلد جديد تحت C: المستخدمين المستندات AQP3diffusion. انقر فوق "البيانات الحالية واضحة" وتواصل مع تحليل المحصول المقبل.

يتم احتساب 3. متوسط ​​معامل الانتشار المحسوبة للحصول على نظرة عامة على تحليل البيانات

  1. أدخل معاملات نشر الفردية من كل العائد على الاستثمار في spreadsheet (تأكد من أن نلاحظ τ وك 2 القيم)، استخدم أسماء المحاصيل كما هو مبين أعلاه.
  2. حساب متوسط ​​معامل الانتشار والانحراف المعياري باستخدام برنامج جدول بيانات.
  3. إجراء اختبار كولموجوروف-سميرنوف أو الطلاب اختبار t لتقييم فروق ذات دلالة إحصائية باستخدام مستوى الدلالة 5٪. ويمكن إجراء مقارنات Quantitave بين الخلايا (على سبيل المثال يعامل مقابل nontreated).
  4. فتح إصدار جداول للنشر المؤامرات التي تم إنشاؤها بواسطة برامج التحليل لكل محصول، ويبلغ متوسط ​​البيانات لكل حالة لكل تأخر الوقت. توليد مؤامرة جديدة لنشرها في المتوسط ​​في تقديم أوراق أو العروض التقديمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

للحصول على مداخن صورة مناسبة ليتم تحليلها مع KICS، ويمكن استخدام نظم المجهر مختلفة. فمن الممكن لتحليل تسلسلات الصور من المجهر مضان برنامج التحصين الموسع فضلا عن TIRF أو الغزل قرص الإعداد. يجب أن يكون غشاء مسطحة دون أي عضيات الخلية تتحرك كبيرة أو تتحرك الحويصلات / الكائنات. تعرض هذه الورقة على تسلسل الصور الفاصل الزمني من AQP3 المفتاحية EGFP في الخلايا الحية MDCK تصويرها على المجهر القرص الغزل مع التركيز تعيين إلى غشاء البلازما بمعدل 9.2 إطار هرتز. تم تعيين التركيز على القاعدية (أسفل) غشاء البلازما. وقد تم مؤخرا نشر البيانات في AJP الزنزانة 13.

الرقم 2A يظهر صورة للخلية. وscalebar هو 10 ملم ويتم تسليط الضوء المحاصيل سبيل المثال العائد على الاستثمار في المستطيلات. لاختيار المحاصيل من المهم أن المحاصيل في محيط الخلية حيث الغشاء هو موحد وثابت لذلك هو تصور سوى نشر ثنائية الأبعاد. سلالعضيات لتر، حويصلات والتوقعات غشاء ينبغي تجنبها وأنه من المهم لتحليل عدم وجود الانجراف خلال مرور الوقت. يتم عرض أمثلة المحاصيل التي سيتم استبعادها من التحليل في أرقام 2B و 2C. تسهم الحويصلات الانتقال إلى الارتباط (الشكل 2B) وثقوب في غشاء التي تتحرك في هذه الحالة قليلا (الشكل 2C) من الواضح أنه لا ينبغي أن تدرج في التحليل. من المهم أيضا أن محصول العائد على الاستثمار هو كبير بما يكفي لأخذ العينات المكانية الكافية للتحليل (للتصوير مع ارتفاع NA عدسة الهدف حجم خطي الحد الأدنى من 32 بكسل هو المبدأ التوجيهي معقولة). حول هذه البينات تم استخدام 60X (NA 1.40).

ويبين الشكل 3A المؤامرة نشر أحد المحاصيل ولدت مع KICS. هذه الطريقة يمكن استخدامها لإيجاد معامل الانتشار من البروتين الموسومة مع EGFP (أو بروتين فلوري أخرى)، صبغةأو نقاط الكم. المنحدر من منحنى في المؤامرة نشر هو مجرد السلبية لمعامل الانتشار. في هذه الحالة، كان معامل انتشار AQP3-GFP 0.0104 ± 0.0040 ميكرون 2 / ق. الشكل 3B هو مؤامرة نشر حساب مع الكثير من الوقت تتخلف، في هذه الحالة وإعادة بنائه التحليل ولكن مع الوقت أقل تتخلف بحيث المؤامرة نشرها غير الخطية.

ويعرض الشكل 4A نموذجية ك 2 المؤامرة. هذا هو منحنى ارتباط متوسط ​​شعاعيا وقانون الجنسية تحولت لفترة زمنية محددة. من هذه المؤامرات ك 2 هو تآمر المنحدر مقابل الوقت متأخرا والنتيجة هي مؤامرة نشرها كما هو مبين في الشكل 3A. عندما تفقد ك 2 المؤامرات، من المهم أن يتم تقييم مناسبا. الشكل 4B مثال من حزب العدالة والتنمية 2 مؤامرة التي يمكن الاستنتاج أن المحاصيل صغير جدا ولا يمكن تحليلها كما يجب لديهم ميل سلبي وتسوس خطيا إلى الطابق الضوضاء. الشكل 4C هو مثال من حزب العدالة والتنمية 2 مؤامرة، الذي يحتاج الى أعادوا تحليل مع خفض الحد الأقصى ك 2 القيمة على أنها لم تعد تناسب جيدة (كما تقرره مخلفات زيادة في أكبر ك 2 القيم). في هذه الحالة يجب تشغيل تحليل الدخول مرة أخرى الحد الأقصى لقيمة أقل ك في هذه الحالة 25.

ويبين الشكل 5 متوسط ​​مؤامرة نشرها بمعدل متوسط ​​أعلى من 10 المحاصيل. تم العثور على المؤامرة نشر في ملف اكسل من التحليل، ويمكن الآن أن متوسط ​​كل المؤامرات نشر لجميع المحاصيل من نفس التجربة. في الناتج المؤامرة نشرها يمكن الجمع بين العلاجات المختلفة للخلية في نفس الرقم. خطوط الاتجاه الموازي متساوون معاملات نشر وخطوط الاتجاه غير متوازية تشير إلى عدم المساواة في نشرها. في هذا الشكل، يتم حساب معامل الانتشار AQP3-EGFP (البيانات من AJP الزنزانة 13).

= "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. لقطة الشاشة من نافذة تحليل KICS. وفي هذا الإطار يتم تحليل KICS. الدوائر التي تشير إلى أزرار للضغط من أجل الخطوات الفردية في البروتوكول. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. الغزل صورة قرص من خلية معربا عن GFP. (A) صورة الممثل من خلية MDCK معربا عن ثابت AQP3-GFP والمحاصيل ممثل مبين. ويتم الحصول على صورة المجهر القرص الغزل مع التركيز على مقربة من غشاء البلازما القاعدية. (B) Repres entative المحاصيل، والتي تم استبعادها من التحليل في KICS لأن هناك حويصلات تتحرك، والتي يمكن أن تسهم في معامل الانتشار. (C) مثال على المحاصيل التي يوجد فيها ثقب في الغشاء، وبالتالي، تم استبعاد هذا المحصول من التحليل. جميع الحانات هي مقياس 10 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
الرقم 3. المؤامرات إنتشار (أ) مؤامرة نشرها ممثل فيها كل نقطة قريبة من خط مناسبا. هذا هو مؤامرة نشر جيدة لأن البيانات هي الخطية. (ب) مثال على وجود مؤامرة لنشر والتي يجب إعادة بنائه التحليل باستخدام عدد أقل من timelags. 3highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 4
الشكل 4. أمثلة ك 2 المؤامرات. (A) مثال جيد ك 2 المؤامرة التي نقاط البيانات موزعة بالتساوي على جانبي خط مناسبا. (ب) مثال على حزب العدالة والتنمية 2 مؤامرة لمحصول أصغر من الحجم الأمثل. في هذا ك 2 المؤامرة، المنحدر من صالح الخط هو إيجابي، وينبغي أن تكون سلبية، وبالتالي يتم استبعاد المحصول من التحليل. (C) ويبين هذا ك 2 مؤامرة أن التحليل يجب إعادة بنائه مع أقصى قيمة أقل ك 2 وذلك لتحديد جزء من مؤامرة ك 2 ويتم توزيع البيانات بالتساوي على جانبي خط مناسبا.oad/51074/51074fig4highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 5
الرقم 5. بلغ متوسط ​​انتشار المؤامرة. متوسط ​​مؤامرة التي تم نشرها بمعدل متوسط ​​أعلى من 10 المحاصيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

قدمت هذه الورقة خطوة بخطوة محة مفصلة عن كيفية تطبيق أسلوب التحليل KICS لتحديد معاملات نشر من صور المجهر من البروتينات ذات الكلمات الدلالية مع البروتينات الفلورية. تحليل مستقل عن التحقيق مع اختيار مجموعة ديناميكية واسعة جدا في كثافة وضع العلامات وبالتالي يمكن أن تطبق أيضا على البروتينات المسمى مع نقاط الكم وكذلك الأصباغ والبروتينات الفلورية مثل EGFP.

لحساب معاملات نشر صالحة للبروتينات، وهناك العديد من الخطوات الحاسمة، والتي تم الأمثل. فمن الضروري أن الصورة البروتينات وصفت على الغشاء فقط. إذا كان هناك كائنات إضافية مثل الانتقال حويصلات أو عضيات الخلية في تسلسل الصور ليتم تحليلها، وهذه سوف تسهم في معامل الانتشار المحسوبة مما يؤدي إلى نقص أو مبالغات من معامل الانتشار.

اتباع الخطوات المذكورة أعلاه، رمز واجهة المستخدم الرسومية لKICS هو سهل الاستعمال والثاني هو التحليل السريع. وهو يتضمن العديد من الخطوات في المتوسط: بما في ذلك كل من المتوسط ​​دائرية وحساب المنحدر من المنحدرات نشر مؤامرة وظيفة من يتخلف الوقت، مما يسهل الجيل السريع لمتوسط ​​القيمة وذات دلالة إحصائية لمعامل الانتشار. وبالتالي، مقارنة مع تحليل مستفيض اللازمة لحساب معاملات نشر من التجارب SPT، KICS هو سهل الاستعمال وسريعة ويمكن القيام بها دون تدريب متخصص في الفيزياء الحيوية.

إذا كانت النتائج التحليل في معامل الانتشار سلبية أو مؤامرة نشر الأفقي، ويشمل إصلاح الأعطال الفحص البصري من المحاصيل لمعرفة ما اذا كان يفي بجميع متطلبات وصفها هنا. يمكن أن المحاصيل التي هي صغيرة جدا تسفر unphysical معاملات نشر السلبية ويجب التخلص منها. من أجل حساب معامل الانتشار، فمن الممكن في كثير من الأحيان لجعل المحصول الجديد في أي مكان آخر في ورقة العمل الذي هو مناسبة لتحليل أو لمجرد زيادة المحصولحجم إذا كان ذلك ممكنا.

ويمكن تطبيق هذه التقنية على معظم قواعد البيانات ولكن في الوقت الراهن، يمكن تحليل KICS حساب فقط متوسط ​​معامل الانتشار، ولا يمكن التمييز بين مختلف أنماط الهجرة البروتين أو توليد مسارات. باستخدام KICS، معاملات نشرها يمكن بسهولة استخراج ويمكن مقارنة انتشار البروتين على سبيل المثال بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة أو بين النوع البري ومتحولة البروتين، والتي سوف تكشف إذا كان العلاج من الطفرات لحث على الاختلافات في نشرها، وبالتالي يحتمل أن تكون في البروتين البروتين و / أو تفاعلات البروتين الدهني. وقد تبين البلازما نشر غشاء AQP2 يقاس FRAP أن ينخفض ​​عند إضافة forskolin، ناهض المخيم 10، وعلاوة على ذلك، في ER، نسخة من تحور AQP2 يسبب مرض السكري الكاذب كلوي، تنتشر بشكل مختلف عن wildtype AQP2 9.

على الرغم من أنه من الممكن لحساب معاملات نشر من واحد الجسيمات دآتا باستخدام النزوح التربيعية متوسط، تحليل حجم الجسيمات خطوة أو صورة ارتباط التحليل الطيفي 2،11،12، وهذه الأساليب يمكن تحليل تطالب حسابيا وغالبا ما تتطلب مخصص مكتوبة خوارزميات الكمبيوتر. الاستفادة من بروتوكول KICS المقدمة هنا هو أنه مستقلة نسبيا من كثافة وضع العلامات وسهلة حسابيا. وبالتالي فإن هذا المشي من خلال التحليل KICS تكون مفيدة لكثير من علماء الأحياء الخلايا، الذي يمكن أن تنطبق بسهولة على البروتين غشاء اهتمامهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل زمالة وندبيك ليدر جروب جديد لLNN. يقر PWW دعم التمويل منحة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC). كما نشكر المركز الدانمركي الجزيئية Bioimaging في جامعة جنوب الدنمارك للوصول إلى القرص الغزل المجهر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 31600-083
FBS Invitrogen 10082147
Penicilin   Sigma 13752
Kanamycin Gibco 15160070
Streptomycin Gibco 11860038
Phenol red free medium Gibco 11880-028
DMSO Sigma D8418
HEPES Gibco 15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope Nikon Ti Eclipse
EMCCD Camera Andor Ixon+

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
  2. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
  3. Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
  4. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
  5. Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
  6. Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
  8. Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
  9. Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
  10. Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
  11. Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
  12. Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
  13. Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
من السهل قياس إنتشار معاملات EGFP الموسومة البروتينات عن طريق غشاء البلازما ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).More

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter