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Biology

Facile mesure de coefficients de diffusion de EGFP-marqués plasma protéines membranaires en utilisant K-image de l'espace spectroscopie de corrélation

doi: 10.3791/51074 Published: May 10, 2014

Summary

Ce document fournit un guide étape par étape pour la technique d'analyse de fluctuation k-image de l'espace spectroscopie de corrélation (CCI) pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines marquées par fluorescence de la membrane plasmique des cellules de mammifères vivants.

Abstract

Diffusion latérale et la compartimentation des protéines de la membrane plasmique sont strictement réglementées dans les cellules et donc, l'étude de ces processus va révéler de nouvelles perspectives à plasma fonction de la protéine de la membrane et de la réglementation. Récemment, k-image de l'espace spectroscopie par corrélation (CCI) 1 a été développé pour permettre des mesures de routine de coefficients de diffusion directement à partir des images des protéines de la membrane plasmique marquées par fluorescence, qui ont évité les biais systématiques introduites par photophysique de la sonde. Bien que la base théorique pour l'analyse est complexe, le procédé peut être mis en oeuvre par des non experts en utilisant un code librement disponible pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines. CIEk calcule une fonction de corrélation temporelle d'une image de microscopie à fluorescence pile après transformation de Fourier de chaque image pour réciproque (k-) espace. Par la suite, une moyenne circulaire, logarithme naturel transformée linéaire et correspond à la fonction de corrélation donne le coefficient de diffusion. Cedocument fournit un guide étape par étape pour l'analyse d'image et la mesure des coefficients de diffusion via CIEk.

D'abord, une image d'une séquence de protéines de membrane de plasma marqué par fluorescence de cadence élevée est acquise en utilisant un microscope à fluorescence. Puis, une région d'intérêt (ROI) en évitant organites intracellulaires, les vésicules se déplaçant ou en saillie régions de la membrane est sélectionné. La pile de retour sur investissement est importé dans un code librement disponible et plusieurs paramètres définis (voir la section Méthode) sont définis pour l'analyse des CCI. Le programme génère alors une «pente des pentes« complot des fonctions de corrélation de temps k-espace, et le coefficient de diffusion est calculée à partir de la pente de la courbe. Voici une procédure étape par étape CIEk pour mesurer le coefficient de diffusion d'une protéine de membrane à l'aide du rénale canal d'eau aquaporine-3 marqués avec EGFP comme un exemple canonique.

Introduction

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L'organisation spatio-temporelle quatre dimensions et la mobilité latérale des protéines membranaires plasmatiques sont strictement réglementées et peuvent jouer un rôle dans la fonction de la protéine, l'activité et les interactions protéine-protéine. Diffusion latérale des protéines de la membrane de plasma, a traditionnellement été étudiée en calculant les coefficients de diffusion pour les particules individuelles à partir de l'imagerie time-lapse de point quantique ou un colorant des protéines marquées de la membrane plasmique 2-4. Cette approche nécessite l'insertion d'une étiquette extracellulaire dans le plasma protéine membranaire de point quantique ou un marquage par un colorant, qui peut compromettre le pliage et la fonction des protéines et, par conséquent, ne peut être réalisé pour certaines protéines. Le volume stérique d'un point quantique a été montré pour ralentir la diffusion de la protéine 5 et plus, seule une infime fraction des protéines de la population sont étiquetés avec des points quantiques, et on ne sait pas si cette fraction est représentatif pour l'ensemble de un groupe de protéines de membrane de plasma. Tra de particules simplescking (SPT) des mesures de coefficients de diffusion de la série d'image de protéines marquées de points quantiques consiste à cartographier les positions des pics de représentation des particules avec deux dimensions gaussien Convient suivis par de vastes algorithmes d'analyse. L'analyse est de calcul très intense, ce qui nécessite de courbe non linéaire étendu raccord à chaque trame d'image d'une séquence time-lapse à des approximations de la fonction microscope d'étalement de point (typiquement deux dimensions gaussiennes spatiale) et la liaison subséquente des positions des particules dans les trajectoires des particules décrivant l' mouvement des molécules simples 6,7.

Une technique de corrélation d'images récemment mis au point, k-image de l'espace spectroscopie de corrélation (CCI) permet des mesures relativement simples de coefficients de diffusion de fluorescence protéines marquées de la membrane plasmique. La possibilité de calculer systématiquement les coefficients de diffusion des protéines membranaires avec des protéines fluorescentes marquées par CIEk est un outil unique qui maintientplusieurs avantages par rapport quantique traditionnelle dot analyse SPT: Aucune insertion de balises et temps extracellulaires consommateurs étiquetage extracellulaire est nécessaire (lignées de cellules exprimant des protéines fluorescentes peuvent être utilisés); les coefficients de diffusion sont extraites à partir du pool total de protéines fluorescentes par rapport à un sous-ensemble marqué avec des points quantiques; analyse est simple, sans la nécessité de suivre certaines protéines et l'analyse peut être effectuée en utilisant un code existant sans nécessiter de programmation supplémentaire de l'utilisateur. La méthode est rapide car il s'agit d'une technique de calcul de moyenne, qui permet un calcul rapide et le calcul des coefficients de diffusion. Ces mesures de diffusion rapide de la population en protéines complètent l'information de transport moléculaire plus détaillée obtenue pour un sous-ensemble de la population par les méthodes SPT laborieux.

temps CIEk corrélation microscopie de fluorescence des séquences d'images qui ont d'abord été transformées à l'espace de Fourier, et ainsi sépare flfluctuations uorescence raison de photophysique de celles dues au transport moléculaire 1. En conséquence, les CCI peuvent déterminer la densité en nombre, de la vitesse d'écoulement, et la diffusion des molécules marquées par fluorescence tout en étant biaisée par photoblanchiment complexe ou le clignotement des fluorophores. Cela rend CIEk un outil utile pour déterminer rapidement la dynamique de diffusion de protéines membranaires de cellules marquées par fluorescence, sans la nécessité d'algorithmes d'écriture personnalisées. En plus des protéines marquées par fluorescence, CIEk peuvent également être appliquées à des protéines de membrane quantiques point marqué 8.

Cet article fournit une introduction étape par étape comment utiliser CIEk pour extraire les coefficients de diffusion des protéines de la membrane plasmique EGFP-marqués en démontrant comment placer la culture, comment utiliser le code et comment évaluer les tracés générés, dont la diffusion les coefficients sont extraits. A titre d'exemple, les données obtenues par filage ensemble disque-microscopie en réflexion totale interne semi-fluorescenceMode nce (FRBR), d'une protéine canal rénale de l'eau aquaporine-3 (AQP3) étiqueté avec EGFP est présenté.

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Protocol

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Acquisition des protéines EGFP-marqué dans la membrane du plasma pour l'analyse des CIEk peut être fait sur un microscope à épifluorescence, une configuration de TIRF ou sur un microscope à disque rotatif fixé à acquérir des images de la membrane d'intérêt. La taille de pixel caméra ainsi que le temps entre les trames d'image sont nécessaires pour l'analyse. Les séquences d'images de 100-1,200 images à un taux de 4-30 Hz cadre peuvent être utilisés pour l'analyse. Au cours de l'acquisition, il est important de maintenir la membrane à l'orientation tout au long de la durée de l'imagerie et de se concentrer sur une fraction de la membrane à plat dans laquelle la fluorescence est uniformément répartie. Déménagement vésicules, dépassant les régions membranaires et des organites cellulaires peut être cultivé plus tard dans le processus d'analyse. Le temps d'acquisition doit être choisi de sorte qu'il n'y ait pas de dérive ou du mouvement de la cellule.

Pour obtenir les scripts de code CCI pour MATLAB, communiquez avec Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). La première fois que le code est utilisé CIEk, MAT ouvertLAB et cliquez sur le fichier, puis définissez le chemin, puis cliquez sur ajouter des sous-dossiers et trouver le dossier sur l'ordinateur dans lequel le code CIEk se trouve. Puis cliquez sur OK, enregistrer et fermer. Maintenant, continuez avec l'analyse des cultures décrites dans les points suivants.

1. Importer la séquence d'images d'intérêts dans un programme d'analyse d'imagerie comme une pile TIFF

Enregistrez le fichier avec le nom: stack1.tif.

  1. Sélectionnez une région rectangulaire d'intérêt (ROI) à la partie plate de la membrane à l'exclusion des organites cellulaires mobiles et dépassant les régions de la membrane. La taille de la récolte est choisi de telle sorte que suffisamment de statistiques sont générées pour bien k 2 parcelles.
  2. Recadrage de la région et de sauver la récolte en tant que fichier TIFF dans un dossier approprié. S'il ya plusieurs cultures par le même film, utiliser un incrément de nombre, par exemple «stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
  3. Placez le dossier contenant les cultures localementsur l'ordinateur, pas sur un serveur, tout en faisant l'analyse des CCI.

2. Importez les cultures dans le logiciel d'analyse de One by One pour effectuer l'analyse

  1. Ouvrir MATLAB et le type "icsgui" dans la fenêtre de commande et appuyez sur ENTRÉE. ICS GUI est le nom de l'exécutable pour le programme d'interface graphique utilisateur de spectroscopie de corrélation de l'image.
  2. Dans l'interface graphique de ICS cliquez sur l'onglet "CIEk". Une capture d'écran de la fenêtre d'analyse est représenté sur la figure 1.
  3. Trouver le dossier avec le nom du dossier "code MATLAB" et sélectionnez le fichier avec le nom de fichier "Scripts" et l'ouvrir en double-cliquant dessus. Sinon, cliquez droit sur le fichier et sélectionnez "ouvrir avec MATLAB" ou allez dans Fichier, ouvert dans MATLAB et ouvrez le fichier son. Ce fichier est appelé Editor.
  4. Dans le livre de l'éditeur de "données CCI de charge ensembles", puis copier ou nom de fichier de type et l'emplacement du dossier dans la ligne de commande qui commenceavec img = par exemple "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". Dans la ligne de commande ci-dessous l'emplacement du dossier définir le nombre d'images à analyser - par exemple [1:500]. Utiliser les mêmes paramètres pour tous les films consécutifs de la série de données. S'il ya dérive accent dans des cadres plus tard, ceux-ci devraient être exclus de l'analyse.
  5. Dans l'éditeur cliquez sur "enregistrer" puis cliquez sur "évaluer cellule". L'ensemble de données est maintenant chargé dans dans le logiciel d'analyse.
  6. Dans la fenêtre Analyse CIEk dans l'interface graphique, entrez les paramètres de l'analyse:
    1. Décochez boîtes "de cellules T".
    2. Entrez le nombre de décalages dans le temps à analyser. Le nombre de retards de temps (τ) aura un effet sur la parcelle de diffusion et doit être choisi de telle sorte que l'intrigue de diffusion est linéaire. Commencez par entrer 25, puis diminuer à l'endroit où le tracé de diffusion est linéaire. τ est le nombre de décalages dans le temps de l'analyse des CIEk compare et un décalage dans le temps est le temps bntre une trame et la suivante. La plus petite valeur qui donne un tracé linéaire doit être sélectionné. Le nombre maximum de décalages dans le temps est choisi de telle sorte que d'un ajustement linéaire est obtenue, en choisissant une valeur plus élevée de produire des données qui ne peuvent pas être montés en ligne.
    3. Entrez la valeur maximale k 2 (voir cercle 1 dans la figure 1), il est habituellement de 20-50. Un bon k 2 intrigue est un complot dans lequel il ya de nombreux points qui sont répartis le long d'une ligne de données. Commencez par entrer 70, puis diminuer après avoir évalué les k 2 et de diffusion des parcelles et sélectionnez la valeur la plus faible de la grappe de points de données autour d'une ligne droite. La valeur de 2 k est l'amplitude au carré de la k-vecteur spatial dans l'espace de Fourier.
      Initialement, l'analyse doit être répétée jusqu'à ce que les meilleures valeurs sont déterminées, puis utiliser les mêmes paramètres pour tous les films consécutifs de la série de données, mais toujours vérifier que les réglages sélectionnés donnent un bon ajustement aux données: bien k 2 parcelleset un terrain de diffusion linéaire.
    4. Cliquez sur "paramètres de magasins et de procéder".
    5. Cliquez sur "oui" pour afficher tous les graphiques.
    6. Cliquez sur "série d'images de charge" (voir cercle 2 de la figure 1), puis cliquez sur "espace de travail".
    7. Sélectionnez "imgSerCrop", puis cliquez sur "Importer à partir d'espace de travail".
    8. Entrez les paramètres de collecte du système d'imagerie. Dans la "taille de pixel" boîte entrer la taille du pixel projeté pour le système de formation d'image à laquelle les piles d'images sont acquises. Pour AQP3-EGFP, 0.111 ont été utilisés. Dans la zone "Entrer l'heure (s) entre les images", 0,1150 a été utilisé pour AQP3-EGFP.
    9. Cliquez sur "sélectionner ROI", entrer "1", cliquez sur OK et "utiliser l'image entière".
    10. Cliquez sur "analyse Do CIEk" et cliquez sur Oui pour faire "filtrage immobile". Résultats s'ouvriront automatiquement comme des images.
    11. Réduire la fenêtre des paramètres, de minimiser les informations de cellule window, et minimiser la fenêtre de photophysique. Dans la fenêtre dynamique, vérifiez que l'intrigue de la dynamique montre un ajustement linéaire des données à une ligne avec une pente négative ce qui signifie que les points de données en corrélation et la diffusion libre peuvent être assumées. Enregistrer le coefficient de diffusion pour le laps de temps spécifique et k 2 paramètres (il n'est pas nécessaire de noter l'écart-type de l'ajustement). Les points de données dans les k 2 parcelles doivent être regroupés autour de la ligne pour le moment donné traîne.
    12. Cochez la case "Enregistrer figures ouvertes que des images", puis cliquez sur "Sauvegarder figures ouvertes que les images" pour enregistrer des fichiers en résultant. Enregistrer dans un nouveau dossier sous C: Users Documents AQP3diffusion. Cliquez sur "données actuelles clair" et continuer avec l'analyse de la prochaine récolte.

3. Moyen du coefficient de diffusion calculé est calculée pour obtenir une vue d'ensemble des données analysées

  1. Entrez les coefficients de diffusion individuels de chaque ROI dans un spreadsheet (assurez-vous de noter le τ et k 2 valeurs), utilisez les noms des cultures que fixé ci-dessus.
  2. Calculer le coefficient de diffusion moyenne et écart-type à l'aide d'un tableur.
  3. Effectuez un test de Kolmogorov-Smirnov ou étudiants t-test pour évaluer les différences statistiques en utilisant un niveau de signification de 5%. Quantitave comparaisons entre les cellules (par exemple traitées vs non traitées) peuvent être faites.
  4. Ouvrez la version de feuille de calcul des parcelles de diffusion qui a été généré par le logiciel d'analyse pour chaque culture, et la moyenne des données pour chaque condition pour chaque décalage. Générer un nouveau terrain de diffusion moyenne pour présenter dans des documents ou des présentations.

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Representative Results

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Pour acquérir des piles d'images convenant pour être analysés à l'aide CIEk, des microscopes différents peuvent être utilisés. Il est possible d'analyser des séquences d'images à partir d'un microscope à épifluorescence, ainsi que d'une configuration de disque TIRF ou filage. La membrane doit être plat, sans grandes organites cellulaires mobile ou le déplacement des vésicules / objets. Cet article présente une séquence d'images de laps de temps de AQP3 étiqueté avec EGFP dans des cellules MDCK vivants reproduits sur un microscope à disque en rotation avec un accent mis sur la membrane de plasma à un taux de 9,2 Hz de cadre. L'accent a été fixé à la membrane plasmique basale (en bas). Les données ont été récemment publiées dans AJP cellule 13.

La figure 2A montre une image de la cellule. La barre d'échelle est de 10 mm et les cultures exemple de ROI sont mis en évidence dans des rectangles. Pour la sélection des cultures, il est important de découper à la périphérie de la cellule dans laquelle la membrane est uniforme et plane de sorte qu'une diffusion à deux dimensions est visualisée. Cell organites, des vésicules et des projections de la membrane doit être évitée et il est important pour l'analyse qu'il n'y a pas de dérive pendant le laps de temps. Des exemples de cultures qui seraient exclus de l'analyse sont présentés sur les figures 2B et 2C. Vésicules mobiles contribuent à la corrélation (figure 2B) et des trous dans la membrane qui dans ce cas se déplacent légèrement (figure 2C) devrait évidemment pas être inclus dans l'analyse. Il est également important que la récolte de ROI est suffisamment grande pour avoir un échantillonnage spatial suffisant pour l'analyse (par imagerie avec une grande lentille d'objectif NA une dimension linéaire minimale de 32 pixels est une ligne directrice raisonnable). Pour cet ensemble de données un 60X (NA 1,40) a été utilisé.

La figure 3A montre le tracé de la diffusion d'une culture générée avec les CCI. Cette méthode peut être utilisée pour trouver le coefficient de diffusion d'une protéine marquée avec l'EGFP (protéine fluorescente ou une autre), un colorantou points quantiques. La pente de la courbe dans le diagramme de diffusion est tout simplement le négatif du coefficient de diffusion. Dans ce cas, le coefficient de diffusion de AQP3-GFP était 0,0104 ± 0,0040 um 2 / s. Figure 3B est une parcelle de diffusion calculé avec trop de décalages dans le temps, dans ce cas, l'analyse a été refaite, mais avec moins de décalages dans le temps de sorte que l'intrigue de diffusion est linéaire.

La figure 4A présente un type k 2 parcelle. Il s'agit de la courbe de corrélation radiale moyenne et ln transformé pour un décalage temporel choisi. A partir de ces k 2 représente graphiquement la pente est tracée en fonction de décalages dans le temps et le résultat est la trame de diffusion comme le montre la figure 3A. Lors de l'inspection des k 2 parcelles, il est important que l'ajustement est évaluée. Figure 4B est un exemple de ak 2 parcelle pour laquelle il peut être conclu que la culture est trop petit et ne peut pas être analysé comme il se doitont une pente négative et décroissance linéaire jusqu'à un plancher de bruit. figure 4C est un exemple de ak 2 parcelle qui doit être réanalysé avec une 2 valeur k maximale réduite que l'ajustement n'est plus bon (à en juger par les résidus de plus en plus au grand k 2 valeurs). Dans ce cas, l'analyse doit être exécuté entrer encore une fois une valeur maximale inférieure k 2, dans ce cas 25.

La figure 5 montre une parcelle de diffusion moyenne en moyenne plus de 10 cultures. L'intrigue de diffusion a été trouvé dans le fichier Excel de l'analyse, et toutes les parcelles de diffusion peut maintenant être en moyenne pour toutes les cultures de la même expérience. Dans le diagramme de diffusion résultant de différents traitements de la cellule peuvent être combinés dans la même figure. Lignes de tendance parallèles sont des coefficients de diffusion et l'égalité des lignes non parallèles indiquent des tendances diffusion inégale. Sur cette figure, le coefficient de diffusion AQP3-EGFP est calculé à partir de données (13) AJP cellulaire.


Figure 1. Capture d'écran de la fenêtre d'analyse des CCI. Dans cette fenêtre, l'analyse des CCI se fait. Les cercles indiquent quels boutons appuyer pour les différentes étapes du protocole. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. L'image du disque d'une cellule exprimant la GFP de rotation. (A) Représentant l'image d'une cellule MDCK exprimant de façon stable AQP3-GFP et cultures représentatives indiquées. L'image est acquise sur un microscope à disque en rotation avec le foyer à proximité de la membrane plasmique basale. (B) Repres sentatifs culture, qui a été exclu de l'analyse en CIEk car il ya des vésicules mobiles, qui peuvent contribuer à le coefficient de diffusion. (C) Un exemple d'une culture dans laquelle il existe un trou dans la membrane, par conséquent, cette culture a été exclu de l'analyse. Toutes les barres d'échelle sont de 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3
Figure 3. Parcelles de diffusion. (A) Une parcelle de diffusion représentatif dans lequel tous les points sont proches de l'ajustement de la ligne. C'est une bonne intrigue de diffusion parce que les données sont linéaires. (B) Un exemple d'une parcelle de diffusion pour lesquelles l'analyse doit être refaite en utilisant un nombre inférieur de timelags. 3highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4
Figure 4. Exemples de k 2 parcelles. (A) Un exemple de bonne k 2 complot dans lequel les points de données sont également répartis de chaque côté de la coupe de ligne. (B) Un exemple de ak 2 parcelle pour une culture plus petit que la taille optimale. Dans ce k 2 parcelle, la pente de la forme de la ligne est positive, il devrait être négatif et donc la culture est exclue de l'analyse. (C) Ce k 2 parcelle montre que l'analyse doit être refaite avec une valeur maximale inférieure k 2 pour sélectionner la partie de la parcelle k 2 sont les données sont réparties de manière égale de chaque côté de la coupe de ligne.oad/51074/51074fig4highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 5
Figure 5. Moyenné parcelle de diffusion. Une moyenne de parcelle de diffusion qui a été en moyenne de plus de 10 cultures.

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Discussion

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Ce document présente un aperçu détaillé étape par étape de la façon d'appliquer la méthode d'analyse des CIEk pour déterminer les coefficients de diffusion à partir d'images de microscopie de protéines marquées avec des protéines fluorescentes. L'analyse est indépendant du choix de la sonde avec une très large gamme dynamique de la densité de marquage et peut donc également être appliquée à des protéines marquées avec des points quantiques ainsi que des colorants et des protéines fluorescentes telles que la EGFP.

Pour calculer les coefficients de diffusion valides pour les protéines, il existe plusieurs étapes critiques, qui ont été optimisées. Il est essentiel pour l'image des protéines marquées sur la membrane seule. Si il ya des objets supplémentaires comme le déplacement des vésicules ou des organites cellulaires dans la séquence d'images à analyser, ceux-ci contribuent au coefficient de diffusion calculé qui se traduit par moins de ou des surestimations du coefficient de diffusion.

Après les étapes ci-dessus, le code de l'interface graphique pour l'utilisateur CIEk est un match amicale analyse est rapide. Il comprend plusieurs étapes: en moyenne, y compris l'étalement à la fois circulaire et le calcul de la pente du tracé des pentes de diffusion en fonction des décalages dans le temps, ce qui facilite la génération rapide d'une valeur moyenne et statistiquement significatif pour le coefficient de diffusion. Ainsi, par rapport à l'analyse approfondie nécessaire pour calculer les coefficients de diffusion des expériences SPT, les CCI est convivial, rapide utilisateur et peut être effectuée sans une formation spécialisée en biophysique.

Si l'analyse aboutit à un coefficient de diffusion négative ou une parcelle de diffusion horizontale, dépannage comprend l'inspection visuelle de la culture pour voir si elle remplit toutes les conditions décrites ici. Cultures qui sont trop petites peuvent donner non physiques coefficients de diffusion et négatifs doivent être mis au rebut. Afin de calculer un coefficient de diffusion, il est souvent possible de faire une nouvelle récolte ailleurs dans l'ensemble de données qui est approprié pour l'analyse ou simplement augmenter la récoltetaille si possible.

Cette technique peut être appliquée à la plupart des ensembles de données mais actuellement, l'analyse CIEk ne peut calculer un coefficient de diffusion moyen et ne peut pas distinguer les différents schémas de migration des protéines ou de générer des trajectoires. Utilisation CIEk, les coefficients de diffusion peuvent être facilement extraites et diffusion d'une protéine peuvent être comparés, par exemple entre les cellules traitées et non-traitées ou entre un type sauvage et d'une protéine mutante, qui révélera si le traitement de mutations induisent des différences dans la diffusion et, par conséquent potentiellement en protéine-protéine et / ou les interactions protéine-lipide. Plasma membrane de diffusion AQP2 mesurée par le PAF a été montré pour diminuer lors de l'addition de forskoline, un agoniste de l'AMPc 10, et en outre, dans l'ER, une version mutée de AQP2 provoquant le diabète insipide néphrogénique, diffuse différemment de type sauvage AQP2 9.

Bien qu'il soit possible de calculer des coefficients de diffusion de particule data en utilisant le déplacement quadratique moyenne, l'analyse de la taille de l'étape ou par images de particules spectroscopie de corrélation de 2,11,12, ces méthodes d'analyse peuvent être des calculs exigeants et nécessitent souvent la coutume écrits des algorithmes informatiques. L'avantage de ce protocole CIEk présenté ici est qu'il est relativement indépendante de la densité de marquage et de calcul facile. Cette promenade à travers l'analyse CIEk sera donc utile pour de nombreux biologistes cellulaires, qui peuvent facilement l'appliquer à leur protéine membranaire d'intérêt.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une Lundbeck Junior Group Leader Bourse de LNN. PWW reconnaît le soutien financier de la subvention du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et. Nous remercions également le danois moléculaire Bioimaging Centre à l'Université du Danemark du Sud pour l'accès à la filature microscopie disque.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 31600-083
FBS Invitrogen 10082147
Penicilin   Sigma 13752
Kanamycin Gibco 15160070
Streptomycin Gibco 11860038
Phenol red free medium Gibco 11880-028
DMSO Sigma D8418
HEPES Gibco 15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope Nikon Ti Eclipse
EMCCD Camera Andor Ixon+

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).More

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).

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