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Biology

कश्मीर अंतरिक्ष छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग EGFP टैग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन का प्रसार गुणांक की आसान माप

doi: 10.3791/51074 Published: May 10, 2014

Summary

इस पत्र की fluorescently लाइव स्तनधारी कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन लेबल प्रसार गुणांक को मापने के लिए उतार - चढ़ाव विश्लेषण तकनीक कश्मीर अंतरिक्ष छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (kICS) के लिए कदम गाइड द्वारा एक कदम प्रदान करता है.

Abstract

पार्श्व प्रसार और प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की compartmentalization कसकर कोशिकाओं में विनियमित रहे हैं और इस प्रकार, इन प्रक्रियाओं का अध्ययन प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन समारोह और विनियमन के लिए नए अंतर्दृष्टि खोलेगा. हाल ही में, कश्मीर अंतरिक्ष छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (kICS) 1 सीधे जांच Photophysics द्वारा शुरू की व्यवस्थित पूर्वाग्रहों से बचा कि fluorescently टैग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की छवियों, से प्रसार गुणांक की दिनचर्या माप सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था. विश्लेषण के लिए सैद्धांतिक आधार जटिल है हालांकि, विधि प्रोटीन का प्रसार गुणांक को मापने के लिए एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कोड का उपयोग कर nonexperts द्वारा कार्यान्वित किया जा सकता है. kICS पारस्परिक (कश्मीर) अंतरिक्ष करने के लिए प्रत्येक छवि के फूरियर परिवर्तन के बाद एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि ढेर से एक समय सहसंबंध समारोह गणना करता है. बाद में, परिपत्र औसतन, प्राकृतिक लघुगणक बदलने और रैखिक पैदावार सहसंबंध समारोह के लिए प्रसार गुणांक फिट बैठता है. यहकागज kICS के माध्यम से छवि विश्लेषण और प्रसार गुणांक की माप के लिए एक कदम दर कदम मार्गदर्शन प्रदान करता है.

सबसे पहले, एक fluorescently लेबल प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन का एक उच्च फ्रेम दर छवि अनुक्रम एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग अधिग्रहण कर लिया है. फिर, ब्याज (आरओआई) झिल्ली क्षेत्रों, intracellular organelles परहेज पुटिका चलती है या फैला हुआ की एक क्षेत्र का चयन किया है. आरओआई ढेर एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कोड में आयात किया जाता है और कई परिभाषित मापदंडों (विधि अनुभाग देखें) kICS विश्लेषण के लिए सेट कर रहे हैं. कार्यक्रम तो कश्मीर अंतरिक्ष समय सहसंबंध कार्यों से साजिश एक "ढलान की ढलान" उत्पन्न करता है, और प्रसार गुणांक भूखंड की ढलान से गणना की है. नीचे एक विहित उदाहरण के रूप में EGFP के साथ टैग गुर्दे पानी चैनल aquaporin-3 का उपयोग कर एक झिल्ली प्रोटीन के गुणांक प्रसार को मापने के लिए एक कदम दर कदम kICS प्रक्रिया है.

Introduction

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प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की चार आयामी spatiotemporal संगठन और पार्श्व गतिशीलता कसकर विनियमित रहे हैं और प्रोटीन समारोह, गतिविधि और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में एक भूमिका निभा सकते हैं. प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के पार्श्व प्रसार, पारंपरिक रूप से क्वांटम डॉट के समय चूक इमेजिंग से एक कण के लिए प्रसार गुणांक की गणना या लेबल प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन 2-4 डाई द्वारा अध्ययन किया गया है. यह दृष्टिकोण प्रोटीन तह और समारोह समझौता कर सकते हैं और इस तरह, कुछ प्रोटीन के लिए प्राप्त नहीं किया जा सकता है जो क्वांटम डॉट या डाई लेबलिंग के लिए प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन, में एक बाह्य टैग की प्रविष्टि की आवश्यकता है. एक क्वांटम डॉट की steric मात्रा प्रोटीन 5 का प्रसार धीमा करने के लिए और इसके अलावा, जनसंख्या में प्रोटीन की केवल एक छोटे से अंश क्वांटम डॉट्स के साथ चिह्नित कर रहे हैं दिखाया गया है, और इस अंश कुल के लिए प्रतिनिधि है अगर यह ज्ञात नहीं है प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के पूल. एक कण टीआरएक्वांटम डॉट लेबल प्रोटीन की छवि श्रृंखला से प्रसार गुणांक के cking (SPT) माप मानचित्रण दो आयामी गाऊसी के कणों के साथ imaged शिखर पदों पर व्यापक विश्लेषण एल्गोरिदम द्वारा पीछा फिट बैठता शामिल है. विश्लेषण का वर्णन कण trajectories में माइक्रोस्कोप बात फैल समारोह (आमतौर पर दो आयामी स्थानिक Gaussians) और कण पदों के बाद से जोड़ने का अनुमान इस के लिए एक समय चूक अनुक्रम की प्रत्येक छवि फ्रेम में फिटिंग व्यापक गैर रेखीय वक्र की आवश्यकता होती है, computationally बहुत गहन है एकल अणुओं 6,7 की गति.

हाल ही में विकसित छवि सहसंबंध तकनीक, कश्मीर अंतरिक्ष छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (kICS) की fluorescently प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन में चिह्नित प्रसार गुणांक के रिश्तेदार सरल माप सक्षम बनाता है. नियमित kICS द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल झिल्ली प्रोटीन का प्रसार गुणांक की गणना करने की संभावना रखती है जो एक अनूठे उपकरण हैपारंपरिक क्वांटम पर कई फायदे SPT विश्लेषण डॉट: बाह्य लेबलिंग लेने कोशिकी टैग और समय की कोई प्रविष्टि (फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा सकता है) की आवश्यकता है; प्रसार गुणांक क्वांटम डॉट्स के साथ लेबल एक सबसेट की तुलना में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की कुल पूल से निकाले जाते हैं; विश्लेषण एक प्रोटीन को ट्रैक करने की आवश्यकता के बिना सरल है और विश्लेषण अतिरिक्त उपयोगकर्ता प्रोग्रामिंग के लिए कोई आवश्यकता के साथ एक मौजूदा कोड का उपयोग किया जा सकता है. यह प्रसार गुणांक की तेजी गणना और गणना में सक्षम बनाता है जो एक औसत तकनीक है क्योंकि विधि तेजी है. प्रोटीन की आबादी के लिए इन तेजी से प्रसार माप श्रमसाध्य SPT तरीकों से आबादी का एक सबसेट के लिए प्राप्त की और अधिक विस्तृत आणविक परिवहन जानकारी के पूरक हैं.

kICS समय पहले फूरियर अंतरिक्ष के लिए बदल दिया गया है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि दृश्यों संबद्ध है, और इस तरह FL अलग करती हैआणविक परिवहन 1 के कारण उन से Photophysics के कारण uorescence उतार चढ़ाव. नतीजतन, kICS, संख्या घनत्व निर्धारित गति प्रवाह, और जटिल photobleaching द्वारा निष्पक्ष जा रहा है या fluorophores के निमिष जबकि प्रसार की fluorescently अणुओं लेबल कर सकते हैं. इस kICS जल्दी कस्टम लिखने एल्गोरिदम की आवश्यकता के बिना fluorescently लेबल कोशिका झिल्ली प्रोटीन का प्रसार गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण बना देता है. इसके अलावा fluorescently लेबल प्रोटीन, kICS भी क्वांटम डॉट लेबल झिल्ली प्रोटीन 8 के लिए लागू किया जा सकता है.

इस पत्र कोड और कैसे उत्पन्न भूखंडों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग करने के लिए कैसे, फसल स्थान के लिए प्रदर्शन कैसे द्वारा EGFP टैग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन का प्रसार गुणांक निकालने के लिए kICS का उपयोग करने के लिए एक कदम दर कदम परिचय देता है जो प्रसार से गुणांकों निकाले जाते हैं. एक उदाहरण के रूप में, अर्द्ध कुल आंतरिक प्रतिबिंब में डिस्क माइक्रोस्कोपी सेट कताई द्वारा प्राप्त आंकड़ों प्रतिदीप्तिEGFP के साथ टैग एक गुर्दे पानी चैनल प्रोटीन aquaporin -3 (AQP3) की nce (TIRF) मोड, प्रस्तुत किया है.

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Protocol

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KICS विश्लेषण के लिए प्लाज्मा झिल्ली में EGFP टैग प्रोटीन का अधिग्रहण एक epifluorescence माइक्रोस्कोप, एक TIRF स्थापना पर या ब्याज की झिल्ली की छवियों को प्राप्त करने के लिए सेट एक कताई डिस्क खुर्दबीन पर किया जा सकता है. छवि फ्रेम के बीच कैमरा पिक्सेल आकार के साथ ही समय विश्लेषण के लिए आवश्यक है. 4-30 हर्ट्ज की एक फ्रेम दर पर 100-1,200 फ्रेम की छवि दृश्यों के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अधिग्रहण के दौरान, यह इमेजिंग की अवधि के दौरान ध्यान में झिल्ली रखने और प्रतिदीप्ति समान रूप से वितरित किया जाता है, जिसमें फ्लैट झिल्ली का एक अंश पर ध्यान देना बहुत जरूरी है. , पुटिका चलती झिल्ली क्षेत्रों और सेल organelles फैला हुआ बाद में विश्लेषण की प्रक्रिया में बाहर खड़ी की जा सकती है. सेल का कोई अभिप्राय या आंदोलन इतना है कि वहाँ अधिग्रहण के समय से चुना जाना चाहिए.

MATLAB के लिए kICS कोड लिपियों प्राप्त करने के लिए, पॉल ऋषि संपर्क (Paul.Wiseman @ McGill.ca). पहली बार kICS कोड, खुला मेट प्रयोग किया जाता हैलैब और फ़ाइल पर क्लिक करें, फिर सेट पथ, तो सबफ़ोल्डर्स के साथ जोड़ने के लिए क्लिक करें और kICS कोड स्थित है जिसमें कंप्यूटर पर फ़ोल्डर लगता है. तो, ठीक क्लिक करें सहेजें और बंद. अब अगले अंक में वर्णित फसलों के विश्लेषण के साथ जारी है.

1. एक झगड़ा ढेर के रूप में एक इमेजिंग विश्लेषण कार्यक्रम में ब्याज की छवि अनुक्रम आयात

Stack1.tif: नाम के साथ फ़ाइल सहेजें.

  1. झिल्ली चलती सेल organelles छोड़कर और झिल्ली क्षेत्रों फैला हुआ के फ्लैट हिस्से पर ब्याज (आरओआई) के एक आयताकार क्षेत्र का चयन करें. पर्याप्त आंकड़े अच्छे कश्मीर 2 भूखंडों के लिए उत्पन्न कर रहे हैं कि ताकि फसल में चुना जाता है.
  2. क्षेत्र फसल और एक उचित फ़ोल्डर में एक झगड़ा फ़ाइल के रूप में फसल बचाने के लिए. एक ही फिल्म से कई फसलों हैं, तो, उदाहरण के लिए "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif" एक संख्या वेतन वृद्धि का उपयोग करें.
  3. स्थानीय स्तर पर फसलों वाले फ़ोल्डर रखेंकंप्यूटर पर, नहीं एक सर्वर पर, kICS विश्लेषण कर रही है जबकि.

2. विश्लेषण करने के लिए एक से विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक में फसलें आयात करें

  1. आदेश खिड़की और प्रेस में ओपन MATLAB और प्रकार "icsgui" दर्ज करें. आईसीएस जीयूआई छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी ग्राफिकल यूजर इंटरफेस कार्यक्रम के लिए निष्पादन योग्य नाम है.
  2. आईसीएस जीयूआई में "kICS" टैब पर क्लिक करें. विश्लेषण खिड़की के एक स्क्रीन शॉट चित्र 1 में दिखाया गया है.
  3. फ़ोल्डर नाम "matlab कोड" के साथ फ़ोल्डर ढूँढें और फ़ाइल नाम "स्क्रिप्ट" के साथ फाइल करने के लिए स्क्रॉल करें और इसे डबल क्लिक करके इस खोलें. वैकल्पिक रूप से, सही फ़ाइल क्लिक करें और "matlab के साथ खुला" या फ़ाइल के लिए जाना matlab में खुला और स्क्रिप्ट फ़ाइल को खोलने का चयन करें. यह फाइल संपादक कहा जाता है.
  4. संपादक पुस्तक "लोड kICS डेटा सेट" करने के लिए, तो कमांड लाइन में कॉपी या प्रकार फ़ाइल नाम और फ़ोल्डर स्थान जो शुरू होता है मेंआइएमजी = उदाहरण के लिए ": उपयोगकर्ता दस्तावेज़ AQP3dynamics stack1crop.tif सी 'के साथ. जैसे [1:500] - फ़ोल्डर स्थान नीचे कमांड लाइन में विश्लेषण किया जा फ्रेम की संख्या निर्धारित किया है. डेटा श्रृंखला में सभी लगातार फिल्मों के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग करें. फोकस बहाव बाद फ्रेम में नहीं है, तो इन विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए.
  5. संपादक में, क्लिक करें "सहेजें" और फिर "सेल का मूल्यांकन" पर क्लिक करें. डाटासेट अब विश्लेषण सॉफ्टवेयर में में भरी हुई है.
  6. जीयूआई में kICS विश्लेषण विंडो में विश्लेषण के लिए सेटिंग्स में प्रवेश:
    1. "टी सेल" बॉक्स unclick.
    2. दर्ज समय की संख्या का विश्लेषण किया जा करने के पीछे है. समय lags (τ) की संख्या प्रसार भूखंड पर असर पड़ेगा और प्रसार साजिश रैखिक है कि इतनी चुना जाना चाहिए. 25 में प्रवेश करने के साथ शुरू करो और फिर प्रसार साजिश रैखिक है जहां तक ​​कमी. τ की संख्या है kICS विश्लेषण तुलना समय lags और एक समय अंतराल समय ख हैetween एक फ्रेम और अगले. एक रेखीय साजिश देता है जो छोटे मान का चयन किया जाना चाहिए. समय की अधिकतम संख्या एक रेखीय फिट एक उच्च मूल्य लाइन फिट नहीं किया जा सकता जो डेटा का उत्पादन होगा चुनने, प्राप्त की है कि इतनी चुना है lags.
    3. अधिकतम 2 कश्मीर मान दर्ज (चित्रा 1 में चक्र 1 देखें), यह आमतौर पर 20-50 है. एक अच्छा कश्मीर 2 साजिश एक रेखा के साथ वितरित कर रहे हैं जो कई डेटा बिंदु होते हैं जिसमें एक साजिश है. 70 में प्रवेश करने के साथ शुरू करो और फिर कश्मीर 2 और प्रसार भूखंडों का मूल्यांकन करने के बाद कम होती है और सबसे कम मूल्य का चयन करें जहां एक सीधी रेखा के आसपास डेटा अंक क्लस्टर. कश्मीर 2 मूल्य फूरियर अंतरिक्ष में स्थानिक कश्मीर वेक्टर चुकता परिमाण है.
      अच्छा कश्मीर 2 भूखंडों: प्रारंभ में, विश्लेषण सर्वश्रेष्ठ मूल्यों निर्धारित कर रहे हैं जब तक, तब चयनित सेटिंग डेटा को एक अच्छा फिट दे कि जाँच हमेशा डेटा श्रृंखला में सभी लगातार फिल्मों के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग करें, लेकिन दोहराया जाना चाहिएऔर एक रेखीय प्रसार साजिश है.
    4. "स्टोर सेटिंग्स और आगे बढ़ना" पर क्लिक करें.
    5. सभी रेखांकन को दिखाने के लिए 'हां' पर क्लिक करें.
    6. "लोड छवि श्रृंखला" (चित्रा 1 में 2 सर्कल देखें) पर क्लिक करें, फिर "कार्यस्थान" पर क्लिक करें.
    7. "ImgSerCrop" का चयन करें, तो "कार्यस्थान से आयात" पर क्लिक करें.
    8. इमेजिंग प्रणाली संग्रह सेटिंग्स दर्ज करें. बॉक्स "पिक्सेल आकार" में छवि के ढेर अर्जित कर रहे हैं, जिस पर इमेजिंग प्रणाली के लिए अनुमानित पिक्सेल आकार दर्ज करें. AQP3-EGFP के लिए, 0.111 इस्तेमाल किया गया था. बॉक्स "फ्रेम के बीच समय (ओं) को लिखें" में 0.1150 AQP3-EGFP के लिए इस्तेमाल किया गया था.
    9. "1", ठीक क्लिक करें और "पूरी छवि का उपयोग करें" दर्ज करें, "ROIs चयन" पर क्लिक करें.
    10. "क्या kICS विश्लेषण" पर क्लिक करें और "स्थिर फिल्टरिंग" ऐसा करने के लिए हाँ क्लिक करें. परिणाम छवियों के रूप में स्वतः ही खुल जाएगा.
    11. सेटिंग्स खिड़की को कम करने, सेल की जानकारी windo को कमडब्ल्यू, और Photophysics खिड़की को कम. गतिशीलता विंडो में गतिशीलता साजिश डेटा अंक सहसंबंधी और मुक्त प्रसार माना जा सकता है जिसका अर्थ है कि एक नकारात्मक ढलान के साथ एक लाइन के लिए डेटा की एक रेखीय फिट से पता चलता है कि जांच ले. विशिष्ट समय अंतराल के लिए प्रसार गुणांक रिकार्ड और 2 सेटिंग्स (यह फिट का मानक विचलन नोट करने के लिए आवश्यक नहीं है) K. कश्मीर 2 भूखंडों में डेटा बिंदुओं lags दिए गए समय के लिए लाइन के आसपास एकत्रित होना चाहिए.
    12. टिक बॉक्स "छवियों के रूप में खुला आंकड़े सहेजें", तो परिणाम फ़ाइलों को बचाने के लिए "छवियों के रूप में खुला आंकड़े सहेजें" क्लिक करें. सी के तहत एक नया फ़ोल्डर में सहेजें: उपयोगकर्ता दस्तावेज़ AQP3diffusion . "स्पष्ट मौजूदा डेटा" पर क्लिक करें और अगली फसल के विश्लेषण के साथ जारी है.

गणना प्रसार गुणांक के 3. औसत आंकड़ों के विश्लेषण का अवलोकन प्राप्त करने के लिए गणना की है

  1. एक spre में प्रत्येक रॉय से व्यक्ति प्रसार गुणांक दर्जadsheet (τ ध्यान दें और 2 मूल्यों कश्मीर को बनाना), ऊपर सेट के रूप में फसलों के नाम का उपयोग करें.
  2. स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग औसत प्रसार गुणांक और मानक विचलन की गणना.
  3. एक Kolmogorov-स्मिर्नोव परीक्षण या छात्रों के लिए एक 5% महत्व स्तर का उपयोग सांख्यिकीय मतभेदों का मूल्यांकन करने के लिए टी परीक्षण प्रदर्शन करते हैं. कोशिकाओं (उदाहरण के लिए nontreated बनाम इलाज) के बीच Quantitave तुलना बनाया जा सकता.
  4. प्रत्येक फसल के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न, और हर समय अंतराल के लिए हर हालत के लिए डेटा औसत था जो प्रसार भूखंडों की स्प्रेडशीट संस्करण खोलें. कागजात या प्रस्तुतियों में पेश करने के लिए एक नया औसतन प्रसार साजिश उत्पन्न.

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Representative Results

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KICS साथ विश्लेषण किया जाना उपयुक्त छवि के ढेर प्राप्त करने के लिए, विभिन्न माइक्रोस्कोप प्रणाली का इस्तेमाल किया जा सकता है. यह एक महामारी प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ ही एक TIRF या कताई डिस्क सेटअप से छवि दृश्यों का विश्लेषण करने के लिए संभव है. झिल्ली किसी भी बड़े से बढ़ सेल organelles के बिना या पुटिका / वस्तुओं हिल फ्लैट होना चाहिए. इस पत्र में 9.2 हर्ट्ज की एक फ्रेम दर पर प्लाज्मा झिल्ली के लिए सेट ध्यान देने के साथ एक कताई डिस्क माइक्रोस्कोप पर imaged लाइव MDCK कोशिकाओं में EGFP के साथ टैग AQP3 की एक समय व्यतीत छवि अनुक्रम प्रस्तुत करता है. फोकस बेसल (नीचे) प्लाज्मा झिल्ली में स्थापित किया गया था. डेटा हाल ही में AJP सेल 13 में प्रकाशित किया गया है.

चित्रा 2A सेल की एक छवि को दर्शाता है. scalebar 10 मिमी और उदाहरण आरओआई फसलों आयतों में डाला जाता है. फसलों के चयन के लिए यह झिल्ली वर्दी और फ्लैट तो केवल एक दो आयामी प्रसार कल्पना है, जहां सेल की परिधि में फसल के लिए महत्वपूर्ण है. Celएल organelles, vesicles और झिल्ली अनुमानों से बचा जाना चाहिए और यह कोई बहाव समय व्यतीत हो जाने के दौरान वहाँ है कि विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा, जो फसलों के उदाहरण आंकड़े 2 बी और -2 सी में प्रस्तुत कर रहे हैं. चलती पुटिका सहसंबंध (चित्रा 2 बी) और इस मामले में (चित्रा -2) स्पष्ट रूप से विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए थोड़ा स्थानांतरित जो झिल्ली में छेद करने के लिए योगदान करते हैं. यह आरओआई फसल विश्लेषण के लिए पर्याप्त स्थानिक नमूना (एक उच्च एनए उद्देश्य लेंस के साथ इमेजिंग के लिए 32 पिक्सल के एक न्यूनतम रैखिक आकार एक उचित दिशानिर्देश है) के लिए काफी बड़ी है कि यह भी महत्वपूर्ण है. इस डाटासेट के लिए एक 60X (एनए 1.40) का इस्तेमाल किया गया था.

चित्रा 3A kICS के साथ उत्पन्न एक फसल के प्रसार की साजिश से पता चलता है. इस विधि EGFP (या किसी अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ टैग एक प्रोटीन का प्रसार गुणांक खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक डाईया क्वांटम डॉट्स. प्रसार साजिश में वक्र की ढलान बस गुणांक प्रसार के नकारात्मक है. इस मामले में, AQP3-GFP के प्रसार गुणांक था .0104 ± .0040 माइक्रोन 2 / एस. चित्रा 3B भी कई समय के साथ एक गणना की प्रसार साजिश इस मामले में विश्लेषण redone किया गया था, lags है लेकिन कम समय के साथ lags इतना है कि प्रसार साजिश रैखिक है.

चित्रा -4 ए एक ठेठ कश्मीर 2 प्लॉट प्रस्तुत करता है. यह एक चयनित समय अंतराल के लिए त्रिज्यात औसत और एलएन तब्दील सहसंबंध की अवस्था है. समय lags और चित्रा 3 में दिखाया गया है परिणाम प्रसार साजिश है बनाम इन कश्मीर 2 भूखंडों से ढलान साजिश रची है. कश्मीर 2 भूखंडों का निरीक्षण करते हैं, तो वह उचित मूल्यांकन किया है कि महत्वपूर्ण है. 4B चित्रा यह फसल बहुत छोटा है कि यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है और यह चाहिए विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, जिसके लिए ए 2 साजिश का एक उदाहरण हैएक शोर मंजिल के लिए रैखिक एक नकारात्मक ढलान और क्षय है. चित्रा 4C फिट के रूप में एक कम अधिकतम 2 कश्मीर मूल्य के साथ reanalyzed करने की आवश्यकता है जो ए के 2 प्लॉट का एक उदाहरण है बड़ा कश्मीर में बढ़ रही बच द्वारा न्याय के रूप में (अब अच्छा है 2 मान). इस मामले में विश्लेषण फिर से इस मामले में 25 में, एक कम अधिकतम 2 कश्मीर मान दर्ज चलाया जाना आवश्यक है.

चित्रा 5 एक औसत प्रसार भूखंड पर 10 फसलों का औसत दिखाता है. प्रसार साजिश विश्लेषण से एक्सेल फाइल में पाया गया था, और सभी प्रसार भूखंडों अब एक ही प्रयोग से सभी फसलों के लिए औसतन किया जा सकता. परिणामस्वरूप प्रसार साजिश में सेल के अलग उपचार एक ही व्यक्ति में जोड़ा जा सकता है. समानांतर प्रवृत्ति लाइनों बराबर प्रसार गुणांक हैं और गैर समानांतर प्रवृत्ति लाइनों असमान प्रसार का संकेत मिलता है. इस चित्र में, AQP3-EGFP प्रसार गुणांक (AJP सेल 13 से डेटा) की गणना की जाती है.


चित्रा 1. KICS विश्लेषण विंडो के स्क्रीन शॉट. इस विंडो में kiCS विश्लेषण किया जाता है. हलकों प्रोटोकॉल में अलग अलग चरणों के लिए प्रेस करने के लिए बटन जो संकेत मिलता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
Stably AQP3-GFP और दिखाया प्रतिनिधि फसलों व्यक्त एक MDCK सेल का चित्रा 2. GFP व्यक्त एक सेल की डिस्क छवि स्पिनिंग. (ए) प्रतिनिधि छवि. छवि बेसल प्लाज्मा झिल्ली को फोकस पास से एक कताई डिस्क माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहण कर लिया है. (बी) REPRES प्रसार गुणांक के लिए योगदान कर सकते हैं जो आगे बढ़ vesicles, के बाद से वहाँ kICS में विश्लेषण से बाहर रखा गया था जो entative फसल,. (सी) झिल्ली में एक छेद है, जो कि एक फसल का एक उदाहरण है, इस प्रकार, इस फसल विश्लेषण से बाहर रखा गया था. सभी स्केल सलाखों 10 माइक्रोन हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रसार भूखंडों. (क) सभी बिंदु पंक्ति फिट के करीब हैं, जिसमें एक प्रतिनिधि प्रसार साजिश है. डेटा रैखिक रहे हैं क्योंकि यह एक अच्छा प्रसार साजिश है. (बी) के विश्लेषण timelags की कम संख्या का उपयोग कर पुन: किया जाना चाहिए, जिसके लिए एक प्रसार साजिश का एक उदाहरण है. 3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. कश्मीर के उदाहरण 2 भूखंडों. डेटा बिंदुओं समान रूप से लाइन फिट के दोनों तरफ वितरित कर रहे हैं, जिसमें एक अच्छा कश्मीर 2 प्लॉट की (ए) एक उदाहरण. (बी) के इष्टतम आकार से छोटा एक फसल के लिए ए 2 साजिश का एक उदाहरण है. इस कश्मीर 2 साजिश में, रेखा फिट की ढलान सकारात्मक है, यह नकारात्मक और इसलिए फसल विश्लेषण से बाहर रखा गया है होना चाहिए. (सी) यह कश्मीर 2 साजिश विश्लेषण कश्मीर 2 साजिश का हिस्सा चयन करने के क्रम में एक कम अधिकतम 2 कश्मीर मूल्य के साथ redone होना चाहिए पता चलता है कि डेटा समान रूप से लाइन फिट के दोनों तरफ वितरित कर रहे थे.oad/51074/51074fig4highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रसार साजिश औसत. एक 10 से अधिक फसलों का औसत रहा था कि प्रसार साजिश औसत.

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Discussion

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इस पत्र में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग प्रोटीन की माइक्रोस्कोपी छवियों से प्रसार गुणांक का निर्धारण करने के लिए kICS विश्लेषण पद्धति लागू करने के लिए एक विस्तृत कदम दर कदम अवलोकन प्रस्तुत किया. विश्लेषण लेबलिंग घनत्व में एक बहुत व्यापक गतिशील रेंज के साथ जांच चुनाव से स्वतंत्र है और इस प्रकार भी क्वांटम डॉट्स के साथ ही रंग और ऐसे EGFP के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है.

प्रोटीन के लिए मान्य प्रसार गुणांक की गणना करने के लिए, अनुकूलित किया गया है, जो कई महत्वपूर्ण कदम है, वहाँ रहे हैं. यह केवल झिल्ली पर छवि लेबल प्रोटीन के लिए आवश्यक है. विश्लेषण किया जा करने के लिए छवि अनुक्रम में पुटिका या सेल organelles की तरह चलती अतिरिक्त वस्तुओं रहे हैं, तो इन प्रसार गुणांक के तहत या overestimates में जो परिणाम की गणना गुणांक प्रसार में योगदान करेगा.

ऊपर सूचीबद्ध चरणों का पालन, kICS के लिए जीयूआई कोड उपयोगकर्ता के अनुकूल एक हैएन डी विश्लेषण तेजी है. प्रसार गुणांक के लिए एक औसत और सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मूल्य के त्वरित पीढ़ी की सुविधा जो lags समय के समारोह के रूप में परिपत्र औसत और ढलानों प्रसार भूखंड की ढलान की गणना सहित दोनों: यह कई औसतन चरण शामिल हैं. इस प्रकार, SPT प्रयोगों, kICS से प्रसार गुणांक की गणना करने के लिए आवश्यक व्यापक विश्लेषण की तुलना में उपयोगकर्ता, अनुकूल तेजी है और बायोफिज़िक्स में विशेष प्रशिक्षण के बिना किया जा सकता है.

विश्लेषण एक नकारात्मक गुणांक प्रसार या एक क्षैतिज प्रसार साजिश में यह परिणाम है, तो मुसीबत शूटिंग यह यहाँ वर्णित सभी आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए अगर फसल का निरीक्षण दृश्य भी शामिल है. बहुत छोटे हैं जो फसलों unphysical नकारात्मक प्रसार गुणांक प्राप्ति कर सकते हैं और त्याग किया जाना चाहिए. एक प्रसार गुणांक की गणना करने के लिए, यह विश्लेषण के लिए या बस फसल बढ़ाने के लिए उपयुक्त है जो डाटासेट में कहीं एक नई फसल बनाने के लिए अक्सर संभव हैआकार यदि संभव हो तो.

इस तकनीक को सबसे डेटासेट के लिए लागू किया जा सकता है लेकिन वर्तमान में, kICS विश्लेषण केवल एक औसत प्रसार गुणांक की गणना कर सकते हैं और विभिन्न प्रोटीन माइग्रेशन पैटर्न भेद या प्रक्षेप पथ उत्पन्न नहीं कर सकते. KICS का प्रयोग, प्रसार गुणांक आसानी से निकाला जा सकता है और एक प्रोटीन के प्रसार इलाज और गैर इलाज कोशिकाओं के बीच या एक जंगली प्रकार और परिवर्तन के उपचार के प्रसार में मतभेद प्रेरित अगर खोलेगा जो एक उत्परिवर्ती प्रोटीन, बीच और इसलिए उदाहरण के लिए तुलना की जा सकती संभावित प्रोटीन, प्रोटीन और / या प्रोटीन लिपिड बातचीत में. FRAP द्वारा मापा AQP2 के प्लाज्मा झिल्ली प्रसार, ईआर में, इसके अलावा अलग ढंग से wildtype AQP2 9 से दूर तक फैला हुआ वृक्कजनक बहुमूत्र के कारण AQP2 की एक उत्परिवर्तित संस्करण, forskolin, एक शिविर एगोनिस्ट 10 के अलावा पर ​​कमी, और दिखाया गया था.

यह एक कण डी से प्रसार गुणांक की गणना करना संभव हैअता मतलब चुकता विस्थापन, कदम आकार विश्लेषण या कण छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी 2,11,12 का उपयोग कर, इन विश्लेषण के तरीकों computationally मांग की जा सकती है और अक्सर कस्टम कंप्यूटर एल्गोरिदम लिखा आवश्यकता होती है. यहाँ प्रस्तुत kICS प्रोटोकॉल का लाभ यह लेबलिंग घनत्व की अपेक्षाकृत स्वतंत्र और computationally आसान है. KICS विश्लेषण के माध्यम से इस चलना इस तरह आसानी से ब्याज की उनके झिल्ली प्रोटीन के लिए इसे लागू कर सकते हैं जो कई सेल जीव के लिए उपयोगी हो जाएगा.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम LNN तक एक लंडबेक जूनियर ग्रुप लीडर फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया. PWW प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC से अनुदान धन समर्थन मानता है. हम भी डिस्क माइक्रोस्कोपी कताई के लिए उपयोग के लिए दक्षिणी डेनमार्क विश्वविद्यालय में डेनिश आण्विक Bioimaging केंद्र धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 31600-083
FBS Invitrogen 10082147
Penicilin   Sigma 13752
Kanamycin Gibco 15160070
Streptomycin Gibco 11860038
Phenol red free medium Gibco 11880-028
DMSO Sigma D8418
HEPES Gibco 15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope Nikon Ti Eclipse
EMCCD Camera Andor Ixon+

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References

  1. Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
  2. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
  3. Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
  4. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
  5. Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
  6. Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
  8. Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
  9. Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
  10. Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
  11. Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
  12. Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
  13. Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
कश्मीर अंतरिक्ष छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग EGFP टैग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन का प्रसार गुणांक की आसान माप
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Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).More

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).

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