Summary
本論文では、生きた哺乳動物細胞内で蛍光標識した細胞膜タンパク質の拡散係数を測定するための変動解析手法のk空間画像相関分光法（KICS）のステップバイステップガイドを提供しています。
Abstract
横方向の拡散および原形質膜タンパク質の区画化は、細胞内で緊密に調節され、従って、これらのプロセスを研究することは、原形質膜タンパク質の機能および調節への新しい洞察を明らかにする。最近ではk空間イメージ相関分光法（KICS）1は、プローブ光物理学によって導入系統的な偏りを回避し、蛍光タグ付き原形質膜タンパク質の画像から直接拡散係数のルーチン測定を可能にするために開発された。分析のための理論的基礎は複雑であるが、この方法は、タンパク質の拡散係数を測定するために自由に利用可能なコードを用いてnonexpertsによって実現することができる。 KICSは逆数（のk）空間に、各画像をフーリエ変換した後に蛍光顕微鏡画像スタックから時間相関関数を計算する。続いて、平均円形、自然対数変換及び線形相関関数にフィットする拡散係数が得られる。この論文は、KICS介して画像解析し、拡散係数の測定にステップバイステップのガイドを提供しています。
まず、蛍光標識された原形質膜タンパク質の高フレームレート画像シーケンスは、蛍光顕微鏡を用いて取得される。次いで、関心領域（ROI）、細胞内小器官を避け小胞の移動やメンブレン領域の突出が選択される。 ROIのスタックは、自由に利用可能なコードにインポートされ、いくつかの定義されたパラメータ（方法の項を参照）がKICS解析のために設定されている。次に、プログラムは、k空間時間相関関数からのプロット "斜面の傾き」を生成し、拡散係数はプロットの勾配から計算される。以下腎水路アクアポリン3標準的な例として、EGFPでタグを用いて、膜タンパク質の拡散係数を測定するためのステップバイステップKICS手順である。
Introduction
原形質膜タンパク質の4次元空間時間的組織及び横移動度が厳密に調節され、タンパク質の機能、活性およびタンパク質 - タンパク質相互作用において役割を果たし得る。原形質膜タンパク質の側方拡散は、伝統的に、量子ドットのタイムラプス撮影から単一の粒子のための拡散係数を計算するか、標識された細胞膜タンパク質2-4を染色することによって研究されている。このアプローチは、タンパク質の折り畳みおよび機能が損なわれる可能性があり、したがって、いくつかのタンパク質のために達成することができない量子ドットまたは染料標識のための原形質膜タンパク質、細胞外のタグの挿入を必要とする。量子ドットの立体容積が5タンパク質の拡散を遅くすることが示されており、また、集団内のタンパク質の小さな部分だけが量子ドットで標識され、そしてこの画分は合計で表す場合、それは知られていない原形質膜タンパク質のプール。単一粒子TRAcking量子ドット標識されたタンパク質の画像シリーズからの拡散係数の（SPT）の測定は、大規模な解析アルゴリズムに続く2次元ガウスフィットの粒子の画像化されたピーク位置をマッピングが含まれます。分析は、顕微鏡点広がり関数（典型的には2次元空間ガウシアン）と記述する粒子軌道にパーティクル位置のその後の架橋の近似値に経時系列の画像フレームごとに大規模な非線形曲線フィッティングを必要とする、計算上非常に集約的である単一分子6,7の動き。
最近開発された画像相関法はk空間イメージ相関分光法（KICS）は、蛍光原形質膜タンパク質をタグ化拡散係数の相対的な単純な測定を可能にする。日常的にKICSによって蛍光タンパク質で標識された膜タンパク質の拡散係数を計算する可能性が成立するユニークなツールである従来の量子井戸に比べていくつかの利点がSPT分析ドット：細胞外標識を消費し、細胞外のタグと時間の無挿入が必要とされない（蛍光タンパク質を発現する細胞株が使用されてもよい）;拡散係数は、量子ドットで標識されたサブセットと比較して、蛍光タンパク質のプール全体から抽出され;分析は、単一のタンパク質を追跡する必要なく、簡単であり、分析は、追加のユーザプログラミングのための要件なしで既存のコードを使用して行うことができる。これは拡散係数の高速計算及び計算を可能に平均化技術であるため、この方法は迅速である。タンパク質の人口のためにこれらの急速な普及の測定は、骨の折れるSPT法による人口のサブセットに対して得、より詳細な分子の輸送情報を補完します。
KICS時間は、第1のフーリエ空間に変換されている蛍光顕微鏡画像シーケンスを相関し、それによってオンスを分離する分子輸送1によるものと光物理のためuorescence変動。その結果、KICSは数密度、流速、および複雑な光退色によって、公正なあるかまたはフルオロフォアの点滅しながら、蛍光標識された分子の拡散を決定することができる。これは、KICSすばやくカスタム書き込みアルゴリズムの必要なしに蛍光標識された細胞膜タンパク質の拡散動力学を決定するための有用なツールとなる。他に蛍光標識されたタンパク質は、KICSはまた、量子ドットで標識された膜タンパク質8に適用することができる。
本稿では、コードとどのように生成されたプロットを、評価するための使用方法を、作物を配置する方法を示すことにより、EGFPタグ化細胞膜タンパク質の拡散係数を抽出するためにKICSを使用する方法のステップバイステップの概要を説明した拡散から係数が抽出される。一例として、半全反射顕微鏡において、ディスクセットを紡糸して得られたデータは、蛍光を発するEGFPでタグ付けされた腎臓の水チャネルタンパク質アクアポリン3（AQP3）のNCE（TIRF）モードでは、提示されている。
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Protocol
KICS分析のための原形質膜におけるEGFPタグ化タンパク質の獲得は、落射蛍光顕微鏡、TIRFセットアップまたは目的の膜の画像を取得するように設定スピニングディスク顕微鏡で行うことができる。カメラの画素サイズ、並びに画像フレーム間の時間は、分析のために必要とされる。 4-30 60Hzのフレームレートで100-1,200フレームの画像シーケンスを分析のために使用することができる。取得の間、撮像期間を通して焦点で膜を維持し、蛍光が均一に分布された平膜の画分に集中することが重要である。小胞の移動、突出膜領域および細胞小器官は、後の分析の過程で行うトリミングすることができます。セルのドリフトや動きがないように、収集時間が選択されるべきである。
MATLAB用KICSコードスクリプトを取得するには、ポール·ワイズマンにお問い合わせください（Paul.Wiseman @ McGill.ca）。 KICSコードが初めて使用されるとき、オープンMATラボと、ファイルをクリックし、設定されたパスは、サブフォルダで[追加]をクリックし、KICSコードが置かれているコンピュータ上のフォルダを探します。その後、[OK]をクリックし、保存して閉じ。今、次のポイントで説明する作物の分析に進みます。
1。TIFFスタックとしてイメージング解析プログラムに目的のイメージシーケンスをインポート
stack1.tif：名前でファイルを保存します。
- 移動細胞小器官を除いた、膜領域を突出膜の平坦部に関心領域（ROI）の矩形領域を選択します。十分な統計が良好なk 2をプロットするために生成されるようにトリミングサイズが選択される。
- 地域をクロップして、適切なフォルダにTIFFファイルとして作物を保存します。同じ映画からいくつかの作物がある場合は、 例えば 、「stack1crop.tif "、" stack1crop2.tif "、" stack1crop3.tifを「数の増分を使用しています。
- ローカルで作物を含むフォルダを配置コンピュータ上ではなくサーバー上で、KICS分析をしている間。
2。分析を実行する一つ解析ソフトウェアの一つに作物をインポート
- コマンドウィンドウでMATLABやタイプ "icsgui」を開いて、ENTERを押します。 ICS GUIは、画像相関分光法グラフィカル·ユーザー·インターフェース·プログラムのための実行可能ファイルの名前である。
- ICSのGUIで「KICS」タブをクリックします。分析ウィンドウのスクリーンショットを図1に示す。
- フォルダ名「MATLABコード」とフォルダを検索し、ファイル名のファイルまでスクロールし、「スクリプト」とダブルクリックして、これを開きます。または、ファイルを右クリックし、 "MATLABで開く"やファイルへ移動、MATLABでのオープンとスクリプトファイルを開く]を選択します。このファイルは、エディタと呼ばれています。
- エディタのスクロールの「ロードKICSデータセット」と、それから始まるコマンドラインにファイル名とフォルダの場所をコピーまたは入力してIMG = 例えば "：ユーザードキュメント AQP3dynamics stack1crop.tif C」と。 例えば、[1:500] -フォルダの場所を以下のコマンドラインでは、分析されるフレーム数を設定します。データ系列内のすべての連続した映画のために同じ設定を使用します。後のフレームの焦点ドリフトが存在する場合、これらは分析から除外されるべきである。
- エディタで「保存」してから「セルを評価する」をクリックします。データセットは、現在分析中にソフトウェアにロードされる。
- GUIのKICS分析]ウィンドウでは、解析のための設定を入力します。
- 「T細胞」のボックスをUnclick。
- 入力した時間数を分析することが遅れる。タイムラグ（τ）の数は、拡散プロットに影響しますし、拡散プロットが直線的になるように選択しなければならない。 25を入力して起動し、拡散プロットは線形であるところにまで減少。 τはKICS分析を比較し、時間差が時間bが-遅れ時間の数であるetween 1フレームと次。線形プロットを与える最小の値を選択する必要があります。線形適合が得られるように時間の最大数は、より高い値がライン嵌合できないデータを生成する選択し、選択されたラグ。
- 最大K 2の値を入力します（ 図1の円1を参照）、それは通常、20から50です。良好なk 2をプロットラインに沿って分布している多数のデータポイントが存在するプロットである。 70を入力し始めて、K 2と拡散プロットを評価し、データが直線のまわりのクラスタを指す最も低い値を選択した後に減少する。 kは2値はフーリエ空間における空間kベクトルの二乗の大きさである。
最初に、解析は最高の値が決定されるまで、データ系列のすべての連続した映画のために同じ設定を使用し、繰り返したが、常に選択した設定は、データへの良好なフィット感を与えていることを確認する必要があります。良いKを2プロットと線形拡散プロット。 - 「ストアの設定をして続行」をクリックします。
- すべてのグラフを表示するには「はい」ボタンをクリックします。
- 「ロード·イメージシリーズ」（ 図1の円2参照）をクリックして、「ワークスペース」をクリックしてください。
- 「imgSerCrop」を選択して、「ワークスペースからインポート」をクリックしてください。
- イメージング·システム収集の設定を入力します。ボックスに「画素サイズ」は、画像スタックが取得される撮像システムのための投影されたピクセルサイズを入力する。 AQP3-EGFPについては、0.111を用いた。ボックス」フレーム間の時間（秒）を入力 "は、0.1150はAQP3-EGFPのために使用した。
- 「関心領域を選択」をクリックし、「1」を入力し、[OK]をクリックし、「画像全体を使用する」。
- 「ドゥKICS分析」をクリックして、「不動のフィルタリング」を行うには、[はい]をクリックします。結果は画像として自動的に開きます。
- 設定ウィンドウを最小化し、セル情報WINDOを最小限に抑えるW、および光物理ウィンドウを最小化します。ダイナミクスウィンドウで、ダイナミクスのプロットは、データ点を相関させ、自由拡散を想定することができることを意味し、負の傾きを持つラインにデータの線形近似を示していることを確認します。特定のタイムラグのための拡散係数を記録し、2の設定を（それがフィットの標準偏差を注意することは必要ありません）K。 K 2のプロットのデータポイントは、遅れている所定の時間線の周りのクラスタ化されなければならない。
- チェックボックス "イメージとしてオープン数値を保存」、結果ファイルを保存する」イメージとしてオープン数値を保存」をクリックしてください。 Cの下に新しいフォルダに保存：ユーザードキュメントはAQP3diffusionを。 「明確な現在のデータを "クリックして次の作物の分析に進みます。
計算された拡散係数3。平均は、分析したデータの概要を把握するために計算されている
- SPREに各ROIから個々の拡散係数を入力してくださいadsheet（τに注意し、2の値をkとを確認してください）、以上のように作物の名前を使用します。
- 表計算プログラムを使用して、平均拡散係数と標準偏差を計算する。
- 5％の有意水準を使用して統計的差異を評価するために、コルモゴロフ - スミルノフ検定や学生のt検定を実行します。細胞（例えば、未処理対処理された）との間のQuantitaveの比較を行うことができる。
- それぞれの作物のための解析ソフトウェアによって生成され、各時間遅れのために、各条件についてのデータを平均化した拡散プロットのスプレッドシートのバージョンを開く。論文やプレゼンテーションで提示するための新たな平均を拡散プロットを生成します。
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Representative Results
KICSと、分析されるべき適切な画像スタックを取得するために、異なる顕微鏡システムを使用することができる。なお、落射蛍光顕微鏡ならびにTIRFまたはスピニングディスクセットアップから画像シーケンスを分析することが可能である。膜は、任意の大規模な移動、細胞小器官なしで、または小胞/オブジェクトを移動平面である必要があります。本稿では、9.2ヘルツのフレームレートで原形質膜に設定し、フォーカスしてスピニングディスク顕微鏡上に結像生MDCK細胞におけるEGFPでタグAQP3のタイムラプス画像シーケンスを提示する。焦点は、基礎（下部）原形質膜に設定した。データは、最近になって、AJPセル13に掲載されました。
図2Aは、細胞の画像を示す。スケールバーは10ミリメートルであり、この例のROI作物は四角形で強調表示されます。作物の選択のために、膜は均一で平坦なため、唯一の二次元拡散を可視化であるセルの周辺にトリミングすることが重要である。セルLの細胞小器官、小胞、膜突起が回避されるべきであり、それはドリフトが時間経過の間に存在しないと分析のために重要である。分析から除外される作物の例は、 図2Bおよび2Cに示されている。移動小胞は、相関（ 図2B）、この場合には（ 図2C）、明らかに分析に含まれるべきではない少し動く膜の穴に貢献しています。これは、ROIの収穫が（高NA対物レンズを備えたイメージングのために32ピクセルの最小線径が合理的な指針である）分析のための十分な空間サンプリングを有するのに十分な大きさであることも重要である。このデータセットのための60X（NA 1.40）を用いた。
図3Aは、KICSで生成されたもの作物の拡散プロットを示す。この方法は、EGFP（または他の蛍光タンパク質）でタグ付けされたタンパク質の拡散係数を見つけるために使用することができ、色素または量子ドット。拡散プロットにおける曲線の傾きは、単に拡散係数のネガである。この場合、AQP3-GFPの拡散係数は0.0104±0.0040ミクロン2 / sであった。 図3（b）は、あまりにも多くの時間を用いて計算拡散プロットは、この場合、分析が再実行されましたが、より少ない時間となるように拡散プロットより遅れ、遅れている線形である。
図4Aは 、典型的なK 2プロットを示す。これにより、選択した時間遅れのために、半径方向に平均し、LNは、変換相関曲線である。勾配は、時間遅れに対してプロットされ、 図3（a）に示すように、結果は、拡散プロットである。これらのk 2のプロットからk 2がプロットを検査する場合には、フィット感が評価されることが重要である。 図4Bは、それが作物が小さすぎると結論付けることができ、それが必要ように分析できなかったために2のkプロットの一例であるノイズフロアに直線的に負の傾斜と崩壊している。 図4Cは、フィットのように減少した最大のK 2値で再分析する必要があるAK 2プロットの例である、より大きなKで増加した残差で判定して（もはや良いです2値）。この場合、分析は、この場合25で、低い最大のK 2値を入力することを再度実行する必要があります。
図5に、10の作物で平均し、平均化拡散プロットを示す。拡散プロット分析からExcelファイルで発見された、すべての拡散のプロットは現在、同じ実験から、すべての作物のために平均化することができる。得られた拡散プロットにおいてセルの異なる治療は、同図に組み合わせることができる。並列トレンドラインは、等しい拡散係数であり、非並列のトレンドラインが不均等な拡散を示す。この図において、AQP3-EGFP拡散係数は、（AJPセル13からのデータ）を算出する。
図1。KICS分析ウィンドウのスクリーンショット。このウィンドウでKICS分析が行われます。円は、プロトコルの個々のステップのために押しするボタンを示しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。安定的に示すAQP3-GFPおよび代表作物を表現するMDCK細胞のGFPを発現する細胞のディスクイメージをスピニング。（A）の代表画像。基底画像は、原形質膜の近くに焦点を当てたスピニングディスク顕微鏡で取得される。 （B）Repres拡散係数に貢献することができる移動小胞がありますのでKICSにおける分析から除外されたentative作物、。 （C）膜に穴があるとした作物の一例は、従って、この作物は、分析から除外した。すべてのスケールバーは10μmである。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。拡散プロット。（a）すべての点は、ラインフィットに近いれる代表的な拡散プロット。データは線形であるので、これは良好な拡散プロットである。 （B）分析はtimelagsより少ない数を使用して再実行する必要のある拡散プロットの例。 3highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4のk 2プロットの例（A）のデータポイントが等間隔直線フィットの両側に分布する良好なk 2はプロットの例。 （B）は 、最適なサイズよりも小さい作物のためのAK 2プロットの例。このk 2はプロットにおいて、直線フィットの傾きは、負でなければならないので、作物を分析から除外され、正である。 （C）このk 2がプロットは、分析がk 2プロットの一部を選択するために、低い最大値とk 2がやり直さなければならないことを示すデータを均等にフィットラインの両側に分布していた。oad/51074/51074fig4highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図5。拡散プロットを平均した。Anは10以上の作物を平均した拡散プロットを平均した。
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Discussion
本論文では、蛍光タンパク質で標識されたタンパク質の顕微鏡画像から拡散係数を決定するために、KICS解析法を適用する方法の詳細なステップバイステップの概要を発表した。分析は、標識密度の非常に広いダイナミックレンジを有するプローブの選択とは無関係であり、従って、量子ドットならびにEGFPのような色素および蛍光タンパク質で標識されたタンパク質に適用することができる。
タンパク質の有効拡散係数を計算するために、最適化されたいくつかの重要な段階が存在する。それだけで、膜上の画像標識されたタンパク質に不可欠です。分析されるべき画像シーケンス内小胞または細胞小器官を移動させるような追加のオブジェクトがある場合、これらは、拡散係数の過小または過大評価をもたらすで計算された拡散係数に寄与する。
上記の手順に続いて、KICSのGUIコードは、ユーザーフレンドリーなAですND分析が迅速である。拡散係数の平均値と統計的に有意な値の迅速な生成を容易にする遅れ時間の関数としての平均円形と斜面拡散プロットの傾きの計算の両方を含む：これは、いくつかの平均化のステップを含む。したがって、SPT実験からKICSの拡散係数を計算するために必要な大規模な分析と比較して、ユーザフレンドリー、迅速であり、生物物理学の専門訓練を行うことができる。
負の拡散係数や水平拡散プロットの解析結果場合は、トラブルシューティングは、ここで説明するすべての要件を満たしているかどうかを確認するために作物の目視検査が含まれています。小さすぎて作物が非物理的負の拡散係数を得ることができ、廃棄しなければならない。拡散係数を算出するためには、分析のために適切であるか、単に作物を増加データセット内の他の場所に新しい作物を作ることがしばしば可能であるサイズ可能な場合。
この技術は、ほとんどのデータセットに適用することができるが、現在、KICS分析は、平均拡散係数を算出することができ、異なるタンパク質の移動パターンを識別または軌道を生成することができない。 KICSを用いて、拡散係数を容易に抽出することができるタンパク質の拡散処理し、非処理細胞との間または野生型及び突然変異の治療拡散の違いを誘発する場合明らかにする変異タンパク質との間の、したがって、例えば、比較することができる潜在的なタンパク質 - タンパク質および/またはタンパク質 - 脂質相互作用である。 FRAPにより測定されAQP2の細胞膜の拡散は、ERにおいて、また違った野生型AQP2 9より拡散した腎性尿崩症の原因とAQP2の変異したバージョンを、フォルスコリン、キャンプアゴニスト10を添加すると低下し、ことが示された。
それは単一粒子dから拡散係数を算出することは可能であるがアタ平均二乗変位、ステップサイズ分析または粒子画像相関分光法2,11,12を用い、これらの解析方法は、計算要求し、しばしばカスタム書かれたコンピュータアルゴリズムを必要とすることができる。ここに提示KICSプロトコルの利点は、標識密度の比較的独立しており、計算が容易であることである。 KICS分析を通じて、この散歩は、このように簡単に興味のある膜タンパク質に適用することができ、多くの細胞生物学者のために有用であろう。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、LNNにルンドベックジュニアグループリーダーフェローシップによってサポートされていました。 PWWは自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）からの助成金のサポートを認めるものです。また、ディスク顕微鏡を回転へのアクセスのために、南デンマーク大学のデンマークの分子バイオイメージングセンターに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 31600-083 | |
| FBS | Invitrogen | 10082147 | |
| Penicilin | Sigma | 13752 | |
| Kanamycin | Gibco | 15160070 | |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | |
| Phenol red free medium | Gibco | 11880-028 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Apparatus | |||
| Spinning Disk Microscope | Nikon | Ti Eclipse | |
| EMCCD Camera | Andor | Ixon+ |
References
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