Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Аплизия Ганглия Подготовка к электрофизиологическому и молекулярному анализу отдельных нейронов

Published: January 13, 2014 doi: 10.3791/51075
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

Summary

Морская улитка Aplysia californica широко используется в качестве нейробиологической модели для исследований клеточной и молекулярной основы поведения. Здесь описана методология изучения нервной системы Аплизии для электрофизиологического и молекулярного анализа отдельных нейронов идентифицированных нейронных схем.

Abstract

Основная проблема в нейробиологии заключается в том, чтобы понять молекулярные основы нейронной схемы, которые регулируют конкретное поведение. После того, как конкретные молекулярные механизмы определены, новые терапевтические стратегии могут быть разработаны для лечения аномалий в конкретном поведении, вызванном дегенеративными заболеваниями или старением нервной системы. Морская улитка Aplysia californica хорошо подходит для исследования клеточной и молекулярной основы поведения, потому что нейронные схемы, лежащие в основе конкретного поведения, могут быть легко определены и отдельные компоненты схемы могут быть легко манипулировать. Эти преимущества Aplysia привели к нескольким фундаментальным открытиям нейробиологии обучения и памяти. Здесь мы описываем подготовку нервной системы Аплизии к электрофизиологическому и молекулярному анализу отдельных нейронов. Короче говоря, ганглия, вскрытая из нервной системы подвергается протеазы, чтобы удалить оболочку ганглия так, что нейроны подвергаются, но сохранить нейронной активности, как в нетронутыми животных. Этот препарат используется для проведения электрофизиологических измерений одного или нескольких нейронов. Важно отметить, что после записи с использованием простой методологии, нейроны могут быть изолированы непосредственно от ганглиев для анализа экспрессии генов. Эти протоколы были использованы для проведения одновременных электрофизиологических записей из L7 и R15 нейронов, изучить их реакцию на ацетилхолин и количественное выражение гена CREB1 в изолированных одного L7, L11, R15, и R2 нейронов Аплизии.

Introduction

Человеческий мозг чрезвычайно сложен с почти 100 миллиардами нейронов и триллионами синаптических связей. Есть почти равное количество ненейрональных клеток, которые взаимодействуют с нейронами и регулируют их функции в головном мозге. Нейроны организованы в схемы, которые регулируют конкретное поведение. Несмотря на достижения в нашем понимании функций мозга и нейронных цепей, мало что известно о идентичности компонентов схемы, которые контролируют конкретное поведение. Знание идентичности различных компонентов схемы значительно облегчит наше понимание как клеточной, так и молекулярной основы поведения и помощь в разработке новых терапевтических стратегий для нейропсихиатрических расстройств.

Морская улитка Aplysia californica была рабочей лошадкой для определения нейронных цепей, лежащих в основеспецифического поведения 1-14. Нервная система Аплизии содержит около 20000 нейронов, которые организованы в 9 различных ганглиев. Нейроны Аплизии являются большими и могут быть легко идентифицированы на основе их размера, электрических свойств и положения в ганглиев. Аплизия имеет богатый репертуар поведения, которые могут быть изучены. Одним из хорошо изученных поведения является жаберный рефлекс вывода (GWR). Центральные компоненты этого рефлекса расположены в брюшной ганглии. Были составлены карты компонентов схемы GWR и определены вклады различных компонентов. Важно отметить, что GWR схемы проходит ассоциативное и неассоциативноеобучение 5,6,15-19. Десятилетия исследования этого рефлекса также определили несколько сигнальных путей, которые играют ключевую роль в обучении ипамяти 20-24.

Несколько различных препаратов Аплизии были использованы для изучения клеточной и молекулярной основы хранения памяти. К ним относятсянетронутые животные 2,3, полутронутыеподготовки 1,7,13,14,16 и восстановление основных компонентов нейроннойсхемы 25-29. Здесь описана уменьшенная подготовка к изучению аплизийных ганглиев для электрофизиологического и молекулярного анализа выявленных нейронных цепей. Были изучены следующие четыре идентифицированных нейрона. R15, разрыв нейрона, L7 и L11, два различных моторных нейронов и R2, холинергический нейрон были изучены. R2 является крупнейшим нейроном, описанным в нервной системе беспозвоночных. Короче говоря, эта методология включает в себя протеазное лечение ганглиев, электрофизиологические измерения до и после фармакологического лечения, а также изоляцию отдельных нейронов для количественного анализа экспрессии генов. Эта методология позволяет нам сочетать молекулярный анализ с одновременной записью с нескольких нейронов. Эта методология была успешно использована для изучения реакций R15 и L7 нейронов на ацетилхолин (Ach) с помощью парных внутриклеточных записей. После электрофизиологических измерений R15 и L7 и других выявленных нейронов, таких как L11 и R2 были выделены для количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) анализ экспрессии CREB1, транскрипционный фактор, важный для хранения памяти.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка брюшной Ганглии, Электрофизиологические измерения, и изоляция отдельных выявленных нейронов из брюшной Ganglion аплизии californica

  1. Поддерживайте аплизию в лабораторном аквариуме с циркулирующей искусственной морской водой (ASW) при 16 градусах по Цельсию при 12:12 свет: темные условия.
  2. Изоляция брюшного ганглиона.
    1. Обезболивать животных путем введения 380 мМм MgCl2 раствор в течение 5-10 мин (эквивалент 30-35% массы тела животного).
    2. Определите брюшной ганглий на основе его положения в центральной нервнойсистеме 24,28.
    3. Удалите ганглии хирургическим путем и немедленно храните в искусственной морской воде, состоящей из 450 мМ НаКл, 10 мМ ККл, 10 мм CaCl2, 55 мм MgCl2, 2,5 мМ НаХКО3и 10 мМ HEPES (pH 7.4).
  3. Протеазное лечение.
    1. Инкубировать брюшной ганглион в течение 30 мин при 34 градусов по Цельсию±0,5 в чашке Петри с 0,1% протеазы (диспазы), разбавленной в ASW описано выше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество протеазы используется должна быть стандартизирована с возрастом и весом животных. В общем, более старые и большие животные потребуют больше protease.
  4. Удаление ганглиев оболочки.
    1. После ферментной обработки, прикрепите ганглии к силиконовому основанию силикона Сильгарда в клеточной камере (1 см; vol. 0,3 мл) и пронизать ASW (скорость потока: 150 л/мин) при комнатной температуре (18 градусов по Цельсию±2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы увеличить видимость идентифицированных нейронов, поместите ганглия на верхней части поликарбоната стеклянный цилиндр (Рисунок 1) (диаметр 2 мм модифицированной камеры клеток), которые могут быть легко освещены снизу с помощью бинокулярного стереомикроскопа с 20X и 40X увеличение.
    2. Аккуратно удалите оболочку из ганглия с помощью типсов и микросхем.
  5. Одновременное электрофизиологическое запись с двух нейронов.
    1. Определите нейрон, представляющий интерес.
    2. Пронзить нейрон с одной внутриклеточной резкой микроэлектрода с сопротивлением 10-15 МЗ заполнены 3 M KCl раствор.
    3. Запись нейронной активности (10 кГц полоса пройти) с помощью внутриклеточной системы записи.
    4. Обработать данные записи с помощью электрофизиологического программного обеспечения, такого как Axograph.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно легко осуществлять запись из нескольких нейронов. Нейроны L7, L11 или R15 и R2 легко идентифицируются в зависимости от их положения. Для одновременной записи двух нейронов L7 и R15 (рисунок 2) требуются два усилителя идва микроманипулятора.
  6. Применение наркотиков.
    1. Применение препарата выбора в клеточной камере нежный пипетки или вводить непосредственно в нейроны.
    2. Проведение электрофизиологических измерений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальной цели, можно измерить различные электрофизиологические параметры нейронов, такие как изменения в мембранном потенциале (MP) или потенциал действия (AP) до, во время и после применения препарата.
  7. Изоляция одиночных нейронов.
    1. По завершении электрофизиологических экспериментов, остановить перфузии ASW и мыть ганглия со 100% этанола.  Воздействие этанола будет окаменеть нейроны и, используя тонкие типсы, сделать его легко удалить отдельные нейроны, не повреждая другие нейроны из ганглия.
    2. Удалите одиночные нейроны под стереомикроскопом и перенесите в небольшую трубку Эппендорфа, содержащую ледяной реагент для извлечения РНК 500 мкл. Изолированные одиночные нейроны могут храниться в реагенте экстракции РНК при -80 градусов по Цельсию для будущего анализа.

2. Изоляция РНК от одиночных нейронов и анализ экспрессии генов по количественным ПЦР в реальном времени (qPCR)

  1. Меры предосторожности для минимизации деградации РНК:
    Рибонуклеи (RNases) ухудшают РНК и являются очень стабильными и активными ферментами. Сделай следующие шаги во время обработки РНК.
    1. Очистите рабочую зону и инструменты с помощью деактивающих агентов RNase.
    2. Носите перчатки во все времена при обработке РНК и часто менять перчатки.
    3. Используйте только RNase бесплатно пластмассы для обработки РНК.
  2. Изолировать полную РНК от одиночных нейронов:
    1. Стандартный протокол Тризола для изоляции РНК может быть использован для изоляции РНК от отдельных нейронов. Кратко добавьте 20% v/v хлороформа в Тризол, хорошо перемешайте путем краткого вихря.
    2. Поместите трубки на ротатор в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Спин тризол-хлороформ смесь при 12000 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию.
    3. Соберите aqueous фазы и передачи в свежую трубку.
    4. Добавьте раствор ацетата натрия (рН 5,5) к окончательной концентрации 0,3 М, 100 нг/мл совокупляемого глико-голубого и 2,5 тома 100% этанола для осаждения РНК.
    5. Смешайте образцы хорошо и инкубировать при -80 градусов по Цельсию на ночь.
    6. Спин образцов на 12000 х г в течение 20 мин при 4 градусов по Цельсию и небольшой синий гранулы будут видны в нижней части трубки.
    7. Удалить супернатант и мыть гранулы с 850 мл 75% ледяного этанола при 12000 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию.
    8. Удалите супернатант тщательно и высушите гранулы РНК в течение 7-10 минут, максимум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что РНК не осталось долго, чтобывысохнуть, как более- сушки РНК гранулы делает solubilization очень трудно.
    9. После того, как сушеные, повторно гранулы РНК в 10 мкл рнк свободной воды и определить концентрацию РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите концентрацию РНК с помощью спектрофотометра. При не использовании сразу же, хранить РНК при -80 градусов по Цельсию.
  3. синтез аРНК из отдельных нейронов:
    1. Усиление РНК (один или два раунда в зависимости от экспериментальной цели) с использованием коммерчески доступной линейной системы усиления РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общая РНК от одиночных нейронов колебалась от 10-60 нг. Ожидаемая доходность первого раунда усиления составляет 100-300 нг, а второй раунд усиления составляет 0,8-1,5 мкг РНК.
  4. Обратная транскрипция РНК:
    1. Для генерации кДНА из РНК используйте 1,0 мкг РНК в 20 мкл реакции обратной транскрипции. Для этой цели имеется несколько комплектов.

      ПРИМЕЧАНИЕ: cDNA синтезировался в соответствии с протоколом производителя, используя следующие настройки на тепловом циклере.
      5 мин при 25 градусов по Цельсию
      30 мин при 42 градусов по Цельсию
      5 мин при 85 градусов по Цельсию
      Держите при 4 градусах по Цельсию
    2. После обратного шага транскрипции храните cDNA при -20 градусах по Цельсию для длительного хранения.
  5. Проектирование и стандартизация грунта:
    Несколько отличных программ доступны, бесплатно, для проектирования грунтовки для усиления в режиме реального времени.
    1. Выберите 18-24 мер олигонуклеотиды, которые производят 70-110 bp ампликонов и синтезировать грунтовки с использованием коммерческих источников.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Две-три грунтово представляющие интерес пары должны быть разработаны для каждого гена, представляющих интерес. Каждый набор грунтовок должен быть стандартизирован qPCR. Пары вперед и обратной грунтовых, которые были использованы для гена CREB1 (Рисунок 4) приведены ниже:

      Праймер набор 1
      Нападающий: 5'-TGATTCTGACGCAAAAAGA-3'
      Обратный: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      Праймер набор 2
      Нападающий: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Обратный: 5'-ГААКАГАГААГТАТГЧАА-3'
    2. Чтобы выбрать лучший грунтовка, который будет использоваться для анализа ниже по течению, контролировать значение Ct и форму кривой усиления в qPCR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры, которые дают Значения Ct (Порог цикла) между 10-35 в 40 круглых усиления и гладких кривых во время экспоненциальной фазы ПЦР с последующим гладким плато являются оптимальными для анализа экспрессии генов.
  6. Количественный ПЦР в реальном времени (qPCR):
    Примечание: Используйте соответствующие трубки или пластины, совместимые с машиной qPCR.
    1. Разбавить cDNA до 5x с нуклеазой свободной воды.
    2. К 2 мкл разбавленной кДНА добавьте 8 мкл мастер-микса qPCR, содержащего 2 мкл H2O, 5 мкл 2x SYBR Green master mix и 1,0 мкл 10 МКМ (каждый) вперед и наоборот грунтовки.
    3. Закройте трубки и загерметив пластину после пипетки cDNA и мастер смеси. Смешайте содержимое, нежно нажав и спиннинг вниз на 1500 об / мин в течение 30 сек.
    4. Приступайте к настройке машины qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Вес животных, которые были использованы в этом исследовании варьировались от 100-200 г. Следуя описанным протоколам, мы провели электрофизиологические измерения и молекулярный анализ нейронов брюшных ганглиев, изолированных от животных, от 2-5 г до 200-300 г.

Стандартизация лечения протеазы важна для успешных электрофизиологических измерений нейронов в ганглиях. Первоначально, несколько протеазы (Dispase) концентрации и продолжительности были использованы и разрыва потенциалов действия от R15 нейронабыли записаны 26,31. Эти измерения были сравнены с прямой (без лечения протеазы) записи из нетронутыми ганглиев. Концентрация протеазы (0,1% протеазы, см. шаг 1.3), которая производила взрывные потенциалы, которые были сопоставимы с теми, которые были получены от открытого ганглия без протеазы, были использованы в последующих экспериментах.

Используя описанный протокол, потенциал действия (AP) в ответ на воздействие Ach на R15, холинергический нейрон и L7, моторный нейрон, который не реагирует на Ach были записаны. Как и ожидалось, одновременные электрофизиологические записи показывают, что вызывает деполяризацию в R15, в то время как не было никаких изменений в стрельбе L7. На рисунке 2 показано применение ацетилхолина (Ах) непосредственно в камеру клетки. 1 M Ach (объем 0,3 мкл) был непосредственно применен в камеру с помощью микропипетта для получения окончательной концентрации 1 мМ внутри камеры.

был смыт из ванны перфузией и снова записан из нейронов R15. На рисунке 3 показаны формы волн, предполагающие, что эффект Аха обратим. Показан анализ параметров AP в контроле, во время деполяризации и после мытья. При деполяризации амплитуда снижается, а продолжительность АП значительно увеличивается.

После электрофизиологических измерений нейроны R15 и L7 были изолированы, а РНК были подготовлены для анализа кЗРКР. Линейная РНК-полимераза T7, основанная на транскрипции с использованием комплекта усиления аРНК MessageAmp II от Ambion, использовалась для усиления РНК из одиночных нейронов. Для сравнения были изучены выявленные нейроны R2 и L11 и целые брюшные ганглии от взрослых (6-9 месяцев) и молодых животных (1-2 месяца). Усиление qPCR осуществлялось в системе PCR 7900HT Fast Real-Time при следующих условиях: 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем 40 циклов по 95 градусов по Цельсию в течение 15 сек, 60 градусов по Цельсию в течение 1 мин. В эксперименте было четыре биологических репликации. Каждая биологическая репликация имела четыре технических репликации в qPCR создана. Значения Ct из четырех репликаций были усредне взяты в среднем, и 1/Ct был рассчитан, чтобы найти абсолютный уровень экспрессии CREB1 в каждой выборке(рисунок 4). Оценка абсолютного уровня экспрессии гена CREB1 у молодых и взрослых aplysia ganglia, а также в четырех выявленных одиночных нейронов была проверена значением Ct, полученным из измерений qPCR.

Начальная концентрация мРНК была одинаковой как у молодых, так и у взрослых брюшных ганглиев. Один и тот же набор праймеров CREB1 использовался во всех кЗКР, как в исследованиях с использованием ганглиев, так и в одиночных нейронах. Значения Ct очень похожи между молодыми и взрослыми брюшным ганглием. Аналогичным образом, значения Ct были измерены в случае одиночных нейронов, где начальная общая концентрация мРНК была низкой, а два раунда усиления дали хорошее количество РНК для синтеза кДНК. Значения Ct усиления CREB1 показали, что выражение CREB1 в нейронах R15 и L7 сопоставимо, в то время как R2 и L11 показали значительные различия в выражении по сравнению с L7 или R15 (тест студента T, p<0.05)(рисунок 4).

Figure 1
Рисунок 1. Микроскоп стадии и перфузии системы для ганглиев электрофизиологии. Перфузионная система и сцена были сделаны с использованием плексигласа и прозрачны. Эта установка устанавливается на металлический блок (не показано) для удержания позиции. Металлический блок спроектирован таким образом, что образцы могут быть освещены снизу. Показан образец электрофизиологического разрыва, записанный из нейрона R15.

Figure 2
Рисунок 2. Одновременное запись с L7 и R15 нейрона брюшной ганглии. (A) Мультфильм брюшной ганглиев, показывающий положение L7 и R15 нейронов (изменен с Kandel 2001, перепечатан с разрешения AAAS). Также показаны позиции R2 и L11 в брюшной ганглии. (B)Представитель внутриклеточных записей от L7 и R15. Стрелка указывает время применения Ach. Можно было бы продолжить эти измерения в течение 8-10 часов.

Figure 3
Рисунок 3. Ах индуцированных изменений в потенциале действий (AP) R15. ФОРМы волн AP были проанализированы до, во время и после воздействия Ach. Показаны репрезентативные формы волн. мс: миллисекунда, мВ: милливольт.

Figure 4

Рисунок 4. qPCR анализ экспрессии CREB1 в брюшной ганглии и одиночных выявленных нейронов. (A) Абсолютная количественная оценка CREB1 стенограмма в молодых и взрослых брюшной ганглии Аплизии. Всего РНК была изолирована с использованием стандартного протокола Trizol, как описано в методах. 1 мкг от общей РНК был использован для синтеза cDNA, а затем в режиме реального времени ПЦР усиления с помощью CREB1 грунтовки. (B) Абсолютная количественная оценка стенограммы CREB1 в выявленных одиночных нейронах старой Аплизии. Всего РНК была подвергнута двум раундам усиления in vitro до синтеза кДНК. Для синтеза кДНА использовался 1 мкг аРН, за которым последовало усиление ПЦР в реальном времени с использованием праймеров CREB1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Нейрон R15 участвует в регулировании сердечно-сосудистой, пищеварительной, дыхательной и репродуктивной систем30. Регулярно ритмичная лопнухать активность AP является особенностью R15. Как показано в разделе результатов, парная запись R15 и L7 показывает, что подготовка ганглиев сохранила активность нейронов R15. Нейроны R15 и L7 соответствующим образом отреагировали на Ach. Этот препарат ганглиев может поддерживаться до 8-10 часов, и электрофизиологическая активность может постоянно контролироваться. Таким образом, можно было бы изучить электрофизиологические эффекты краткого воздействия нейромедиатора (подвергается локально конкретного нейрона или ванны) в течение длительного периода времени. Кроме того, можно было бы изучить последствия воздействия нескольких нейротрансмиттеров (одновременно или в тандеме) на тот же нейрон на стрельбе свойства себя или последователя нейрона или обоих.

Пример измерений экспрессии генов по qPCR показан на рисунке 4. Поскольку содержание РНК в одном нейроне низкое, усиление in vitro необходимо для получения достаточного количества РНК для количественной экспрессии нескольких генов. Коммерческие наборы доступны для процесса транскрипции in vitro. Усиление стенограммы CREB1 было количественно непосредственно по количеству циклов, необходимых для получения стандартизированного сигнала флуоресценции, Ct-метод31. Усиленная РНК из одного нейрона достаточна для исследований, чтобы определить изменения экспрессии генов в большом количестве генов с использованием микроаррея32 и для всего транскриптома RNAseq анализирует33.

Ограничением этого метода является то, что этот препарат не может сохранить все синаптические соединения нейронов брюшной ганглиев. Некоторые из нейронов образуют синапсы с нейронами в других ганглиев и в подготовке ганглиев эти междугородние соединения будут пропущены. Тем не менее, методология, описанная здесь, может быть легко изменена, чтобы включить весь ЦНС или может быть легко интегрирована в полутронутуюподготовку 13,14,16, которая была описана для изучения клеточных и электрофизиологических изменений в жаберном и сифонном рефлекс вывода.

Последние достижения в области методов геномики теперь позволяют нам получить глубокое представление о динамике выражения кодирования и некодирования РНК34. Описанный здесь препарат идеально подходит для изучения временных изменений экспрессии генов в сочетании с электрофизиологическими измерениями. Например, можно применить фармакологические агенты и измерить их влияние на электрические свойства отдельных нейронов или нескольких нейронов, которые являются частью одной и той же нейронной схемы и изолировать отдельные нейроны в разное время для изоляции РНК. Влияние манипуляций с одним нейроном (например, электрическая стимуляция или воздействие фармакологических агентов) на всю выявленную схему можно изучать на уровне изменений экспрессии конкретных генов в отдельных нейронах. Таким образом, эта методология способствует успешной интеграции электрофизиологических и геномных методологий для изучения нейронных схем в Аплизии.

Этот подход может быть легко распространен на изучение других беспозвоночных моделей, таких как nudibranch моллюск Тритония, пруд улитки Lymnaea, и наземные улитки Helix, чья нервная система содержит несколько выявленныхнейронов 35-57. Эти модели также широко используются для изучения нейронного контроля поведения, таких как побег плавание, магнитное поле ориентации, формирование синапса, обучение и хранение памяти. Описанная нами методология – это простая интеграция геномического анализа с физиологическими измерениями активности нейронов на уровне одной клетки. Более глубокое понимание молекулярной и физиологической основы нервного контроля поведения может быть получено из таких исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы искренне благодарим Фонд Уайтхолла за их поддержку финансирования и стартовые фонды из Научно-исследовательского института Скриппса для проведения этой работы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Tags

Нейробиология Выпуск 83 внутриклеточная запись идентифицированный нейрон нейронная схема экспрессия генов потенциал действия CREB Aplysia californica геномика
<em>Аплизия</em> Ганглия Подготовка к электрофизиологическому и молекулярному анализу отдельных нейронов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M.,… More

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter