Summary
Le onde d'urto al giorno d'oggi sono ben noti per i loro effetti rigenerativi. Pertanto esperimenti in vitro sono di crescente interesse. Abbiamo quindi sviluppato un modello in vitro per le prove d'urto in (IVSWT) che ci permette di simulare le condizioni in vivo evitando così effetti fisici distrazione.
Abstract
Le onde d'urto al giorno d'oggi sono ben noti per i loro effetti rigenerativi. I risultati di ricerca di base hanno dimostrato che le onde d'urto causano uno stimolo biologico per colpire le cellule o tessuti senza alcun danno ulteriore. Pertanto, esperimenti in vitro sono di crescente interesse. Sono stati descritti vari metodi di applicazione di onde d'urto in colture cellulari. In generale, tutti i modelli esistenti si concentrano su come applicare meglio le onde d'urto sulle cellule.
Tuttavia, questa domanda rimane: cosa succede alle onde dopo aver superato la coltura cellulare? La differenza di impedenza acustica del mezzo di coltura cellulare e l'aria ambiente è quello alto, che oltre il 99% delle onde d'urto vengono riflessi! Abbiamo quindi sviluppato un modello che consiste principalmente di un contenitore in plexiglas incorporato che permette alle onde di propagarsi in acqua dopo aver superato la coltura cellulare. Questo evita effetti di cavitazione e la riflessione delle onde che altrimenti disturbare quelli diffusioni. With questo modello siamo in grado di mimare le condizioni in vivo e quindi guadagnare di più e più conoscenze su come lo stimolo fisica delle onde d'urto si traduce in un segnale cellula biologica ("meccanotrasduzione").
Introduction
Le onde d'urto sono onde di pressione sonora derivanti da un improvviso rilascio di energia, ad es. come un tuono quando un fulmine. In medicina sono state utilizzate onde d'urto per oltre 30 anni nel litotripsia per la disintegrazione dei calcoli renali. Dal momento che l'accertamento incidentale della iliaca ispessimento dell'osso in pazienti Litotrissia nei primi anni 1980, sono stati condotti i primi studi per valutare l'effetto del trattamento ad onde d'urto (SWT) sulla guarigione ossea 1. Risultati impressionanti di una migliore guarigione delle pseudoartrosi delle ossa lunghe possono essere osservate 2. Successivamente, le indicazioni sono stati ampliati per le ferite dei tessuti molli 3. Risultati di base ricerca ha mostrato che le onde d'urto causano uno stimolo biologico al tessuto bersaglio senza alcun danno successiva. Rilascio di fattori di crescita angiogenici (ad esempio VEGF, PlGF, FGF) è seguita da una significativa angiogenesi. Ciò ha portato ad una ulteriore espansione delle indicazioni verso patologie ischemiche. Il nostro gruppo e altri hanno mostrato l'eff positivoect di SWT sulla cardiopatia ischemica in modelli animali e in studi clinici 4-6.
Tuttavia, il meccanismo esatto di come stimolo fisico del SWT si traduce in un segnale biologico (mechanotransduction) rimane in gran parte sconosciuta. Come l'interesse in SWT da diversi campi della medicina aumenta continuamente, la ricerca del meccanismo sta diventando sempre più intenso. Pertanto, gli esperimenti in vitro onda d'urto in stanno guadagnando importanza. Oltre alla riduzione degli esperimenti sugli animali e di costo-efficacia, il più grande vantaggio di vitro trattamento con onde d'urto in (IVSWT) potrebbe essere la possibilità di studiare il comportamento specifico di un certo tipo di cellula. In onda d'urto rigenerazione tissutale mediato probabilmente tutte le cellule del tessuto trattato sono coinvolti, anche effetti sistemici sono discussi. Tuttavia, ogni tipo di cellula svolge un ruolo specifico e ha una sua funzione intrinseca. IVSWT ci permette di rilevare questo particolare funzione di unnd così ci dà una migliore comprensione dei processi sottostanti complessi.
La conoscenza di oggi sugli effetti scossa di onda su colture cellulari include l'aumento della proliferazione, alterazione dei recettori di membrana delle cellule, aumento e l'accelerazione della differenziazione cellulare, il rilascio di fattori di crescita e chemio-attrattivi così come una maggiore migrazione cellulare 7-9.
Effetti fisici distrazione in più in modelli in vitro vari metodi di applicazione di onde d'urto in colture cellulari sono state descritte. Questo fatto porta al problema che è molto difficile confrontare i risultati, come condizioni fisiche di stimolazione cellulare sono molto diverse tra questi modelli. In generale, tutti i modelli esistenti si concentrano su come applicare meglio le onde d'urto sulle cellule.
Tuttavia, questa domanda rimane: cosa succede alle onde dopo aver superato la coltura cellulare? Il problema principale è che la differenza di acusticaimpedenza del mezzo di coltura cellulare e l'aria ambiente è quello alto, che oltre il 99% delle onde d'urto vengono riflessi Figura 1.
A causa della differenza di impedenza acustica dei due mezzi onde si riflettono non solo, ma un sfasamento di 180 ° si verifica conseguente forti forze di trazione alle cellule Figura 2.
Impedenza acustica è definito come il prodotto della densità di un materiale e la sua velocità del suono Z = ρ x c. Per l'acqua l'impedenza acustica è ZWater = 1.440.000 Ns / m 3, per l'aria è a soli 420 Ns / m 3. La grande differenza tra questi due valori si traduce in riflessione e sfasamento delle onde d'urto. Lo sfasamento trasforma un impulso di pressione positiva in un'onda di trazione.
Anche se questa forza di trazione non è dannoso per le cellule, che interferisce con l'idea di imitare in effetti dell'onda d'urto vivo in vitro. In vivo questiforze di trazione difficilmente si verificano a causa di strutture corporee di grandi dimensioni.
Inoltre, la parte posteriore in esecuzione onde possono anche disturbare quelli in arrivo. Ciò può causare interferenze. Sono noti due tipi di interferenze. Interferenza costruttiva significa che entrambe le onde sono aggiunti un conseguente ampiezza raddoppiata Figura 3. Interferenza distruttiva si verifica se le onde si incontrano diametralmente opposto. Essa provoca abolizione delle onde (Figura 3). Pertanto, IVSWT bisogno di un modello che permette onde d'urto per propagare dopo aver superato la coltura cellulare.
IVSWT bagnomaria
Considerazioni seguenti preoccupazioni sopra citati inducono a progettare un bagno d'acqua per evitare i problemi descritti Figura 4. Fondamentalmente, si compone di un plexiglas costruita contenitore con una membrana per collegare ogni tipo di applicatore onda d'urto. Per accoppiamento tra questa membrana e la trasmissione applicatore ultrasuoni gel deve essere utilizzato. Il bagno di acqua è piena di acqua degasata per evitare cavitazione che si verificherebbe se il gas è stato soluted all'interno dell'acqua. Un riscaldatore sul fondo con un sensore di temperatura collegato ad una unità di controllo permette di regolare la temperatura per imitazione di condizioni in vivo ed evitare colture cellulari per raffreddare durante la procedura. La temperatura può essere ritenuta stabile a 37 gradi centigradi come avviene in un incubatore. Un supporto per i campioni di cellule permette immergendo qualsiasi tipo di pallone di coltura o del tubo. In tal modo, il contenitore del campione deve essere completamente riempito con terreno di coltura, come bolle d'aria potrebbero bloccare le onde d'urto! Un assorbitore cuneiforme alla parete posteriore della vasca distrugge onde per non vengono riflessi e correte per evitare interferenze.
Un ulteriore vantaggio di altri modelli IVSWT è la possibilità di variare la distanza tra l'applicatore e le fiasche di coltura. Giudizio del nostro gruppo e altri che utilizzano questo modello s chiaramentecome che ogni tipo di cellula reagisce specificamente a diversi parametri di trattamento. Inoltre, definendo la distanza tra la fonte delle onde e il campione è fondamentale in quanto ci permette di gestire le cellule per essere in una posizione specifica in relazione alla messa a fuoco dell'applicatore onda d'urto.
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Protocol
Autorizzazione etica
Dopo aver ottenuto il consenso informato scritto dei pazienti, cordoni ombelicali sono stati ottenuti da taglio cesareo presso il Dipartimento di Ginecologia per l'isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC). Il permesso è stato dato dal comitato etico di Innsbruck Medical University (n. UN4435).
1. Preparare il bagno di acqua IVSWT
- Preparare 3,5 L di acqua di rubinetto in un apposito serbatoio. Acqua deve essere riscaldata a 37 ° C (vedi protocollo 6).
- Riempire l'acqua nel bagnomaria finché il livello dell'acqua è di circa 3 cm sotto il bordo. Mente a coprire completamente la membrana con acqua. Ciò richiederà circa il preparato 3,5 L.
- Collegare il sensore di temperatura per l'alimentazione.
- Inserire la sonda nel raccordo prevista sulla parete posteriore della vasca dell'acqua.
- Collegare riscaldamento all'alimentazione del sensore di temperatura. Non fare questo senzal'acqua nella vasca da bagno come il riscaldamento sarebbe sciogliere il plexiglas.
- Attendere che l'acqua ha raggiunto una temperatura stabile di 37 ° C. Mescolare l'acqua regolarmente con qualche tipo di bastone da garantire temperatura costante in tutto il bagnomaria.
2. Preparare Celle e Palloni Cultura
- Celle di semi per tutta la notte a densità desiderata in fiasche di coltura T25 o cultura le cellule nei palloni direttamente fino a quando non hanno raggiunto la confluenza desiderata.
- Prima dell'esperimento, allineare i palloni in verticale.
- Riempire i flaconi di coltura con terreno di coltura fino a quando proprio sotto il collo. Non riempire troppo medie nelle fiasche da medio a contatto al collo o il tappo di chiusura otterrebbe contaminati.
- Avvitare i flaconi con i tappi solidi senza filtri per prevenire la contaminazione da acqua. Presente che l'acqua nella vasca e bagno stesso non sono sterili.
- Sigillare i tappi con parafilm prima dell'inserimento nella vasca d'acqua. <li> Fix cultura palloni chiusi nel supporto fornito.
- Inserire il pallone fisso in bagno d'acqua. Assicurarsi che la metà del pallone di coltura cellulare è alla stessa altezza del centro della membrana dell'onda dell'applicatore shock. Una linea a lato della vasca guida.
3. Definire parametri di trattamento
- Definire la distanza tra la sorgente onde d'urto e campione. Identificare i parametri di trattamento perfetti conducendo l'esperimento pilota parametro constatazione come descritto nella Figura 6.
- Scegli i parametri di trattamento giusti (densità del flusso di energia, frequenza) sul dispositivo onde d'urto. Anche in questo caso, fare riferimento alla Figura 6.
4. Shock Wave Application
- Mettere quantità molto gel trasmissione ultrasuoni disponibile in commercio sull'onda applicatore urti e sulla membrana del bagnomaria. Questo per assicurare l'accoppiamento. Bolle d'aria o aria devono essere tra l'applicatore e la membrana comesarebbe assorbire onde d'urto.
- Collegare applicatore alla membrana e tenerlo stabile nel centro della membrana. Fate attenzione che sia allineato orizzontalmente.
- Assicurarsi che la posizione verticale corretta della sonda all'interno del bagno d'acqua è in linea con l'indicato contrassegno sul bordo della vasca.
- Tenere centri dell'applicatore e stabile matraccio in una linea orizzontale.
- Attivare il dispositivo ad onde d'urto e applicare gli impulsi mantenendo il pallone di coltura e l'applicatore in posizione stabile durante l'intera procedura.
5. Dopo trattamento
- Prendete il pallone di coltura fuori bagnomaria.
- Asciugare con carta assorbente comuni.
- Pulire il pallone con precisione con agenti disinfettanti.
- Rimuovere tenuta Parafilm e cappuccio.
- Pipettare il Piano all'interno dei palloni in tubi centrifughi.
- Centrifugare adeguatamente. Parametri di centrifugazione dipendono dal tipo cellulare utilizzato,
- Aggiungere 5 ml di terreno di coltura cellulare al pallone. Risospendere il pellet di cellule centrifugato con 2 ml di mezzo di coltura cellulare. Pipettare la sospensione nella beuta. Così, frammenti cellulari o cellule che possono essere stati staccati durante il trattamento non si perdono.
Insidie
- Preparazione e trattamento devono essere eseguite in condizioni sterili all'interno flusso laminare per evitare la contaminazione della coltura cellulare.
- Buone pratiche di coltura cellulare si raccomanda di evitare la contaminazione delle sonde. In particolare, la disinfezione della parte esterna dei flaconi è fortemente consigliata prima di rimetterli al incubatrice. Il bagno d'acqua, così come l'interno dell'acqua, non è sterile!
- Non collegare il riscaldatore alla rete elettrica a meno che il bagno di acqua viene riempito con acqua per evitare danni ai plexiglas costruiti bagno.
- Utilizzare una generosa quantità di gel per ultrasuoni sulla appl onda d'urtoicator per garantire il corretto accoppiamento e la propagazione delle onde nel bagno. Aria e anche piccole bolle d'aria fanno assorbire le onde d'urto!
- Controllare la posizione delle sonde all'interno del bagno d'acqua in relazione alla applicatore per assicurare il trattamento di tutta l'area di crescita.
- Non dunk sonde troppo in profondità in acqua per evitare la contaminazione.
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Representative Results
Utilizzando il metodo descritto abbiamo applicato onde d'urto per le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) che abbiamo afore isolato da cordoni ombelicali. Cordoni ombelicali sono state ottenute da tagli cesarei elettivi.
HUVEC sono stati trattati con una confluenza del 90% in un pallone di coltura cellulare T25 con un sistema di onde d'urto elettroidraulico. Parametri di trattamento erano una densità di flusso di energia di 0,1 mJ / mm 2 e una frequenza di 5 Hz. 300 impulsi sono stati applicati ad una distanza di 5 cm dalla sorgente onde d'urto per lo strato di cellule.
Espressione genica di Tie-2 (tirosin-chinasi con i domini immunoglobulina-simili e EGF-simile 2) mRNA è stata misurata mediante real-time PCR. E 'stato significativamente up-regolato nel tempo (2 ore dopo SWT: 156.75 ± 14.49, 4 ore: 141.03 ± 9.71, 6 ore: 166,68 ± 2.15, p <0.05 vs CTR: 100.03 ± 7.5) Figura 5B. Questo recettore angiopoietin dà un suggerimento diretto per endoteliale c proliferazione ell ed è un indicatore per la loro capacità verso angiogenesi. Come controllo positivo abbiamo usato poli (I: C) (acido policitidilico polyinosinic) che, come un analogo struttura dell'RNA è noto per stimolare le cellule endoteliali (2 ore di post SWT: 125,7 ± 10.08, 4 hr: 191,73 ± 5,15, 6 ore: 400,93 ± 19.62, p <0.05 vs CTR: 103.65 ± 6.18) Figura 5A.
Matrice citochina è stata eseguita 48 ore dopo il trattamento per analizzare principali citochine infiammatorie IL-6 (59.97 ± 1.24, p <0,05 vs CTR 19,00 ± 0,44) e IL-8 (71.89 ± 1.52, p <0,05 vs CTR 29,50 ± 0,87 ), che sono sostanzialmente coinvolti nei primi mesi del angiogenesi. Entrambi sono stati significativamente aumentati nel gruppo di trattamento come indicato dalla matrice citochina figura 5C e dopo la quantificazione Figura 5D.
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Le onde d'urto Figura 1. Applicati direttamente su un pallone di coltura cellulare. Quasi il 99% delle onde ottenere riflessa nella parete posteriore del pallone provocando disturbi fisici alle cellule e le prossime onde. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Sfasamento delle onde in acqua per il passaggio dell'aria. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Interferenza tra schienale in esecuzione e si possono verificare onde in arrivo. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Raffigurante bagnomaria IVSWT con la descrizione delle parti più importanti. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5 (A) HUVEC stimolate con il TLR-3 agonista e RNA struttura analogica Poly.. (I: C) e (B) Tie-2 mRNA di onde d'urto stimolato HUVECs raffigurante chiaramente un significativo incremento della proliferazione cellulare dati sono riportati come espressione di mRNA parente, media ± SEM. (C) risultati di matrice citochina che mostra un aumento dei livelli di IL-6 e IL-8. (D) raffiguranti quantificazione dei risultati (densità di pixel) da matrice di citochine, media ± SEM. * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 6. Schema di prova pilota per identificare i parametri perfetti di trattamento per il tipo cellulare specifico. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il significato del modello proposto per trattamento con onde d'urto vitro in è il fatto che le onde possono propagarsi dopo aver superato la coltura cellulare in contrasto con i modelli esistenti. In tal modo, effetti fisici disturbanti come forze di trazione possono essere evitati. Il modello assomiglia più da vicino le condizioni in vivo di quella da altri applicando onde per loro fiasche di coltura cellulare direttamente.
Un ulteriore vantaggio è la possibilità di variare la distanza tra la sorgente onde d'urto e cellule. Ciò non sarebbe possibile se trattare direttamente un pallone di coltura. Tuttavia, in vivo là alcune differenze nella distanza tra l'applicatore e l'area di destinazione, a seconda di quanto in profondità all'interno del tessuto bersaglio è. Allo stesso tempo si può studiare l'effetto delle cellule che si trovano in posizioni specifiche al punto focale dell'onda.
Condurre primi esperimenti
Secondo la nostra esperienza con cardiomyocytes, cellule endoteliali, fibroblasti e cellule staminali, ogni tipo di cellula ha bisogno dei suoi parametri di trattamento specifiche. Pertanto si consiglia vivamente una prova pilota per la valutazione dei parametri di trattamento adeguato prima di effettuare gli esperimenti desiderati. Questo studio pilota deve includere diverse distanze tra l'applicatore onda d'urto e il campione, così come diverse densità di flusso energetico. Inoltre, occorre stabilire il numero più appropriato di impulsi. La frequenza di applicazione di onde d'urto è ancora una fonte di preoccupazione - anche in vivo. Un protocollo adeguato al parametro di trattamento trovando prova pilota è fornito come supplemento Figura 6.
L'impiego del recipiente di coltura ideale è di grande importanza per il successo dell'esperimento. Preferiamo comuni fiasche di coltura cellulare di qualsiasi dimensione. Tuttavia, ci possono essere motivi per utilizzare altre navi - ad esempio bisogno di volumi più piccoli per riempire completamente la nave durante lo shock onda unaPPLICAZIONE. Materiali idonei dal punto di vista acustico sono PE (Z = 1'760'000 Ns / m 3), soft-gomma (Z = 1'270'000 Ns / m 3), poliammide (Z = 1'960'000 Ns / m 3). Meno ideale è PVC (3'270'000 Ns / m 3) plexiglas (Z = 3'260'000 Ns / m 3) Delrin (3'450'000 Ns / m 3) policarbonato (2'770'000 Ns / m 3) o polipropilene (2'400'000 Ns / m 3). Non devono essere utilizzati materiali duri come il vetro o metallo.
Passaggi critici
Definire la distanza tra la sorgente di onde d'urto e il campione può essere molto difficile. La ragione è che la sorgente (ad esempio elettrodi punte in un sistema elettro-idraulico) si trova all'interno dell'applicatore. Pertanto, è necessario conoscere la distanza dalla sorgente al applicatori mantello. Potrebbe essere necessario chiedere al produttore del dispositivo onde d'urto.
Uno svantaggio di questo modello è il fatto che la cella cultura fiala deve essereriempito con mezzo di coltura. Riempimento ad esempio cellulari cultura palloni implica un consumo maggiore e costoso del terreno di coltura. Oltre ai costi, questo fatto significa anche che tutto ciò che le cellule secernono è fortemente diluito. Rilevare molecole diventa quindi molto più difficile a causa di una riduzione della concentrazione. Quindi, abbiamo iniziato a utilizzare i filtri di proteine per centrifugazione e quindi aumentare di nuovo la concentrazione.
Inoltre l'uso di diversi tipi di fiale di coltura cellulare come descritto sopra, la modifica principale per IVSWT è il suo utilizzo per coltura tissutale ed ex vivo modelli. In particolare, il nostro gruppo testato con risultati perfetti nel aortico anello angiogenesi dosaggio 10. Ciò significa che è possibile contenere qualsiasi tipo di tessuto o organo di ingegneria tessutale innesti nel bagnomaria IVSWT. Ex vivo urto applicazione onda quindi in futuro potrebbe essere utilizzato per migliorare diversi tipi di metodi di semina cellulare su innesti ingegnerizzati.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Reiner Schultheiss e Wolfgang Schaden per la loro ispirazione per questo modello. Ringraziamo anche Christian Dorfmüller per i suoi tutti gli enormi sforzi di tempo per sostenere la nostra ricerca.
Molte grazie a Robert Göschl e Hans Hohenegger per un'attenta realizzazione tecnica delle nostre idee!
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger - Technical Products | ||
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipettes 25 ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | ||
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 Cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| Mikrozid disinfectant | Schülke | ||
| 3.5 L Degassed water | |||
| Paper towels |
References
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