Summary
衝撃波は、今日ではその再生効果によく知られている。従ってインビトロ実験は、関心の高まりである。そこで我々は、それによって気が散るの物理的効果を回避すること、生体内の状態に模倣することを可能にin vitroでの衝撃波試験（IVSWT）のためのモデルを開発しました。
Abstract
衝撃波は、今日ではその再生効果によく知られている。基礎研究の知見は、衝撃波は、任意の後続の損傷なしに細胞または組織を標的とする生物学的刺激を引き起こすということを示した。従って、 インビトロ実験は、増大興味深い。細胞培養物上に衝撃波を印加する様々な方法が記載されている。一般的に、既存のすべてのモデルは、最高の細胞上に衝撃波を適用する方法に焦点を当てています。
しかし、この疑問が残っている：どのような細胞培養を通過した後の波はどうなりますか？細胞培養培地と周囲空気の音響インピーダンスの差は、衝撃波の99％以上が反射始めることが、高いことである！そこで我々は、主に波が細胞培養を通過した後、水中に伝播することを可能にするプレキシグラス構築された容器で構成されていたモデルを開発しました。これはキャビテーション効果だけでなく、そうでなければ、今後のものを乱す音波の反射を避けることができます。ウィスコンシン州このモデル番目の我々は、生体内条件を模倣し、それによって衝撃波の物理的刺激が生体細胞の信号（「メカノ」）に変換されます方法についてのより多くの知識を得ることができます。
Introduction
衝撃波は、例えば 、エネルギーの突然の解放に起因する音圧の波である。雷などの時に雷。医学では衝撃波が腎臓結石の崩壊のために砕石術において30年以上にわたって使用されてきた。 1980年代初頭における砕石術の患者における腸骨肥厚の偶発的所見ので、最初の研究は、骨の治癒1上の衝撃波処理（SWT）の効果を評価するために行った。長い骨の癒着不能の改善された癒しの印象的な結果は、2を観察することができた。その後、表示は軟部組織の傷3に拡大した。基礎研究の知見は、衝撃波は、任意の後続のダメージを与えることなく標的組織に生物学的刺激を引き起こすということを示した。血管新生増殖因子（ 例えば VEGF、PlGFは、FGF）の放出を有意血管形成が続く。これは、虚血性の病状に向けた指標の一層の拡大につながった。私たちのグループなどが、正EFFを示したECT動物モデルにおける虚血性心疾患に対するSWTのだけでなく、臨床試験4-6の。
しかし、SWTの物理的刺激が生体信号（メカノ）に変換されるかの正確なメカニズムは、大部分が未知のままである。継続的に薬が増加のいくつかの分野から、SWTの関心としては、メカニズムの探求はますます強烈になっている。したがって、 インビトロ衝撃波実験は重要性を増している。動物実験および費用対効果の低減に加えて、 インビトロ衝撃波処理（IVSWT）の最大の利点は、特定の細胞型の特定の挙動を研究する可能性があってもよい。最も可能性の高い治療された組織のすべての細胞が関与する衝撃波媒介組織再生においても、全身性の効果が記載されている。それにもかかわらず、各細胞型は、特定の役割を果たし、それ自身の固有の機能を有する。 IVSWTは、この特定の関数Aを検出することを可能にND、それによって私たちに複雑な基盤となるプロセスをよりよく理解することができます。
細胞培養物に対する衝撃波の影響についての今日の知識は、増殖の増加、細胞膜受容体の変化、増加および細胞分化の促進、成長因子および化学誘引物質の放出、ならびに増大した細胞遊走7-9を含む。
インビトロのモデルの中で最も邪魔で物理的効果、細胞培養物上に衝撃波を印加する様々な方法が記載されている。この事実は、細胞刺激の物理的条件は、これらのモデルの間でかなり異なっているように、それが結果を比較することは非常に困難であるという問題がある。一般的に、既存のすべてのモデルは、最高の細胞上に衝撃波を適用する方法に焦点を当てています。
しかし、この疑問が残っている：どのような細胞培養を通過した後の波はどうなりますか？主な問題は、音響の違い細胞培養培地と周囲空気のインピーダンスは、衝撃波の99％以上は、図1反射始めることが、高いことである。
による波が反射されるだけでなく、180°の位相シフトを細胞に強い引張力が発生し、その結果を図2つの媒体の音響インピーダンスの差である。
音響インピーダンスは、材料の密度と音速Z =ρX cは積として定義される。水の音響インピーダンスはZWater =144万NS / m 3であり 、空気がそれだけで420-S / M 3である。これら二つの値の差が大きい衝撃波の反射および位相シフトをもたらす。位相シフトは引張波に正圧力パルスをオンにします。
この引張力は、細胞に有害ではないとしても、 インビトロでインビボ衝撃波の効果を模倣するというアイデアに干渉する。 インビボこれら引張力はほとんど、大きな身体構造に起因し発生しません。
さらに、電波を実行し、バックにも入ってくるものを邪魔することができます。これは、干渉を引き起こす可能性があります。干渉の二つのタイプが知られている。建設的干渉は、両方の波が、それによって二倍の振幅を図3にその結果追加されていることを意味します。波は、直径方向に対向満たせば破壊的な干渉が発生する。これは、波の廃止（ 図3）を引き起こす。したがって、IVSWTは、細胞培養を通過した後、伝播する衝撃波を可能にモデルを必要とします。
IVSWT水浴
上記の懸念は、次の考慮事項が記載された問題は、基本的には、衝撃波アプリケータのあらゆる種類を接続するために、膜を容器に構築されたプレキシグラスから構成されています。 図4を回避するための水浴を設計するために私たちを導く。この膜と塗布音波伝送GEとの間の結合のためのlが使用されなければならない。水浴は、ガスを水の中に固溶した場合に生じるキャビテーションを避けるために、脱気水で満たされている。制御ユニットに接続された温度センサと下部のヒーターは、 インビボ条件を模倣するための温度を調節するために、処置中にクールダウンするために細胞培養物を回避することができる。それは培養器で行われるように温度が摂氏37度で安定に保持することができる。細胞サンプルのためのホルダは、培養フラスコ又は管のいずれかの種類を浸漬することを可能にする。これにより、試料容器は、気泡が衝撃波をブロックするように完全培地で充填する必要がある！お風呂の後壁にくさび形の吸収体が順番に反射して干渉を回避するために戻って実行して取得しないように波を破棄。
他のIVSWTモデルに更なる利点は、アプリケータ及び培養フラスコとの間の距離を変化させる可能性がある。私たちのグループの調査結果との明らかに、このモデルを使用して他の人どのようにすべての細胞型が異なる治療パラメータに非常に特異的に反応する。これは衝撃波アプリケータの焦点に関して特定の位置にあると対照細胞することを可能として、さらに、波源と試料との間の距離を定義することが重要である。
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Protocol
倫理的な許可
患者の書面によるインフォームドコンセントを得た後、臍帯は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の単離のための婦人科における帝王切開から得た。許可はインスブルック医科大学（番号UN4435）の倫理委員会から与えられた。
1。IVSWTウォーターバスを準備します
- 適切なタンクに水道水3.5リットルを準備します。水は37°C（プロトコル6を参照）に加熱する必要がある。
- 水位が約3cmエッジ未満になるまで水槽に水を入れます。完全に水の膜をカバーするためにマインド。これは、約準備3.5 Lを必要とします
- 電源に温度センサーを接続します。
- 水浴の後壁に意図されたフィッティングにセンサーを置く。
- 温度センサの電源に加熱を接続します。なしでこれをしないでくださいヒーターなどのお風呂の水はプレキシグラスを溶かしてしまうだろう。
- 水は37℃の安定した温度に達するまで待つ水浴を通して一定の温度を保証するために棒のいくつかの種類と定期的に水をかき混ぜる。
2。細胞および培養フラスコを準備
- それらが所望の合流点に到達した直接までT25培養フラスコ、培養フラスコ中の細胞内で所望の密度で一晩種細胞。
- 実験前、縦にフラスコに合わせます。
- 右首下のまで、培養液で培養フラスコを埋める。汚染さになるだろう首や閉鎖キャップに接触している媒体としてフラスコ中にあまりにも多くのメディアを入れないでください。
- 水からの汚染を防ぐために、フィルタなしに固体キャップをフラスコをねじ込み。槽内の水やお風呂自体は無菌ではないことに注意し。
- 水浴中に挿入する前に、パラフィルムとキャップを封印。 <李>提供スタンドに封入された培養フラスコを固定します。
- 水槽に固定されたフラスコを挿入します。細胞培養フラスコの中央の衝撃波アプリケータのメンブレンの中央と同じ高さにあることを注意してください。バス側のラインがガイドします。
3。治療パラメータを定義します。
- 衝撃波源と試料との間の距離を定義する。図6で説明したように、パイロット実験を求めるパラメータを行うことにより、最適な治療パラメータを識別する。
- 衝撃波デバイス上の適切な治療パラメータ（エネルギー束密度、周波数）を選択する。再び、 図6を参照してください。
4。衝撃波アプリケーション
- 衝撃波アプリ上だけでなく、水浴の膜上、市販の超音波伝達ゲルをたっぷり量を置く。これは、カップリングを保証することである。空気や気泡は、アプリケーターと膜との間あってはならないそれは衝撃波を吸収する。
- 膜に塗布器を接続し、膜の中心に安定して保持。それが水平に整列されていることに注意してください。
- 水浴の内部プローブの正確な垂直方向の位置が示されたバスの側面にマーキングに沿ったものであることを確認してください。
- アプリケーターと水平線で安定フラスコの中心を持ってください。
- 衝撃波デバイスをアクティブにして、全体の手順の間、安定した位置に培養フラスコなどのアプリケータを維持しながら、インパルスを適用します。
5。後の処理
- 水浴から培養フラスコを取る。
- 一般的なペーパータオルでそれを乾燥させます。
- 消毒剤を用いて正確にフラスコを拭きます。
- パラフィルムシールとキャップを外します。
- 遠心管にフラスコ内の媒質をピペット。
- 適切に遠心します。遠心分離パラメータは、使用される細胞タイプに依存し、
- フラスコに細胞培養培地を5mlの追加。細胞培養培地2mlで遠心分離し、細胞ペレットを再懸濁する。フラスコ内に懸濁物をピペットで。このように、治療中に切り離されている可能性があり、細胞断片または細胞が失われません。
落とし穴
- 製剤ならびに治療は、細胞培養物の汚染を避けるために層流内側無菌条件下で行われるべきである。
- 良好な細胞培養の練習は、プローブの汚染を避けることをお勧めします。特に、フラスコの外の消毒が強くバックインキュベーターにそれらを入れる前に、お勧めします。水浴だけでなく、内部の水は、無菌ではありません！
- 水浴浴を建てたプレキシグラスの損傷を防ぐために水で満たされていない限り、電源にヒーターを接続しないでください。
- 衝撃波APPLに超音波ゲルの寛大な量を使用浴に適切なカップリングと波動伝播を保証するicator。空気と小さな気泡が衝撃波を吸収するか！
- 全体成長分野の治療を確保するために、アプリケータに関連した水浴の内部プローブの位置を確認してください。
- 汚染を避けるためにあまりにも深く水にプローブをダンクしないでください。
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Representative Results
我々は我々の臍帯から前述の単離されたヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）に衝撃波を印加記載の方法を用いて製造した。臍帯は、待機的帝王切開のセクションから入手した。
HUVECを電気油圧衝撃波療法システムとT25細胞培養フラスコ内で90％コンフルエンスで処理した。治療パラメータは、0.1ミリジュール/ mm 2で5ヘルツの周波数のエネルギー束密度であった。 300インパルスが衝撃波源から5cmの距離から細胞層に適用した。
Tie-2での遺伝子発現（免疫グロブリン様およびEGF様ドメインを有するチロシンキナーゼ2）mRNAのリアルタイムPCR分析により測定した。それは、時間をかけてアップレギュ有意に（2時間後、SWT：156.75±14.49、4時間：141.03±9.71、6時間：166.68±2.15、P、CTR対<0.05：100.03±7.5） 図5B。このアンギオポイエチン受容体は、血管内皮cの直接的なヒントを与えエル増殖と血管新生に向けた能力の指標である。 125.7±10.08、4時間：191.73±5.15、6時間：400.93 RNA構造としてアナログが内皮細胞（2時間後、SWTを刺激することが知られていること（I：C）（ポリイノシンポリシチジル酸）をポジティブコントロールとして、我々は、ポリ使用19.62の±P <0.05対クリック率：103.65±6.18） 図5A。
サイトカインアレイは主炎症性サイトカインIL-6（59.97±1.24、p <CTR 19.00±0.44対0.05）およびIL-8（71.89±1.52、p <CTR 29.50±0.87対0.05を分析するために処理の48時間後に実施した）は、実質的に初期の血管新生に関与している。サイトカイン配列図5Cによっておよび定量図5Dの後に示すように、両方が大幅に治療群で増加した。
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図1。衝撃波が細胞培養フラスコ上に直接適用される。波の約99％が、それによって細胞や今後の波に物理的な障害を引き起こすフラスコの背面壁に反射します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。空気通路への水の波の位相シフト。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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図3。ランニングバックと受信波の間に干渉が発生することがあります。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。最も重要な部分の説明をIVSWT水浴を描いた。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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。図5（A）HUVECをTLR-3アゴニスト及びRNAの構造類似体で刺激したポリ（I：C）衝撃波及び（B）Tie-2でのmRNA発現は、明らかに、細胞増殖の有意な増加を示すのHUVECを刺激したデータが与えられた。相対的mRNA発現として、±SEMを意味する。IL-6およびIL-8のレベルの増加を示すサイトカインアレイの（C）の結果。（D）サイトカインアレイからの結果の定量化（画素密度）を示す、±SEMを意味する。 * P <0.05、** P <0.01、** P <0.001 、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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特定の細胞型に最適な治療パラメータを識別するためのパイロット試験については図6。スキーム。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
インビトロ衝撃波治療のために提案されたモデルの意義は、波が既存のモデルとは対照的に、細胞培養物を通過した後に伝搬することができるという事実である。それによって、引張力などの物理的妨害の影響を回避することができる。モデルは、より密接に他の人が直接細胞培養フラスコに音波を印加することによってよりも、インビボ条件に似ている。
さらなる利点は、衝撃波源と細胞との間の距離を変化させる可能性がある。直接培養フラスコを治療する場合、これは不可能であろう。しかし、 生体内でどのように深い標的組織の内部に応じて、アプリケータと目標領域との間の距離の特定の違い、 中に 。同時に、一つの波のフォーカスポイントに特定の位置にある細胞の効果を研究することができる。
最初の実験を行う
CAの経験によると、rdiomyocytes、内皮細胞、線維芽細胞および幹細胞は、すべての細胞型は、その特定の治療パラメータを必要とする。したがって、我々は強く望ま実験を行う前に、適切な治療パラメータの評価のためのパイロット試験をお勧めします。このパイロット試験は、衝撃波アプリケータと試料との間の異なる距離、ならびに異なるエネルギー束密度を含む必要がある。また、パルスの最も適切な数は、確立されるべきである。 インビボでさえ-衝撃波を印加する周波数は、依然として懸念される。パイロット試験を見つけ、治療パラメータの適切なプロトコルは、サプリメントを図6として提供されています。
理想的な培養容器の使用は、実験の成功のために非常に重要である。私たちは、任意のサイズの一般的な細胞培養フラスコを好む。 例えば 、完全に衝撃波A中に容器に充填するためのより小さなボリュームを必要とするために-しかし、他の船舶を使用するには理由があるかもしれpplication。ビューの音響観点から、適切な材料であるPE（Z = 1'760'000 NS / m 3）と 、ソフトラバー（Z = 1'270'000 NS / M 3）、ポリアミド（Z = 1'960'000 NS / M 3）。あまり理想的ではPVC（3'270'000 NS / m 3）のプレキシグラス（Z = 3'260'000 NS / m 3）のデルリン（3'450'000 NS / m 3）のポリカーボネート（2'770'000 NS /ですM 3）またはポリプロピレン（2'400'000 NS / M 3）。ガラスや金属などの硬質材料を使用してはならない。
重要なステップ
衝撃波源と試料の間の距離を定義することは非常に難しいことができます。その理由は、ソース（電気-油圧システムにおいて、例えば 、電極チップ）が、アプリケータの内側に配置されることである。したがって、アプリケータマントルソースからの距離を知ることが必要である。あなたは、衝撃波デバイスの製造元に依頼する必要があります。
このモデルの欠点は、細胞培養バイアルする必要があるという事実である培養培地を充填した。 例えば、細胞培養フラスコに充填する培地の増加と高価な消耗を意味する。コストに加えて、この事実は、細胞が分泌する何が強く希釈されることを意味している。したがって、分子を検出することははるかに難しいため、減少した濃度のを取得します。したがって、我々は、遠心分離のためのタンパク質フィルタを使用することにより、再び濃度を増加し始めた。
上記のように細胞培養バイアルの異なるタイプの使用に加え、IVSWTのための主要な修飾は、組織培養および ex vivoモデルのためのその使用である。具体的には、我々のグループは、大動脈輪血管新生アッセイ10で完璧な結果でそれをテストされています。これは、それがIVSWTの水浴に器官組織又は組織工学移植片の任意の種類を保持することが可能であることを意味する。 エクスビボ衝撃波アプリケーションしたがって、将来的に操作されたグラフト上の細胞播種方法の異なる種類を改善するために使用することができる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、このモデルのためのインスピレーションのためのライナーSchultheissとヴォルフガングSchadenに感謝します。我々はまた、我々の研究を支援するために彼のすべての時間の多大な努力のためのキリスト教ドルフミュラーに感謝します。
私たちのアイデアを慎重に技術的な実現のためのロバートGöschlとハンスHoheneggerに感謝！
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger - Technical Products | ||
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipettes 25 ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | ||
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 Cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| Mikrozid disinfectant | Schülke | ||
| 3.5 L Degassed water | |||
| Paper towels |
References
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