Summary
Chockvågor numera är väl kända för att de regenerativa effekter. Därför in vitro-försök är att öka intresset. Vi utvecklade därför en modell för in vitro chockvåg försök (IVSWT) som gör att vi kan efterlikna in vivo-förhållanden och därmed undvika störande fysiska effekter.
Abstract
Chockvågor numera är väl kända för att de regenerativa effekter. Grundläggande forskningsresultat visade att chockvågor orsakar en biologisk stimulans till målceller eller vävnad utan några följdskador. Därför, in vitro-försök är att öka intresset. Olika metoder för att tillämpa chockvågor på cellkulturer har beskrivits. Generellt alla befintliga modeller fokuserar på hur man bäst tillämpar chockvågor på celler.
Dock kvarstår frågan: Vad händer med vågorna efter att ha passerat cellkulturen? Skillnaden i den akustiska impedansen i cellodlingsmediet och den omgivande luften är så hög, att mer än 99% av stötvågor får reflekteras! Vi utvecklade därför en modell som i huvudsak består av en plexiglas inbyggd behållare som tillåter vågorna att utbreda sig i vattnet efter att ha passerat cellkultur. Detta undviker kavitation effekter samt återspegling av vågorna som annars skulle störa kommande sådana. Wie denna modell har vi möjlighet att efterlikna förhållandena in vivo och därmed få mer och mer kunskap om hur den fysiska stimulansen av stötvågor blir översatt till en biologisk cell signal ("mechanotransduction").
Introduction
Chockvågor är ljudtrycksvågor till följd av en plötslig frisättning av energi, t ex. som åska när blixten. Inom medicinen stötvågor har använts i över 30 år i Litotripsi för upplösningen av njursten. Eftersom bifynd av iliaca ben förtjockning i litotripsi patienter i början av 1980, var första studierna utfördes för att utvärdera effekten av chockvågen behandling (SWT) på ben läker 1. Imponerande resultaten av förbättrad läkning av långa rörben nonunions kunde observeras 2. Därefter har indikationer utvidgas till mjukdels sår 3. Grundläggande forskningsresultat visade att chockvågor orsakar en biologisk stimulans till målvävnaden utan några följdskador. Frisättning av angiogena tillväxtfaktorer (t.ex. VEGF, PlGF, FGF) följs av signifikant angiogenes. Detta ledde till en ytterligare utvidgning av indikationer mot ischemiska sjukdomar. Vår grupp och andra visade den positiva effect av SWT på ischemisk hjärtsjukdom i djurmodeller och i kliniska prövningar 4-6.
Men den exakta mekanismen för hur den fysiska stimulansen av SWT är översatt till en biologisk signal (mechanotransduction) är i stort sett okända. Eftersom intresset för SWT från flera medicinska områden ökar kontinuerligt, är jakten på den mekanism blir mer och mer intensiv. Därför är in vitro chockvåg experiment allt viktigare. Förutom minskningen av djurförsök och kostnadseffektivitet, kan den största fördelen med in vitro chockvåg behandling (IVSWT) finnas en möjlighet att studera specifika beteendet hos en viss celltyp. I chockvåg medierad vävnadsregenerering troligtvis alla celler i den behandlade vävnaden är inblandade, är även systemiska effekter diskuteras. Ändå spelar varje celltyp en särskild roll och har sin egen inneboende funktion. IVSWT gör det möjligt att detektera denna funktion ennd därmed ger oss en bättre förståelse för de komplexa bakomliggande processer.
Dagens kunskaper om stötvåg effekter på cellkulturer omfattar en ökning av spridning, ändring av cellmembranreceptorer, ökning och acceleration av celldifferentiering, frisättning av tillväxtfaktorer och kemo-attraherande samt ökad cellmigration 7-9.
Störande fysiska effekter i de flesta in vitro-modeller Olika metoder för att tillämpa chockvågor på cellkulturer har beskrivits. Detta faktum leder till det problemet att det är mycket svårt att jämföra resultaten, eftersom fysiska tillståndet hos cellstimulering är helt olika mellan dessa modeller. Generellt alla befintliga modeller fokuserar på hur man bäst tillämpar chockvågor på celler.
Dock kvarstår frågan: Vad händer med vågorna efter att ha passerat cellkulturen? Det huvudsakliga problemet är att skillnaden för den akustiskaimpedans av cellodlingsmediet och den omgivande luften är så hög, att mer än 99% av stötvågor blir reflekterade Figur 1.
På grund av skillnaden i akustisk impedans av de två medierna vågorna är inte bara speglas utan en fasförskjutning på 180 ° sker resulterar i starka dragkrafter till cellerna Figur 2.
Akustisk impedans definieras som produkten av densiteten hos ett material och dess ljudhastighet Z = ρ x c.. För vatten den akustiska impedansen är ZWater = 1.440.000 Ns / m 3, för luften är det bara 420 Ns / m 3. Den stora skillnaden mellan dessa två värden resulterar i reflektion och fasförskjutning av stötvågor. Fasförskjutningen förvandlar en positiv tryckpuls i en dragvågen.
Även om denna dragkraft är inte skadligt för cellerna, stör det med tanken på att härma in vivo chockvåg effekter in vitro. In vivo dessadragkrafter knappast uppstå på grund av stora kroppsstrukturer.
Dessutom kan rygg kör vågor även störa inkommande sådana. Detta kan orsaka störningar. Två typer av interferens är kända. Konstruktiv interferens innebär att båda vågorna adderas vilket resulterar i fördubblad amplitud Figur 3. Destruktiv interferens uppstår om vågor möter diametralt motsatt. Det orsakar avskaffandet av vågor (Figur 3). Därför IVSWT behöver en modell som gör att stötvågor att propagera efter passage av cellodlingen.
IVSWT vattenbad
Överväganden efter de ovan nämnda oro leda oss att utforma ett vattenbad för att undvika de beskrivna problemen Figur 4. I grunden består den av ett plexiglas inbyggd behållare med ett membran för att ansluta alla typer av stötvåg applikator. För koppling mellan detta membran och applikatorn ultraljudsöverföring GEl måste användas. Vattenbadet är fylld med avgasat vatten för att undvika kavitation som skulle inträffa om gas soluted inom vattnet. En varmare i botten med en temperatursensor som är ansluten till en styrenhet gör det möjligt att reglera temperaturen för imitation av in vivo-förhållanden och för att undvika cellkulturer för att kyla ner under förfarandet. Temperaturen kan hållas stabilt på 37 grader som det är gjort i en inkubator. En hållare för cellproverna möjliggör nedsänkning av alla typer av odlingskolv eller-rör. Därigenom måste provkärlet att vara helt fylld med odlingsmedium, såsom luftbubblor skulle blockera stötvågor! En kilformad upptagare vid den bakre väggen i badet destructs vågor för att inte få avspeglas och köra tillbaka för att undvika störningar.
En ytterligare fördel till andra IVSWT modeller är möjligheten att variera avståndet mellan applikatorn och odlingsflaskor. Resultat av vår grupp och andra som använder den här modellen är klarthur att varje celltyp reagerar mycket specifikt till olika behandlingsparametrar. Dessutom är avgörande att definiera avståndet mellan källan av vågorna och provet som gör att vi kan styra celler för att vara i en specifik position i relation till fokus för stötvåg applikator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiskt tillstånd
Efter att ha fått skriftligt informerat samtycke från patienter, var navelsträngar som erhålls från kejsarsnitt vid avdelningen för gynekologi för isolering av humana umbilikalvensendotelceller (HUVEC). Tillstånd gavs från den etiska kommittén i Innsbruck Medical University (nr UN4435).
1. Förbered IVSWT Vattenbad
- Förbered 3,5 liter kranvatten i en lämplig tank. Vatten behöver värmas till 37 ° C (se protokoll 6).
- Fyll på vatten i vattenbadet tills vattennivån är ca 3 cm under kanten. Märk att helt täcka membranet med vatten. Detta kommer att kräva ungefär förberedda 3,5 L.
- Anslut temperaturgivaren till strömförsörjningen.
- Placera sensorn i den avsedda montering på den bakre väggen i vattenbadet.
- Anslut uppvärmning till strömförsörjning av temperaturgivare. Gör inte detta utanVattnet i badet som aggregatet skulle smälta plexiglas.
- Vänta tills vattnet har nått en stabil temperatur av 37 ° C. Rör om vatten regelbundet med något slags pinne att garantera en konstant temperatur under hela vattenbad.
2. Förbered Celler och odlingsflaskor
- Seed celler över natt vid önskad densitet i T25 odlingskolvar eller odla cellerna i kolvarna direkt tills de har nått den önskade konfluens.
- Innan experimentet, rikta kolvarna lodrätt.
- Fyll kultur kolvar med odlingsmedium till höger nedanför halsen. Fyll inte på för mycket medel i kolvarna som medium i kontakt med halsen eller stängningslocket skulle bli förorenat.
- Skruva kolvarna med solida lock utan filter för att förhindra förorening från vatten. Märk att vattnet i badet och badet självt är inte sterila.
- Täta locken med Parafilm före insättning i vattenbad. <li> Fix slutna odlingsflaskor i den medföljande stativet.
- Sätt fast kolven i vattenbad. Var försiktig så att den mellersta av cellodlingskolv är på samma höjd som mitten av den stötvåg applikatorns membran. En linje vid sidan av badet leder dig.
3. Definiera behandlingsparametrar
- Definiera avståndet mellan chockvåg källa och prov. Identifiera perfekta behandlingsparametrarna genom att utföra parameter konstaterandet pilotexperiment såsom beskrivs i figur 6.
- Välj rätt behandlingsparametrar (energitäthet, frekvens) på stötvågen enheten. Återigen, se Figur 6.
4. Shock Wave Ansökan
- Sätt massor mängder kommersiellt tillgänglig ultraljudsöverföring gel på stötvåg applikator samt på membranet i vattenbad. Detta är för att säkerställa kopplingen. Ingen luft eller luftbubblor bör vara mellan applikatorn och membranet somdet skulle absorbera stötvågor.
- Anslut applikatorn till membranet och hålla den stabil i centrum av membranet. Se till att den är i linje horisontellt.
- Kontrollera att den korrekta vertikala positionen av sonden inne i vattenbadet är i linje med den angivna märkningen på sidan av badet.
- Håll centra i applikatorn och kolven stabilt i en horisontell linje.
- Aktivera stötvåg anordningen och tillämpa de impulser under det att odlingskolv samt applikatorn i ett stabilt läge under hela proceduren.
5. Efter behandling
- Ta odlingskolven ut ur vattenbadet.
- Torka den med vanliga pappershanddukar.
- Torka kolven noggrant med desinfektionsmedel.
- Ta Parafilm tätning och lock.
- Pipettera Medium inuti kolvarna i centrifugrören.
- Centrifugera lämpligt. Centrifugering av parametrar beror på den använda celltypen,
- Tillsätt 5 ml av cellodlingsmedium till kolven. Resuspendera centrifuger cellpelleten med 2 ml cellodlingsmedium. Pipet suspensionen ner i kolven. Således behöver cellfragment eller celler som kan ha lossnat under behandlingen inte att gå förlorad.
Fallgroparna
- Förberedelse samt behandling bör utföras under sterila förhållanden inne laminärt flöde för att undvika kontaminering av cellkulturen.
- God cellodling praxis rekommenderas att undvika kontaminering av sonderna. Speciellt desinfektion av utsidan av kolvarna rekommenderas starkt innan du lägger dem tillbaka till inkubatorn. Vattenbadet, liksom vattnet inuti, är inte steril!
- Anslut inte aggregatet till elnätet, om inte vattenbadet fylls med vatten för att undvika skador på plexiglas byggde badet.
- Använd rikligt med ultraljud gel på stötvåg applicator att garantera en god koppling och vågutbredning i badet. Luft och även små luftbubblor gör absorbera chockvågor!
- Kontrollera positionen av sonderna inne i vattenbadet i förhållande till applikatorn för att garantera behandling av hela tillväxtområde.
- Inte dunk sonder för djupt i vattnet för att undvika kontaminering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av den beskrivna metoden vi tillämpat chockvågor till humana umbilikalvensendotelceller (HUVEC) som vi ovan isolerad från navelsträngar. Navelsträngar erhölls från elektiva kejsarsnitt.
HUVECs behandlades vid ett sammanflöde av 90% i en T25 cellkultur kolv med en elektrohydraulisk chockvåg terapisystem. Parametrar Behandling var en energitäthet av 0,1 mJ / mm 2 och en frekvens på 5 Hz. 300 impulser applicerades från ett avstånd av 5 cm från chockvågen källan till cellager.
Gene expression av Tie-2 (tyrosinkinas med immunglobulin-liknande och EGF-liknande domäner 2)-mRNA mättes genom realtids-PCR-analys. Det var betydligt uppreglerat över tid (2 timmar efter SWT: 156.75 ± 14.49, 4 timmen: 141,03 ± 9,71, 6 h: 166,68 ± 2,15, p <0,05 vs CTR: 100.03 ± 7,5) Figur 5B. Denna angiopoietin receptorn ger en direkt ledtråd för endothelial c ell spridning och är en indikator för sin förmåga mot angiogenes. Som positiv kontroll använde vi poly (I: C) (polyinosinic polycytidylsyra syra) att som en RNA-struktur analog är känt för att stimulera endotelceller (2 h efter SWT: 125,7 ± 10,08, 4 hr: 191,73 ± 5,15, 6 timmen: 400,93 ± 19.62, p <0,05 vs CTR: 103,65 ± 6,18) Figur 5A.
En cytokin array utfördes 48 timmar efter behandling för att analysera huvud inflammatoriska cytokiner IL-6 (59,97 ± 1,24, p <0,05 vs CTR 19,00 ± 0,44) och IL-8 (71,89 ± 1,52, p <0,05 vs CTR 29,50 ± 0,87 ) som väsentligen är involverade i början av angiogenes. Båda ökade signifikant i behandlingsgruppen som visas av cytokin array Figur 5C och efter kvantifiering Figur 5D.
ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51076/51076fig1.jpg "/>
Figur 1. Chockvågor appliceras direkt på en cellkultur kolv. Nästan 99% av vågor får reflekteras vid den bakre väggen av kolven och därigenom orsakar fysiska störningar till celler och kommande vågor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Fas-skift av vågor på vatten till luftpassagen. Figur 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ontent-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51076/51076fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51076/51076fig3.jpg" />
Figur 3. Störningar mellan back igång och inkommande vågor kan förekomma. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Skildrar den IVSWT vattenbad med beskrivning av de viktigaste delarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
es/ftp_upload/51076/51076fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51076/51076fig5.jpg "/>
Figur 5 (A) HUVEC stimulerade med TLR-3-agonist-och RNA-struktur analog Poly.. (I: C) och (B) tien-2-mRNA-expression av stötvåg stimulerade HUVEC tydligt visar en signifikant ökning av cellproliferation Data ges som relativa mRNA-uttryck, medelvärde ± SEM. (C) resultaten av cytokin array visar ökade nivåer av IL-6 och IL-8. (D) som visar kvantifiering av resultat (pixeltätheten) från cytokin array, medelvärde ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6/51076fig6highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51076/51076fig6.jpg "/>
Figur 6. System för pilotstudie för att identifiera den perfekta behandlingsparametrar för den specifika celltypen. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydelsen av den föreslagna modellen för in vitro-chockvåg behandling är det faktum att vågorna kan utbreda sig efter att ha passerat den cellkultur i motsats till befintliga modeller. Därigenom kan störande fysiska effekter, t.ex. dragkrafter undvikas. Modellen mer liknar in vivo-förhållanden än av andra tillämpar vinkar till sina cellodlingsflaskor direkt.
En ytterligare fördel är möjligheten att variera avståndet mellan tryckvågskällan och celler. Detta skulle inte vara möjligt om att behandla en odlingskolv direkt. Men in vivo finns vissa skillnader i avstånd mellan applikatorn och målområdet, beroende på hur djupt inne målvävnaden är. Samtidigt kan man studera effekten av cellerna är i vissa lägen till Waves fokuspunkt.
Genomföra första experiment
Enligt vår erfarenhet med cardiomyocytes, endotelceller, fibroblaster och stamceller måste varje celltyp dess specifika behandlingsparametrar. Vi rekommenderar därför starkt en pilotstudie enligt bedömning av adekvata behandlingsparametrarna innan de utför de önskade experiment. Denna pilotförsök måste omfatta olika avstånd mellan de tryckvågor applikatorn och provet samt olika energiflödestäthet. Dessutom bör den lämpligaste antalet pulser. Frekvensen för applicering stötvågor är fortfarande ett bekymmer - även in vivo. Ett lämpligt protokoll för en behandlingsparameter finna pilotstudie är anordnad som ett komplement Figur 6.
Användningen av den ideala odlingskärlet är av stor betydelse för framgången av experimentet. Vi föredrar vanliga cellodlingsflaskor av alla storlekar. Däremot kan det finnas skäl att använda andra fartyg - till exempel att behöva mindre volymer för att helt fylla fartyget under stötvåg enILLÄMPNING. Lämpliga material från en akustisk synvinkel är PE (Z = 1'760'000 Ns / m 3), mjukgummi (Z = 1'270'000 Ns / m 3), polyamid (Z = 1'960'000 Ns / m 3). Mindre ideal är PVC (3'270'000 Ns / m 3) Plexiglas (Z = 3'260'000 Ns / m 3) delrin (3'450'000 Ns / m 3) polykarbonat (2'770'000 Ns / m 3) eller polypropen (2'400'000 Ns / m 3). Hårda material, såsom glas eller metall får inte användas.
Kritiska steg
Definiera avståndet mellan tryckvågskällan och provet kan vara ganska besvärlig. Anledningen är att källan (t.ex. elektrod tips i en elektrohydrauliska systemet) är placerad inne i applikatorn. Därför är det nödvändigt att känna till avståndet från källan till applikatorer mantel. Du kanske måste fråga tillverkaren av chockvågen enheten.
En nackdel med denna modell är det faktum att cellkulturflaskan måste varafylld med odlingsmedium. Fyllning t.ex. cellodlingsflaskor innebär en ökad och dyra förbrukning av odlingsmedium. Förutom kostnader, detta faktum innebär också att oavsett vilka celler utsöndrar starkt utspätt. Upptäcka molekyler därför blir mycket svårare på grund av en minskad koncentration. Därför började vi använda proteinfilter för centrifugering och därmed öka koncentrationen igen.
Förutom användningen av olika typer av cellkulturflaskor såsom beskrivits ovan, är den viktigaste modifieringen för IVSWT dess användning för vävnadskultur och ex vivo-modeller. I synnerhet vår grupp testade det med perfekt resultat i aortaring angiogenes analys 10. Detta innebär att det är möjligt att hålla alla typer av vävnad organ-eller vävnadstekniska transplantat in i IVSWT vattenbad. Ex vivo stötvåg ansökan därför i framtiden skulle kunna användas för att förbättra olika typer av cellsådd metoder på engineered grafts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Reiner Schultheiss och Wolfgang Schaden för deras inspiration för denna modell. Vi tackar också Christian Dorfmüller för hans all time enorma insatser för att stödja vår forskning.
Stort tack till Robert Göschl och Hans Hohenegger för noggrann teknisk förverkliga våra idéer!
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger - Technical Products | ||
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipettes 25 ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | ||
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 Cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| Mikrozid disinfectant | Schülke | ||
| 3.5 L Degassed water | |||
| Paper towels |
References
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
- Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
- Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
- Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
- Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
- Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
- Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
- Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
- Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).
