Immunology and Infection

Cytokine उत्पादन के वायरल चोरी में सहज प्रतिरक्षा संकेतन विदारक

Published: March 2, 2014 doi: 10.3791/51078

Junjie Zhang¹, Lining Zhu¹, Pinghui Feng¹

¹Department of Microbiology and Immunology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

हम मानव Kaposi है sarcoma-जुड़े herpesvirus (KSHV) और Epstein बर्र वायरस (EBV) को बारीकी से संबंधित है कि एक मॉडल दाद, murine गामा दाद 68 (γ HV68) से संक्रमित चूहों में एंटीवायरल cytokine उत्पादन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों और माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) का उपयोग, हम एंटीवायरल cytokine उत्पादन विवो में और पूर्व vivo दोनों का आकलन किया. Lentiviral पारगमन से पीटकर भ्रूण fibroblasts में सहज प्रतिरक्षा घटकों की अभिव्यक्ति "पुनर्गठन", हम आगे विशिष्ट सहज प्रतिरक्षा अणुओं तुच्छ और विभिन्न एंटीवायरल cytokine उत्पादन को विनियमित कि कुंजी संकेत घटनाओं काटना.

Abstract

एक वायरल संक्रमण के जवाब में मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एंटीवायरल साइटोकिन्स के जीन अभिव्यक्ति और उत्पादन को विनियमित ऊपर से सक्रिय है. इसके विपरीत, वायरस अस्तित्व और प्रचार के लिए मेजबान प्रतिरक्षा संकेतन बचने और शोषण करने के लिए जटिल रणनीति विकसित किया है. वायरल प्रतिरक्षा चोरी, मेजबान रक्षा और वायरल चोरी entailing, मेजबान वायरस बातचीत विचार करने के लिए सबसे आकर्षक और गतिशील इंटरफेस में से एक प्रदान करता है. इन अध्ययनों से सहज प्रतिरक्षा विनियमन में हमारी समझ अग्रिम और उपन्यास एंटीवायरल उपचार विकसित करने के लिए हमारे मार्ग प्रशस्त हुआ.

Murine γHV68 murine कृन्तकों की एक प्राकृतिक रोगज़नक़ है. चूहों के γHV68 संक्रमण में विवो वायरस मेजबान बातचीत की गड़बड़ी लागू नहीं है जो की मानव KSHV और EBV के लिए एंटीवायरल प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक विनयशील छोटे पशु मॉडल उपलब्ध कराता है. यहाँ हम एंटीवायरल cytokine उत्पादन निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल अन्य वीर के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैका उपयोग करता है और रास्ते संकेतन.

हाल ही में, हम γHV68 NFΚB सक्रियण और antiviral cytokine उत्पादन रद्द करने, Mavs और IKKβ, साइटोसोलिक रिग, मैं और MDA5 के बहाव कुंजी सहज प्रतिरक्षा संकेत घटकों hijacks कि खोज की है. विशेष रूप से, γHV68 संक्रमण IKKβ सक्रिय है और कि सक्रिय IKKβ असली गिरावट में तेजी लाने के लिए असली phosphorylates. जैसे, γ HV68 कुशलतापूर्वक एंटीवायरल साइटोकाइन जीन अभिव्यक्ति नकार अपने अपस्ट्रीम सक्रिय IKKβ से NFΚB सक्रियण uncouples. इस अध्ययन अपस्ट्रीम सहज प्रतिरक्षा सक्रियण तत्काल बहाव के transcriptional सक्रियण उठा देना और antiviral cytokine उत्पादन से बचने के लिए एक वायरल रोगज़नक़ से रोक दिया है जिससे एक जटिल रणनीति elucidates.

Introduction

हाल के अध्ययनों से मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ते में समग्र cascades संकेत रेखांकित किया है. अलग डिब्बों के भीतर रहने, पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) ¹ संकेत सहज प्रतिरक्षा ट्रिगर करने के लिए विविध मूल के रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) का पता लगा. retinoic एसिड प्रेरित जीन मैं (RIG-I) और मेलेनोमा भेदभाव प्रतिजन 5 (MDA5) प्रोटीन विशिष्ट संरचनात्मक सुविधाओं ² के साथ शाही सेना प्रजातियों को पहचाना कि साइटोसोलिक सेंसर कर रहे हैं. सक्रियण पर, रिग, मैं बारी में, भी Ikki के रूप में जाना IKK (IKKαβγ) और IKK से संबंधित kinase (TBK1 और IKKε, सक्रिय, अनुकूलक (भी आईपीएस -1, वीसा, और Cardif के रूप में जाना जाता है) इसके नीचे की ओर Mavs के साथ सूचना का आदान प्रदान ) ^3-6 परिसरों. सक्रिय सहज प्रतिरक्षा kinases उसके प्रतिलेखन कारक और inhibitors सहित जीन अभिव्यक्ति का प्रमुख नियामकों, phosphorylate, और मेजबान एंटीवायरल जीन (जैसे IL6, TNF & # के transcriptional सक्रियण सक्षम945;, CCL5, और IFNβ). ये cascades संकेत संक्रमण के प्रारंभिक दौर के दौरान रोगज़नक़ प्रचार प्रतिबंधित करने के लिए एक विरोधी माइक्रोबियल राज्य की स्थापना है कि शक्तिशाली आंतरिक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का गठन.

Murine γHV68 निकट मानव oncogenic KSHV और EBV से संबंधित है. इस प्रकार, चूहों के γHV68 संक्रमण विवो ⁷ में गामा दाद वायरस के संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक विनयशील छोटे पशु मॉडल उपलब्ध कराता है. ΓHV68 वायरल संक्रमण सक्षम करने के लिए सहज प्रतिरक्षा संकेतन मेजबानी hijacks जिससे γHV68 का प्रयोग, हमारी प्रयोगशाला एक जटिल रणनीति पर्दाफाश किया है. एक ओर, γHV68 प्रतिकृति transactivator (आरटीए), γHV68 प्रतिकृति ⁸ वायरल प्रतिलेखन कारक कुंजी phosphorylate को सक्रिय IKKβ निर्देशन के माध्यम से वायरल transcriptional सक्रियण को बढ़ावा देने के लिए Mavs-IKKβ मार्ग सक्रिय. दूसरी ओर, IKKβ की मध्यस्थता phosphorylation गिरावट और कार्यकाल के लिए असली primesNFΚB सक्रियण ⁹ inates. जैसे, γHV68 संक्रमण प्रभावी ढंग से एंटीवायरल cytokine उत्पादन से बचा जाता है. दिलचस्प है, γHV68 की अभिव्यक्ति के पुस्तकालय का उपयोग एक स्क्रीनिंग असली गिरावट प्रेरित और NFΚB सक्रियण ¹⁰ रद्द करने के लिए एक E3 ligase के रूप में आरटीए की पहचान की. इन निष्कर्षों को अपस्ट्रीम प्रतिरक्षा संकेत घटनाओं परम एंटीवायरल cytokine उत्पादन नकारना γHV68 से इस्तेमाल कर रहे हैं जिससे एक जटिल प्रतिरक्षा चोरी रणनीति उजागर.

यहाँ हम vivo में और पूर्व विव ओ दोनों γHV68 से संक्रमित चूहों में एंटीवायरल cytokine उत्पादन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रोटोकॉल में हम आगे एंटीवायरल cytokine उत्पादन को विनियमित करने में विशिष्ट सहज प्रतिरक्षा अणुओं के समारोह pinpoints जो lentiviral पारगमन, से पीटकर भ्रूण fibroblasts में सहज प्रतिरक्षा घटकों के "पुनर्गठन" अभिव्यक्ति का पता लगाने. इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य वीरू के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैSES और संकेत दे रास्ते.

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Protocol

आचार विवरण: सभी जानवर काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार के तहत किया गया था. प्रोटोकॉल दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था.

1. ΓHV68 संक्रमित चूहों में एलिसा द्वारा मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर और स्राव द्वारा साइटोकाइन जीन एक्सप्रेशन

Intraperitoneally xylazine की ketamine/0.12 मिलीग्राम की 1.5 मिलीग्राम के इंजेक्शन लगाने के माध्यम से लिंग मिलान, 6-8 सप्ताह पुराने C57BL / 6 (बी -6) littermates (8-12 चूहों / समूह) anesthetize, और 40 μl में γHV68 के 40 pfu साथ intranasally टीका लगाना (दांग और फेंग ¹¹ में विस्तृत संक्रमण). अलग समय बिंदुओं पर बाद संक्रमण, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ ₂ साँस लेना का उपयोग करके चूहों euthanize.
STER साथ एक बाएं पार्श्व कटौती के साथ खुले सीनेसंख्या और तेज कैंची के साथ पसलियों के माध्यम से काटा. फेफड़ों के ऊतकों लीजिए.
500 μl 1.0 मिमी Zirconia / सिलिका मोती युक्त बाँझ 1.5 मिलीलीटर पेंच से छाया ट्यूबों में फेफड़े के ऊतकों (बाएं पालि) के आधे लीजिए. ट्यूब में ठंड सीरम मुक्त DMEM के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 30 सेकंड के लिए मनका पीट ने फेफड़े के ऊतकों homogenize. 2 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब ठंडा होगा और एक बार इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
ट्यूब (15,000 एक्स अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट) के लिए जी, सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने और नीचे वर्णित के रूप में cytokine उत्पादन को मापने.
निर्माता अनुदेश के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध साइटोकाइन एलिसा किट का उपयोग कर साइटोकिन्स उपाय.
एक और मनका युक्त ट्यूब में फेफड़े के ऊतकों (सही पालि) के दूसरे आधे लीजिए और 1 मिलीलीटर TRIzol जोड़ें. Homogenize और निर्माण के निर्देश के अनुसार कदम 1.3 और निकालने शाही सेना में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा. 260 और 280 एनएम पर absorbance रीडिंग लेने से शाही सेना एकाग्रता का निर्धारण. कुल शाही सेना की 1 ग्राम के साथ सीडीएनए तैयार करने और निर्माण अनुदेश (कुल अंतिम मात्रा 20 μl था) के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस. DNase और RNase मुक्त पानी के साथ सीडीएनए 50 गुना पतला और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन करते हैं.
एक मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर मशीन पर प्रोग्राम प्रदर्शन करना. प्रत्येक प्रतिक्रिया GAPDH (प्राइमरों का काम एकाग्रता प्रत्येक प्राइमर के लिए 10 माइक्रोन, CE 500 एनएम थे) के जीन विशिष्ट प्राइमरों या नियंत्रण प्राइमरों की एक जोड़ी के 0.5 μl होता है, SYBR मास्टर मिश्रण के 5 μl और के 4 μl पतला सीडीएनए. एंटीवायरल साइटोकिन्स की mRNA टेप के रिश्तेदार मात्रा निर्धारित करने के लिए ΔΔCt की गणना.

2. एलिसा और QRT-पीसीआर द्वारा MEF सेल संक्रमण और cytokine मात्रा

Mavs ^{+ / +} और Mavs ग्रो ^{- / -} चढ़ाना कोशिकाओं से पहले उप मिला हुआ (लगभग 80%) घनत्व को MEF कोशिकाओं.
12 हम में MEF कोशिकाओं को विभाजितअच्छी तरह से 100,000 कोशिकाओं / (सेल घनत्व दूसरे दिन लगभग 70% हो जाएगा) पर डालूँगा प्लेटें. साइटोकाइन प्रेरण सिंक्रनाइज़ और अधिकतम करने के लिए 5-10 के संक्रमण की बहुलता (MOI) के साथ, triplicates में γHV68 संक्रमण बाहर ले.
वायरस की उचित मात्रा में (प्रत्येक के लिए अच्छी तरह 1 मिलीलीटर) युक्त पूरा DMEM मध्यम में γHV68 निलंबन की तैयारी.
मध्यम निकालें और MEF कोशिकाओं को γHV68 युक्त निलंबन जोड़ें.
, टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली प्लेस हर 30 मिनट रॉक, और ऊष्मायन के 2 घंटे की कुल अनुमति देते हैं.
, ΓHV68 युक्त मध्यम निकालें पीबीएस के साथ एक बार धोने, और ताजा पूरा DMEM के साथ बदलें.
विभिन्न समय पर 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों में बाद संक्रमण, फसल मध्यम बताते हैं. ठंड पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और पाचन trypsin से संक्रमित कोशिकाओं को इकट्ठा.
1.5 कदम के रूप में वर्णित मध्यम में एंटीवायरल साइटोकिन्स उपाय.
, शाही सेना निकालें सीडीएनए तैयार करने और एंटीवायरल साइटोकाइन जीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए QRT-पीसीआर प्रदर्शनकदम 1.5-1.7 में वर्णित है.

3. स्थिर सेल लाइनों का lentivirus उत्पादन, संक्रमण, और जनरेशन

स्प्लिट 293T कोशिकाओं एक दिन अभिकर्मक से पहले और कोशिकाओं अभिकर्मक के समय पर ~ 40% confluency तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं.
पैकेजिंग plasmids (1.2 pVSV जी का ग्राम और 6 ग्राम pDR8.9 की) और 7.2 pCDH-झंडा Mavs या कैल्शियम फॉस्फेट तेज़ी से pCDH नियंत्रण के माइक्रोग्राम साथ 293T कोशिकाओं के 10 सेमी पकवान Transfect.
ताजा पूरा DMEM के साथ 6 से 8 घंटे बाद अभिकर्मक पर मध्यम बदलें.
72 घंटा बाद अभिकर्मक में 0.22 माइक्रोन झिल्ली के साथ मध्यम युक्त lentivirus, 15 मिनट के लिए 4000 XG पर अपकेंद्रित्र, और फिल्टर इकट्ठा. Lentivirus अनुमापांक बढ़ाने के लिए, हम 4 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 घंटे के लिए 110,000 XG पर वायरस युक्त मध्यम अपकेंद्रित्र ध्यान से ब्याज के मध्यम से छोटी मात्रा में वायरल गोली resuspend.
बीज Mavs ^{- / -} MEF कोशिकाओं या अन्य पीटकर MEF कोशिकाओं एक दिन डालो~ 30-40% confluency पर 6 अच्छी तरह प्लेटें में संक्रमण पुनः.
1 मिलीलीटर lentivirus और 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए polybrene के साथ पूरक 2 मिलीलीटर ताजा पूरा DMEM, साथ MEF कोशिकाओं को संक्रमित.
30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 500 XG पर थाली अपकेंद्रित्र और एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली हस्तांतरण.
ताजा पूरा DMEM के साथ 6 घंटे के बाद संक्रमण पर मध्यम बदलें.
स्प्लिट MEF 24 घंटा बाद संक्रमण पर कोशिकाओं और stably Mavs व्यक्त कोशिकाओं का चयन करने के लिए 48 घंटे के बाद संक्रमण पर 1 ग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए puromycin जोड़ें.
Puromycin युक्त मध्यम में MEF कोशिकाओं को बनाए रखने और इसी एंटीबॉडी के साथ immunoblotting द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति सत्यापित.
कोशिकाओं वायरल संक्रमण, साइटोकाइन जीन अभिव्यक्ति और प्रोटोकॉल 2 में वर्णित के रूप में स्राव प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Representative Results

तीन प्रतिनिधि आंकड़े γHV68 संक्रमित Mavs के फेफड़ों में cytokine उत्पादन सहित, यहाँ दिखाए जाते हैं ^{+ / +} और ^{Mavs-/ - / - -} γHV68 संक्रमित Mavs ^{+ / +} और Mavs के माउस, cytokine स्राव और जीन अभिव्यक्ति के स्तर MEFs, और γHV68 संक्रमित Mavs के साइटोकाइन mRNA स्तर ^{- / -} MEFs Mavs के साथ "पुनर्गठन". ये प्रतिनिधि प्रयोगों vivo में एंटीवायरल cytokine उत्पादन जांच और विनियमित cytokine उत्पादन पूर्व vivo के तंत्र को काटना पीटकर MEFs पता लगाने के लिए जीन पीटा चूहों का उपयोग. विशेष रूप से, Mavs के γHV68 संक्रमण ^{- / -} चूहों विवो में CCL5 का काफी अधिक उत्पादन करने के लिए नेतृत्व किया. Mavs ^{- / -} अधिक एंटीवायरल साइटोकाइन उत्पादित MEFs में विवो फेनोटाइप स्मरण दिलाता है जो γHV68 संक्रमण के दौरान Mavs ^{+ + /} MEFs से. "Reconsti"tuted Mavs में Mavs की अभिव्यक्ति ^{- / -} MEFs CCL5 कम उत्पादन की सामूहिक, इन परिणामों γHV68 विवो में और पूर्व vivo दोनों एंटीवायरल cytokine उत्पादन को दबाने के लिए Mavs आवश्यक है कि प्रदर्शित करता है..

चित्रा 1. ^{- / -} चूहों Mavs ^{+ + /} चूहों में है कि अधिक से γHV68 तीव्र संक्रमण Mavs के फेफड़ों में उच्च cytokine उत्पादन प्रेरित किया. उम्र और लिंग मिलान Mavs ^{+ / +} और Mavs ^{- / -} चूहों intranasally बाद संक्रमण एलिसा द्वारा मापा गया था संकेत दिनों में संक्रमित फेफड़े में γHV68 और CCL5 के 40 pfu से संक्रमित थे. Mavs के γHV68 संक्रमण ^{- / -} चूहों एंटीवायरल साइटोकाइन सी की काफी अधिक उत्पादन करने के लिए नेतृत्वΓHV68 एंटीवायरल cytokine उत्पादन को दबाने के लिए Mavs आवश्यक है कि जो सुझाव दिया है CL5,. डाटा मतलब (SEM) के मानक त्रुटि मतलब ± के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. सांख्यिकीय महत्व: *, पी <0.05; **, पी <0.02. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2. ΓHV68 संक्रमण पर, Mavs ^{- / -.} ^{- / -} MEFs Mavs ^{+ + /} MEFs से Mavs ^{+ / +} और Mavs अधिक एंटीवायरल साइटोकाइन उत्पादित सतह पर तैरनेवाला में MEFs γHV68 से संक्रमित थे और संकेत घंटे के बाद संक्रमण (HPI) पर काटा, CCL5 एलिसा मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (बी) द्वारा MEF कोशिकाओं में (ए) और जीन अभिव्यक्ति द्वारा मूल्यांकन किया गया था. गुMavs के ई परिणाम ^{- / - / - -} चूहों γHV68 से संक्रमित MEFs γHV68 संक्रमित Mavs के उन पुनरावृत्ति. डाटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के SEM मतलब ± के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. सांख्यिकीय महत्व:. **, पी <0.02, ***, पी <0.005 बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3. Mavs में Mavs की अभिव्यक्ति "पुनर्गठन" ^{- / -} MEFs CCL5 कम उत्पादन (ए) Mavs ^{-. / -} MEFs नियंत्रण या lentivirus और Mavs की अभिव्यक्ति immunoblotting द्वारा विश्लेषण किया गया था Mavs व्यक्त से संक्रमित थे. (बी) Mavs ^{- / -} Mavs के साथ "पुनर्गठन" MEFs γHV से संक्रमित थे68. MEFs संकेत घंटे के बाद संक्रमण (HPI) पर काटा गया और शाही सेना CCL5 के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया था. डाटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के SEM मतलब ± के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. सांख्यिकीय महत्व:. **, पी <0.02 बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

वायरल प्रतिरक्षा चोरी वायरल अपराध और रक्षा मेजबान ⁹ interfacing सबसे गतिशील और आकर्षक बातचीत में से एक है. मेजबान सहज प्रतिरक्षा घटक संकेत पारगमन प्रभावी ढंग से शुरू किया और ईमानदारी से फैलता है कि इस तरह संरचित कर रहे हैं. Cascades संकेत के पदानुक्रम और विनियमन delineating जन्मजात उन्मुक्ति का एक preeminent विषय है. यहाँ, हम cytokine उत्पादन के वायरल चोरी में एक सहज प्रतिरक्षा घटक, Mavs, के नियामक भूमिकाओं की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल परिचय. प्रोटोकॉल वायरस से संक्रमित माउस में cytokine उत्पादन का निर्धारण करने और MEFs में साइटोकाइन जीन अभिव्यक्ति और उत्पादन का आकलन करने के लिए एक विधि शामिल हैं. जीन पीटा MEFs और माउस vivo और पूर्व vivo में प्रोटीन समारोह के आनुवंशिक और जैव रासायनिक विच्छेदन सक्षम उपकरण है कि प्रदान करते हैं. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और जो की संख्या, एक त्वरक गति से इस जनसंपर्क बढ़ रही हैं, जिनमें से कई आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों, पर बनाotocol आगे जंगली प्रकार या lentivirus द्वारा ब्याज की उत्परिवर्तित प्रोटीन की "पुनर्गठन" अभिव्यक्ति की पड़ताल. सहज प्रतिरक्षा घटकों के "पुनर्गठन" अभिव्यक्ति की संभावित सीमा क्या है वायरल संक्रमण और संकेत पारगमन प्रभाव हो सकता है जो एक्सोजेनस अभिव्यक्ति से चालू होने वाले अवांछित प्रतिरक्षा संकेत है. अंतर्जात स्तर के बराबर अभिव्यक्ति का कम स्तर को प्राप्त करने के लिए अनुकूलन पक्ष प्रभाव को कम कर सकता है. लक्षित "घावों" ले जाने के एक उत्परिवर्ती प्रोटीन प्रयोग किया जाता है घटना में, यह हमें वायरल संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षा विनियमन में एक विशेष डोमेन के समारोह, बाद translational संशोधन, या प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत तुच्छ करने की अनुमति देगा. "पुनर्गठन" कोशिकाओं पीटकर माउस में प्रत्यारोपित कर रहे हैं, चयनित प्रतिरक्षा घटकों या लक्षित उत्परिवर्ती के vivo समारोह की जांच की जा सकती है.

"दस्तक" या उत्परिवर्ती प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति, "reconstit की तुलनाजंगली प्रकार या lentivirus द्वारा ब्याज की उत्परिवर्तित प्रोटीन की uted "अभिव्यक्ति विविध लाभ या हानि के समारोह म्यूटेंट के साथ जांच की अनुमति, और अधिक लागत और समय प्रभावी है. पूरे प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम है कि पुनर्गठन प्रोटीन प्रोटीन एक एंजाइम या प्रतिलेखन कारक है, खासकर जब अंतर्जात प्रोटीन के स्तर के बराबर हो जाना चाहिए. संकेतन मार्ग और अस्पष्ट परिणाम की न्यायपालिका सक्रियण को जन्म दे सकती अधिक अभिव्यक्ति कुछ प्रोटीन की.

हमारे प्रोटोकॉल वजह से बड़े पैमाने γHV68 प्रतिकृति पर सहज प्रतिरक्षा घटक के आंतरिक विनियमन के लिए है जो माउस fibroblasts, पर मुख्य रूप से केंद्रित है, इसी तरह के अनुप्रयोगों बृहतभक्षककोशिका और वृक्ष के समान कोशिकाओं सहित अन्य प्रतिरक्षा घटक, के लिए बढ़ाया जा सकता है. साथ ही, इन तरीकों विविध रोगजनकों entailing यंत्रवत अध्ययनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. आवेदन ¹² में उभर रहा है और संभावना है कि भविष्य में अधिक केंद्र मंचन भूमिकाओं ले जाएगा.

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा.

Acknowledgments

जंगली प्रकार (Mavs ^{+ / +)} और पीटा (Mavs ^{- / -)} चूहों, जंगली प्रकार (Mavs ^{+ / +)} और पीटा (Mavs ^{- / -)} MEFs कृपया डॉ. Zhijian जे चेन (विश्वविद्यालय के द्वारा प्रदान किया गया टेक्सास दक्षिण मेडिकल सेंटर) ^13. इस प्रकाशन एनआईएच (R01 CA134241 और R01 DE021445) और अमेरिकन कैंसर सोसायटी (आर एसजी-11-162-01-एमपीसी) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित काम पर आधारित है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA