Dissezione Innate Immune Signaling in Evasion virale di produzione di citochine

Summary

Descriviamo un protocollo per misurare la produzione di citochina antivirale in topi infettati con un modello herpesvirus, murina gamma herpesvirus 68 (γ HV68) che è strettamente correlata alla associato al sarcoma herpesvirus di Kaposi umano (KSHV) e virus di Epstein-Barr (EBV). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali di topo (MEF), abbiamo valutato la produzione di citochina antivirale sia in vivo e ex vivo. "Ricostituzione" l'espressione di componenti dell'immunità innata a eliminazione diretta fibroblasti embrionali di trasduzione lentivirale, abbiamo ulteriormente individuare specifiche molecole del sistema immunitario innato e sezionare gli eventi di segnalazione chiave che differenziale regolano la produzione di citochine antivirale.

Abstract

In risposta ad una infezione virale, la risposta immunitaria innata host è attivato per up-regolare l'espressione genica e produzione di citochine antivirali. Al contrario, i virus si sono evoluti strategie complesse per eludere e sfruttare ospite segnalazione immune per la sopravvivenza e la propagazione. Viral evasione immune, che comporta la difesa ospite e l'evasione virale, fornisce una delle interfacce più affascinanti e dinamiche di discernere l'interazione ospite-virus. Questi studi ampliano la nostra conoscenza nella regolazione immunitaria innata e spianare la strada per sviluppare nuove terapie antivirali.

Murino γHV68 è un patogeno naturale di roditori murini. γHV68 infezione di topi fornisce un piccolo modello animale trattabili per esaminare la risposta antivirale per KSHV umana e EBV di cui perturbazione vivo interazioni virus-ospite in non è applicabile. Qui si descrive un protocollo per determinare la produzione di citochine antivirale. Questo protocollo può essere adattato ad altre virusi e vie di segnalazione.

Recentemente, abbiamo scoperto che γHV68 dirotta MAVS e IKKβ, componenti immunitarie innate chiave di segnalazione a valle del citosolica RIG-I e md5 se si usano, per abrogare l'attivazione NFΚB e la produzione di citochine antivirali. In particolare, l'infezione γHV68 attiva IKKβ e che IKKβ attivato fosforila RelA per accelerare la degradazione RelA. Come tale, γ HV68 separa in modo efficiente attivazione NFΚB dal suo monte attivato IKKβ, negando l'espressione genica di citochine antivirali. Questo studio chiarisce una strategia complessa per cui l'attivazione immune innata a monte è intercettato da un agente patogeno virale per annullare l'attivazione trascrizionale immediatamente a valle ed evitare la produzione di citochine antivirali.

Introduction

Recenti studi hanno delineato le cascate complessivi segnalazione in montaggio ospite risposte immunitarie innate. Risiedono all'interno compartimenti distinti, i recettori pattern recognition (PRR) individuare pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP) di diversa origine per innescare immunitaria innata di segnalazione ^1. Il gene indotta da acido retinoico I (RIG-I) e differenziazione melanoma antigene (5) md5 se si usano proteine ​​citosoliche sono sensori che riconoscono specie di RNA con specifiche caratteristiche strutturali ^2. Dopo l'attivazione, RIG-I interagisce con i suoi MAVS a valle (noto anche come IPS-1, VISA, e CARDIF) adattatore che, a sua volta, attiva il IKK (IKKαβγ) e la chinasi IKK-correlati (TBK1 e IKKε, noto anche come Ikki ) Complessi ^3-6. Attivato chinasi immunitarie innate fosforilano regolatori chiave di espressione genica, compresi i fattori di trascrizione e loro inibitori, e consentono l'attivazione trascrizionale di geni antivirali ospitante (ad esempio IL6, TNF & #945,, CCL5 e Interferone beta). Queste cascate di segnalazione costituiscono potenti risposte immunitarie innate intrinseche che stabiliscono uno stato anti-microbica per limitare la propagazione dell'agente patogeno durante le prime fasi di infezione.

Murino γHV68 è strettamente legato al oncogeno umano KSHV e EBV. Pertanto, l'infezione di topi γHV68 fornisce un piccolo modello animale trattabili per esaminare la risposta immunitaria al virus herpes gamma in vivo ^7. Usando γHV68, il nostro laboratorio ha scoperto una strategia complessa in cui γHV68 dirotta ospitare segnalazione immunitaria innata per attivare infezione virale. Da un lato, γHV68 attiva il percorso MAVS-IKKβ per promuovere l'attivazione trascrizionale virale tramite dirigere attivato IKKβ di fosforilare transactivator replica (RTA), il fattore di trascrizione chiave per la replicazione virale γHV68 ^8. D'altra parte, la fosforilazione mediata IKKβ innesca RelA per degradazione e termineinates attivazione NFΚB ^9. Come tale, l'infezione γHV68 evita efficacemente la produzione di citochine antivirale. È interessante notare che uno screening che utilizza una libreria di espressione di γHV68 identificato RTA come ligasi E3 per indurre degrado RelA e abolisce l'attivazione NFΚB ^10. Questi risultati scoprire una strategia di evasione immune intricato in cui gli eventi a monte di segnalazione immunitarie vengono sfruttate da γHV68 per negare la finale produzione di citochine antivirali.

Qui si descrive un protocollo per misurare la produzione di citochina antivirale in topi infettati con γHV68 sia in vivo ed ex viv o. Nel protocollo esploriamo ulteriormente l'espressione "ricostituiti" di componenti immunitarie innate nei knockout fibroblasti embrionali da trasduzione lentivirale, che individua la funzione delle specifiche molecole immunitarie innate nella regolazione della produzione di citochine antivirale. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre viruses e vie di segnalazione.

Protocol

Etica Dichiarazione: Tutti i lavori animale è stato eseguito in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC), della University of Southern California.

1. Citochine Gene Expression da Quantitative Real-time PCR e la secrezione da ELISA in topi infettati γHV68

1. Anestetizzare, 6-8 settimane di età C57BL / 6 (B6) fratellini genere abbinato (8-12 topi / gruppo) via intraperitoneale iniettando 1,5 mg di ketamine/0.12 mg di xylazina, e inoculare intranasale con 40 PFU di γHV68 in 40 microlitri (infezione dettagliato in Dong Feng e ^11). In diversi momenti dopo l'infezione, eutanasia i topi utilizzando CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale.
2. Aprite la cassa, con un taglio laterale sinistra lungo la sternum e tagliare le costole con le forbici affilate. Raccogliere i tessuti polmonari.
3. Raccogliere la metà del tessuto polmonare (lobo sinistro) in provette da 1,5 ml con tappo a vite sterili contenenti 500 microlitri 1,0 millimetri perline Zirconia / silice. Aggiungere 1 ml di freddo DMEM privo di siero nella provetta e omogeneizzare il tessuto polmonare da branello-battitura per 30 sec. Chill-tubi sul ghiaccio per 2 minuti e ripetere questo processo una volta.
4. Centrifugare le provette (15.000 x g per 10 min) a 4 ° C, raccogliere il supernatante e misurare la produzione di citochine come descritto di seguito.
5. Misurare citochine utilizzando citochine kit ELISA disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore.
6. Raccogliere l'altra metà del tessuto polmonare (lobo destro) in un altro tubo tallone contenente e aggiungere 1 ml TRIzol. Mescolare e raccogliere il surnatante come descritto al punto 1.3 ed estratto di RNA secondo le istruzioni del produttore. Determinare la concentrazione di RNA prendendo letture di assorbanza a 260 e 280 nm. Preparare cDNA con 1 mg di RNA totale e la trascrittasi inversa secondo le istruzioni del produttore (il volume finale totale era 20 microlitri). Diluire cDNA 50 volte con-DNAse e acqua RNase-free ed effettuare quantitativa real-time PCR.
7. Eseguire il programma su un real-time machine PCR quantitativa. Ciascuna reazione contiene 0,5 ml di una coppia di primer gene-specifici e primer di controllo della GAPDH (la concentrazione di lavoro dei primer erano 10 pM, CE 500 nM per ogni primer), 5 microlitri della master mix SYBR e 4 microlitri della diluiti cDNA. Calcola ΔΔCt per determinare la quantità relativa di mRNA trascritti di citochine antivirali.

2. L'infezione delle cellule MEF e citochine Quantificazione mediante ELISA e qRT-PCR

1. Crescere Mavs ^{+ / +} e Mavs ^{- / -} cellule MEF a sub-confluenti (circa 80%) di densità prima della placcatura cellule.
2. Dividere le celle MEF in 12 abbiamopiastre LL con 100.000 cellule e / (la densità cellulare sarà circa il 70% il secondo giorno). Effettuare infezione γHV68 in triplicato, con una molteplicità di infezione (MOI) di 5-10 per sincronizzare e massimizzare l'induzione di citochine.
3. Preparare la sospensione γHV68 in mezzo completo DMEM contenente adeguata quantità di virus (1 ml per ogni bene).
4. Rimuovere medio e aggiungere γHV68 contenenti sospensione cellule MEF.
5. Porre la piastra in tessuto cultura incubatore, il rock ogni 30 minuti, e permettere un totale di 2 ore di incubazione.
6. Rimuovere medio-γHV68 contenente, lavare una volta con PBS, e sostituirlo con DMEM fresco completo.
7. A diverso tempo punti di post-infezione, medio raccolto in provette da 1,5 ml Eppendorf. Lavare le cellule con PBS freddo e raccogliere le cellule infette da tripsina digestione.
8. Misurare citochine antivirali in mezzo come descritto al punto 1.5.
9. Estrarre RNA, preparare cDNA ed eseguire qRT-PCR per determinare l'espressione genica di citochine antiviralicome descritto ai punti 1.5-1.7.

3. Produzione lentivirus, infezione, e la generazione di linee cellulari stabili

1. Split cellule 293T Un giorno prima trasfezione e permettono alle cellule di raggiungere ~ 40% di confluenza al momento della transfezione.
2. Transfettare 10 centimetri piatto di cellule 293T con i plasmidi di imballaggio (1,2 mg di pVSV-G e 6 mg di pDR8.9) e 7.2 mg di pCDH-FLAG-MAVS o controllo pCDH da fosfato di calcio precipitazione.
3. Sostituire medio a 6-8 ore post-trasfezione con DMEM fresco completo.
4. A 72 ore dopo la trasfezione, raccogliere terreno contenente lentivirus, centrifugare a 4000 xg per 15 min e filtro con 0,22 micron membrana. Per aumentare il titolo lentivirus, si centrifuga il mezzo contenente il virus a 110.000 xg per 2,5 ore a 4 ° C. Risospendere delicatamente il pellet virale in piccolo volume del mezzo di interesse.
5. Mavs Seed ^{- / -} cellule MEF o altre cellule knockout MEF uno giorno before infezione in piastre da 6 pozzetti a ~ 30-40% di confluenza.
6. Infettare le cellule MEF con 1 ml di lentivirus e 2 ml di DMEM fresco completo, integrato con polibrene ad una concentrazione finale di 10 mg / ml.
7. Centrifugare la piastra a 500 xg a 30 ° C per 30 minuti e trasferire la piastra ad un incubatore di coltura tissutale.
8. Sostituire mezzo alle 6 ore post-infezione con DMEM fresco completo.
9. Cellule Split MEF a 24 ore dopo l'infezione e aggiungere puromicina ad una concentrazione finale di 1 mg / ml a 48 ore dopo l'infezione per selezionare le cellule che esprimono stabilmente MAVS.
10. Mantenere le cellule MEF nel medio-puromicina contenimento e verificare l'espressione della proteina mediante immunoblotting con anticorpi corrispondenti.
11. Le cellule possono essere usate per infezione virale, l'espressione genica di citochine e esperimenti secrezione come descritto nel protocollo 2.

Representative Results

Tre figure rappresentative sono mostrati qui, compresa la produzione di citochine nel polmone di Mavs γHV68 infettati ^{Mavs-/ + / +} e ^- del mouse, la secrezione di citochine e l'espressione genica livello di Mavs γHV68 infettati Mavs ^{+ / +} e ^{- / -} MEF, e livelli di mRNA di citochine Mavs γHV68 infettati ^{- / -} MEF "ricostituiti" con MAVS. Questi esperimenti rappresentativi utilizzano gene topi knockout per indagare la produzione di citochine antivirale in vivo ed esplorare MEF knockout per analizzare il meccanismo della produzione di citochine regolamentato ex vivo. In particolare, l'infezione γHV68 di Mavs ^{- / -} topi che hanno portato a significativamente maggiore produzione di CCL5 in vivo. Mavs ^{- / -} MEF prodotti citochina antivirale più di Mavs ^{+ / +} MEF durante l'infezione γHV68, che ricapitola il fenotipo in vivo. "Ricostituzionetuito "espressione di MAVS in Mavs ^{- / -} MEF diminuita produzione CCL5 Collettivamente, questi risultati dimostrano che MAVS è necessario per γHV68 per sopprimere la produzione di citochine antivirali sia in vivo e ex vivo..

Figura 1. γHV68 infezione acuta indotta una maggiore produzione di citochine nei polmoni dei Mavs ^{- / -} topi da quella in Mavs ^{+ / +} mice. -Age e Mavs genere abbinato Mavs ^{+ / +} e ^{- / -} topi sono stati infettati per via intranasale con 40 PFU di γHV68 e CCL5 nei polmoni infetti a giorni indicati dopo l'infezione è stata misurata mediante ELISA. γHV68 infezione di Mavs ^{- / -} mice hanno portato a significativamente più alta produzione di citochine antivirali CCL5, che suggerisce che MAVS è necessario per γHV68 per sopprimere la produzione di citochine antivirale. I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). La significatività statistica: *, p <0.05; **, p <0,02. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2. Dopo l'infezione γHV68, Mavs ^{- / -} MEF prodotti citochina antivirale più di Mavs ^{+ / +} MEF Mavs ^{+ / +} e Mavs ^{-. / -} MEF sono stati infettati con γHV68 e raccolte nelle ore indicate post-infezione (HPI), CCL5 nel surnatante è stata valutata mediante ELISA (A) e l'espressione genica in cellule MEF da quantitativa real-time PCR (B). The risultati di Mavs ^{- / -} MEF infettate con γHV68 ricapitolano quelli di Mavs γHV68-infettati ^{- / -} mice. I dati sono presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. La significatività statistica:. **, P <0.02, ***, p <0.005 Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3. "Ricostituito" espressione di MAVS in Mavs ^{- / -} MEF diminuita produzione CCL5 (A) Mavs ^{-. / -} MEF sono stati infettati con il controllo o MAVS esprimente lentivirus e l'espressione di MAVS è stato analizzato mediante immunoblotting. (B) Mavs ^{- / -} MEF "ricostituiti" con MAVS sono stati infettati con γHV68. MEF sono stati raccolti presso l'indicata infezione ore dopo (HPI) e RNA è stato analizzato mediante quantitativa real-time PCR con primer specifici per CCL5. I dati sono presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. La significatività statistica:. **, P <0.02 Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussion

Viral evasione immune è una delle interazioni più dinamiche e affascinanti interfacciamento attacco virale e ospite difesa ^9. I componenti immunitarie innate ospitanti sono strutturati in modo tale che la trasduzione del segnale sia effettivamente iniziata e fedelmente trasmessa. Delineare la gerarchia e la regolamentazione delle cascate di segnalazione è un tema preminente di immunità innata. Qui, vi presentiamo un protocollo per individuare i ruoli di regolamentazione di un componente immunitaria innata, MAVS, in evasione virale della produzione di citochine. Il protocollo comprende un metodo per determinare la produzione di citochine nel topo infettato da virus e valutare l'espressione genica di citochine e la produzione in MEF. I MEF gene knockout topo e forniscono strumenti che consentono la dissezione genetica e biochimica della funzione della proteina in vivo ed ex vivo. Costruito sui ceppi di topi geneticamente modificati, molti dei quali sono disponibili in commercio e il numero di cui stanno aumentando ad un ritmo accelerato, questo protocol esplora ulteriormente l'espressione "ricostituiti" di wild-type o proteina mutata di interesse da lentivirus. Una potenziale limitazione dell'espressione "ricostituiti" di componenti dell'immunità innata è la segnalazione immune indesiderata innescata da espressione esogena, che possono influire infezione virale e la trasduzione del segnale stesso. Ottimizzazione conseguire basso livello di espressione paragonabili ai livelli endogeni può ridurre l'effetto collaterale. Nel caso in cui viene utilizzata una proteina mutante portando mirati "lesioni", ci permetterà di individuare la funzione di un particolare dominio, modificazione post-traslazionale, o interazioni proteina-proteina nella regolazione immunitaria durante l'infezione virale. Se le cellule "ricostituiti" sono trapiantate in topo knockout, in funzione vivo dei componenti del sistema immunitario selezionati o mutante mirata può essere esaminato.

Rispetto al "knock-in" o l'espressione transgenica di proteine ​​mutanti, "reconstitbuito espressione "di wild-type o proteina mutata di interessi da lentivirus è più economico e time-efficace, consentendo l'indagine con diversi mutanti guadagno o la perdita di funzione. La fase critica di tutto il protocollo è che la proteina ricostituito deve essere comparabile a livello proteico endogeno soprattutto quando la proteina è un enzima o fattore di trascrizione. Over-espressione di alcune proteine ​​possono portare all'attivazione aberrante della via di segnalazione e risultati ambigui.

Anche se il nostro protocollo si concentra principalmente su fibroblasti di topo, che è in gran parte dovuto alla regolazione intrinseca della componente innata sulla replica γHV68, applicazioni simili possono essere estesi ad altri componenti del sistema immunitario, tra cui macrofagi e cellule dendritiche. Inoltre, questi approcci possono essere adattati per studi meccanicistici comportano diversi agenti patogeni. L'applicazione sta emergendo ¹² e probabilmente ci vorranno più ruoli di centro-messo in scena in futuro.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA