Пройдя врожденной иммунной Сигнализация в Вирусный Уклонение продукция цитокинов

Summary

Мы опишем протокол для измерения противовирусной продукцию цитокинов у мышей, инфицированных модельного вируса герпеса, мышиного гамма герпеса 68 (γ HV68), тесно связанных с саркомой-ассоциированный вирус герпеса человеческого Капоши (KSHV) и вирус Эпштейна-Барр (EBV). Используя генетически модифицированные штаммы мыши и мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs), мы оценили противовирусной продукцию цитокинов как в естественных условиях и Экс Vivo. "О восстановлении" выражение врожденных иммунных компонентов в нокаут эмбриональных фибробластов по лентивирусным трансдукции, мы далее определить конкретные врожденные иммунные молекулы и анализировать ключевые события сигнализации, который дифференциально регулируют противовирусной продукцию цитокинов.

Abstract

В ответ на вирусную инфекцию, хост врожденного иммунного ответа активируется, чтобы активируют экспрессию гена и производство противовирусных цитокинов. С другой стороны, вирусы эволюционировали сложные стратегии, чтобы уклониться и эксплуатировать иммунную сигнализации для выживания и размножения. Вирусный иммунная уклонение, влекущие за собой защиту хозяина и вируса с уклонением от уплаты, обеспечивает один из самых увлекательных и динамичных интерфейсов различать хост-вируса взаимодействие. Эти исследования продвижения нашего понимания в врожденной иммунной регуляции и проложить наш путь к развитию новых противовирусные терапии.

Мышиные γHV68 является естественным возбудитель мышевидных грызунов. γHV68 инфекция мышей обеспечивает послушный маленький животную модель для изучения противовирусной ответ на человека KSHV и ВЭБ из которых возмущение в естественных условиях вирус-хозяин взаимодействий является не применяется. Здесь мы опишем протокол для определения противовирусной продукцию цитокинов. Этот протокол может быть адаптирован к другой Virиспользует и сигнальных путей.

В последнее время мы обнаружили, что γHV68 захватывает Mavs и IKKβ, ключевые врожденные компоненты иммунной сигнализации вниз по течению от цитозольным RIG-I и MDA5, отменить активацию NFΚB и противовирусной продукцию цитокинов. В частности, γHV68 инфекция активизирует IKKβ и что активируется IKKβ фосфорилирует отношений ускорить деградацию отношений. Таким образом, γ HV68 эффективно отсоединяет активации NFΚB от своего вышестоящего активированного IKKβ, отрицая выражение противовирусной генов цитокинов. Это исследование проливает свет сложную стратегию в результате чего перед врожденная иммунная активация перехвачены вирусной возбудителя свести на нет немедленного активацию вниз по течению транскрипции и уклониться от противовирусной продукцию цитокинов.

Introduction

Недавние исследования изложены общие сигнальных каскадов по монтажу узлов врожденные иммунные реакции. Проживание в отдельных отсеках, рецепторы распознавания образов (РРСС) обнаружения патогенов связанных молекулярных моделей (PAMPs) различного происхождения, чтобы вызвать врожденные иммунные сигнализации ^1. Ген ретиноевой кислоты, вызванной я (RIG-I) и дифференциация антигена меланомы 5 (MDA5) белки цитозольные датчики, которые распознают РНК видов с определенными структурными особенностями ^2. После активации RIG-I взаимодействует со своими вниз по течению MAVS (также известный как IPS-1, VISA, и Кардиф) адаптера, что, в свою очередь, активирует IKK (IKKαβγ) и IKK связанных киназы (TBK1 и IKKε, также известный как IKKI ) комплексы ^3-6. Активированные врожденной иммунной киназы фосфорилировать ключевых регуляторов экспрессии генов, в том числе факторов транскрипции и их ингибиторов, а также включить активацию транскрипции генов хост противовирусных (например, IL-6, TNF и #945;, CCL5 и IFNβ). Эти сигнальные каскады представляют собой мощные внутренние врожденные иммунные реакции, которые устанавливают антимикробного состояние ограничить распространение патогенных микроорганизмов на ранних стадиях инфекции.

Мышиные γHV68 тесно связана с человеческой онкогенного KSHV и ВЭБ. Таким образом, γHV68 инфекция мышей обеспечивает послушный маленький животную модель для изучения иммунного ответа на вирус герпеса гамма-инфекции в естественных условиях ^7. Использование γHV68, наша лаборатория обнаружила сложную стратегию которой γHV68 захватывает пройдет врожденную иммунную сигнализации для включения вирусной инфекции. С одной стороны, γHV68 активирует путь MAVS-IKKβ способствовать активизации вирусной транскрипции через направляя активированный IKKβ фосфорилировать трансактиватор репликации (RTA), вирусный ключевым фактором транскрипции для γHV68 репликации ^8. С другой стороны, IKKβ-опосредованного фосфорилирования простые числа отношений для деградации и срокinates NFΚB активации ^9. Таким образом, γHV68 инфекция эффективно предотвращает противовирусной продукцию цитокинов. Интересно, что скрининг с использованием выражения библиотеку γHV68 определены RTA как E3 лигазы индуцировать деградацию отношений и отменить активацию NFΚB ^10. Эти выводы раскрыть сложную стратегию иммунную уклонение которой вверх по течению событий иммунные сигнальные запряженной γHV68 отрицать конечную противовирусной продукцию цитокинов.

Здесь мы опишем протокол для измерения антивирусной продукции цитокинов у мышей, инфицированных γHV68 как в естественных условиях и экс Львов о. В протоколе мы дополнительно изучить "восстановленного" выражение врожденных иммунных компонентов в плей-эмбриональных фибробластов на лентивирусным трансдукции, которая выявляет функцию специфических врожденных иммунных молекул в регуляции противовирусной продукцию цитокинов. Этот протокол может быть легко адаптирована к другой ВируСЭС и сигнальные пути.

Protocol

Заявление по этике: Все животные Работа выполнена при строгом соответствии с рекомендациями, содержащимися в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных Институтов Здоровья. Протокол был утвержден на уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) из Университета Южной Калифорнии.

1. Цитокинов экспрессии генов с помощью количественного ПЦР в реальном времени и секреции методом ИФА в γHV68-инфицированных мышей

1. Обезболить гендерные соответствием, 6-8 недельного возраста C57BL / 6 (B6) однопометными (8-12 мышей / группа) через внутрибрюшинно инъекционных 1,5 мг ketamine/0.12 мг ксилазина, и привить интраназально 40 БОЕ γHV68 в 40 мкл (инфекция подробно описано в Dong Feng и ^11). В различные моменты времени после инфицирования мышей эвтаназии с помощью CO ₂ ингаляции с последующим смещением шейных позвонков.
2. Откройте сундук с левой боковой разрезом вдоль стерпит и разрезать ребра с острыми ножницами. Соберите легочной ткани.
3. Соберите половину легочной ткани (левой доли) в стерильные 1,5 мл с завинчивающейся крышкой пробирки, содержащие 500 мкл 1,0 мм циркония / Silica бусы. Добавить 1 мл холодной свободной от сыворотки DMEM в трубку и гомогенизации ткани легких на шарик-биения на 30 сек. Охладить пробирки во льду в течение 2 мин и повторить этот процесс один раз.
4. Центрифуга трубки (15000 х г в течение 10 мин) при 4 ° С, собирают супернатант и измерить продукцию цитокинов, как описано ниже.
5. Измерьте цитокины с использованием коммерчески доступных цитокинов ELISA комплектов в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
6. Соберите вторую половину легочной ткани (правой доли) в другое борта содержащих трубки и добавить 1 мл TRIzol. Гомогенизируют и собирать супернатант как описано в шаге 1.3 и экстракта РНК в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Определить концентрацию РНК, взяв оптической плотности при 260 и 280 нм. Подготовка кДНК 1 мкг тотальной РНК и обратной транскриптазы в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (общий конечный объем составил 20 мкл). Развести кДНК 50 раз с ДНКазой-и РНК-азы-свободной воды и выполнять количественный ПЦР в реальном времени.
7. Выполнение программы на количественной ПЦР в реальном времени машины. Каждую реакционную содержит 0,5 мкл пары ген-специфических праймеров или контрольных праймеров GAPDH (рабочий концентрации праймеров были 10 мкМ, CE 500 нМ каждого праймера), 5 мкл SYBR мастер-смеси и 4 мкл разбавленного кДНК. Рассчитать ΔΔCt для определения относительного количества транскриптов мРНК противовирусных цитокинов.

2. MEF Инфекция клеток и цитокинов Количественное по ELISA и Qrt-PCR

1. Расти Mavs ^{+ / +} и Mavs ^{- / -} MEF клетки к югу от сливной (примерно 80%) плотности до посева клеток.
2. Сплит MEF клетки в 12-мыLL планшеты при 100000 клеток / лунку (плотность клеток будет около 70% на второй день). Провести γHV68 инфекцию в трех экземплярах, с множественностью заражения (МВД) 5-10 синхронизации и максимально индукцию цитокинов.
3. Подготовка γHV68 суспензии в полной среде, содержащей DMEM соответствующее количество вируса (1 мл на каждую лунку).
4. Удалите среду и добавить γHV68-содержащий суспензии для MEF клеток.
5. Место пластины в культуре ткани инкубаторе, рок каждые 30 мин, и позволит в общей сложности 2 ч инкубации.
6. Удалить γHV68-среде, содержащей, мыть один раз с PBS, и заменить свежей полной DMEM.
7. В разное время указывает пост-инфекцию, урожай среды в 1,5 мл пробирки Эппендорф. Вымойте клеток с холодным ФСБ и собирать инфицированные клетки трипсином пищеварение.
8. Измерение противовирусные цитокины в среде, как описано на стадии 1.5.
9. Извлечение РНК, подготовить кДНК и выполнять Qrt-ПЦР для определения противовирусной экспрессию генов цитокиновкак описано в шагах 1,5-1,7.

3. Лентивирус Производство, инфекция, и генерация стабильных клеточных линий

1. Сплит клетки 293Т один день до трансфекции и позволяют клеткам достигать ~ 40% слияния во время трансфекции.
2. Трансфекции 10 см блюдо 293Т с упаковки плазмид (1,2 мкг pVSV-G и 6 мкг pDR8.9) и 7,2 мкг PCDH-Flag-MAVS или контроля PCDH по фосфата кальция осадков.
3. Замена среды в 6 до 8 ч после трансфекции с свежей полной среды DMEM.
4. На 72 ч после трансфекции, собирают среду, содержащую лентивирус, центрифуге при 4000 х г в течение 15 мин, а фильтр с размером пор 0,22 мкм мембрану. Для увеличения титра лентивирусов, центрифуге мы Содержащую вирус среду при 110000 х г в течение 2,5 ч при 4 ° С. Осторожно ресуспендируют осадок в вирусную небольшом объеме среды, представляющей интерес.
5. Семенной Mavs ^{- / -} MEF клетки или другие нокаутом MEF клетки в один прекрасный день Befoповторно инфекции в 6-луночных планшетах в ~ 30-40% слияния.
6. Infect MEF клеток с 1 мл лентивирусов и 2 мл свежей полной среды DMEM, дополненной полибрена до конечной концентрации 10 мкг / мл.
7. Центрифуга пластины при 500 х г при 30 ° С в течение 30 мин и передавать пластину в инкубаторе для тканевых культур.
8. Замена среды через 6 ч после инфицирования свежей полной среды DMEM.
9. Split MEF клетки через 24 часа после заражения и добавить пуромицин в конечной концентрации 1 мкг / мл через 48 часов после инфицирования, чтобы выбрать клетки, стабильно экспрессирующие Mavs.
10. Поддерживать MEF клеток в пуромицина среде, содержащей и проверить экспрессию белка иммуноблоттингом с соответствующих антител.
11. Клетки могут быть использованы для вирусной инфекции, экспрессии генов цитокинов и секрецию экспериментов, описанных в протокола 2.

Representative Results

Три представительные фигуры показаны здесь, в том числе продукции цитокинов в легких γHV68-инфицированных Mavs ^{+ / +} и ^{Mavs-/ -} мышей, секреции цитокинов и экспрессии генов уровень γHV68-инфицированных Mavs ^{+ / +} и Mavs ^{- / -} MEFs и уровни цитокинов мРНК γHV68-инфицированных Mavs ^{- / -} MEFs "восстановленный" с MAVS. Эти представительные эксперименты использовать мышей с нокаутом гена исследовать противовирусную продукцию цитокинов в естественных условиях и изучить нокаутом MEFs рассекать механизм регулируемого продукции цитокинов экс естественных условиях. В частности, γHV68 инфекция Mavs ^{- / -} мышей привело к значительно выше производство CCL5 в естественных условиях. Mavs ^{- / -} MEFs произведенные более противовирусной цитокин, чем Mavs ^{+ / +} MEFs во γHV68 инфекции, которая повторяет фенотип в естественных условиях. "Reconstituted "выражение MAVS в Mavs ^{- / -} MEFs снижение производства CCL5 В совокупности эти результаты показывают, что MAVS необходимо для γHV68 для подавления противовирусной продукцию цитокинов как в естественных и экс виво..

Рисунок 1. γHV68 острая инфекция индуцированных высокий продукцию цитокинов в легких Mavs ^{- / -} мыши, чем в ^{+ / +} мышей Mavs. Возраст и пол соответствием Mavs ^{+ / +} и Mavs ^{- / -} мышей интраназально инфицированных 40 БОЕ γHV68 и CCL5 в зараженных легких при указанные дни после заражения измерялась ELISA. γHV68 инфекция Mavs ^{- / -} мышей привело к значительно выше производство противовирусных цитокинов CCL5, который предположил, что MAVS необходимо для γHV68 для подавления противовирусной продукцию цитокинов. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Статистическая значимость: *, р <0,05; **, р <0,02. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 2. По γHV68 инфекции, Mavs ^{- / -} MEFs производится более противовирусной цитокин, чем Mavs ^{+ / +} MEFs Mavs ^{+ / +} и Mavs ^{-. / -} MEFs были инфицированы γHV68 и заготовленной в указанных часов после заражения (HPI), CCL5 в супернатанте оценивали с помощью ELISA (A) и экспрессии генов в клетках MEF с помощью количественной ПЦР в реальном времени (B). Чте результаты Mavs ^{- / -} MEFs инфицированные γHV68 резюмировать те из γHV68-инфицированных Mavs ^{- / -} мышей. Данные представлены как среднее ± SEM из трех независимых экспериментов. Статистическая значимость:. **, Р <0,02, *** р <0,005 Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3. "Восстановленный" выражение MAVS в Mavs ^{- / -} MEFs снижение производства CCL5 (A) Mavs ^{-. / -} MEFs были инфицированы управления или MAVS экспрессирующих лентивирусов и выражение MAVS анализировали с помощью иммуноблоттинга. (В) Mavs ^{- / -} MEFs "восстановленный" с MAVS были инфицированы γHV68. MEFs собирали в указанном часов после инфицирования (HPI) и РНК анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными к CCL5. Данные представлены как среднее ± SEM из трех независимых экспериментов. Статистическая значимость:. **, Р <0,02 Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

Discussion

Вирусный иммунная уклонение является одним из самых динамичных и увлекательных взаимодействий, взаимодействующими вирусной преступление и защиту хозяина ^9. Принимающие врожденные иммунные компоненты структурированы таким образом, что передача сигнала эффективно инициировал и добросовестно передается. Разграничения иерархию и регулирование сигнальных каскадов является выдающимся темой врожденного иммунитета. Здесь мы представляем протокол для определения нормативных роли врожденной иммунной компонента, MAVS, вирусной уклонение от продукции цитокинов. Протокол включает в себя способ, определяющий выработку цитокинов инфицированных вирусом мыши и оценки экспрессии генов цитокинов и производство в MEFs. Генные нокаут MEFs и мыши, обеспечивает инструменты, которые позволяют генетический и биохимический рассечение функции белка в естественных условиях и экс естественных. Построенный на генетически модифицированных линий мышей, многие из которых имеются в продаже и число которых растут более быстрыми темпами, это пр.otocol далее исследует «восстановленного» выражение дикого типа или мутантного белка интереса со стороны лентивирус. Одним из потенциальных ограничение "восстановленного" выражением врожденного иммунитета компонентов является нежелательным иммунная сигнализации вызвано экзогенной экспрессии, которые могут повлиять вирусную инфекцию и передачу сигнала их. Оптимизация для достижения низкого уровня экспрессии, сравнимой с уровня эндогенного может уменьшить побочный эффект. В случае мутантный белок проведения целевых "поражения" используется, это позволит нам точно определить функцию конкретного домена, посттрансляционную модификацию или белок-белковых взаимодействий в иммунной регуляции во время вирусной инфекции. Если "восстановленные" клетки пересаживают в нокаут мыши, в естественных условиях функция выбранных иммунных компонентов или целевой мутанта могут быть рассмотрены.

По сравнению с "забивные" или трансгенной экспрессии мутантных белков, "reconstituted "выражением дикого типа или мутантного белка интереса со стороны лентивирус является экономически более и время эффективным, позволяя расследование с различными амплитудно-или с потерей функции мутантов. важным шагом для всего протокола является то, что восстановленный белок должны быть сопоставимы с эндогенным уровнем белка, особенно когда белок является ферментом, или фактор транскрипции. Избыточная экспрессия некоторых белков может приводить к аномальной активации сигнального пути и неоднозначных результатов.

Хотя наш протокол фокусируется в основном на мышиных фибробластов, которые в значительной степени из-за внутренней регуляции иммунной компонента на γHV68 репликации, подобные приложения могут быть распространены на других иммунных составляющих, в том числе макрофагов и дендритных клеток. Кроме того, эти подходы могут быть адаптированы к механистических исследований, влекущих различные болезнетворные микроорганизмы. Приложение становится ¹² и, вероятно, потребуется несколько ролей центр-устроили в будущем.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA