La disección de señalización inmune innata en Evasion Viral de la producción de citoquinas

Summary

Se describe un protocolo para medir la producción de citoquinas antivirales en ratones infectados con un virus herpes modelo, murino herpesvirus gamma 68 (γ HV68) que está relacionado con estrechamente a sarcoma de herpesvirus asociado de Kaposi humano (VHSK) y virus de Epstein-Barr (EBV). La utilización de cepas de ratones genéticamente modificados y los fibroblastos de embriones de ratón (MEFs), se evaluó la producción de citocina antiviral tanto in vivo como ex vivo. "Reconstituir" la expresión de los componentes inmunes innatas en eliminatorias fibroblastos embrionarios de transducción lentiviral, Señalamos además moléculas inmunes innatas específicas y diseccionar los eventos de señalización clave que regulan diferencialmente la producción de citocina antiviral.

Abstract

En respuesta a una infección viral, la respuesta inmune innata de acogida se activa para regular por incremento la expresión génica y la producción de citoquinas antivirales. Por el contrario, los virus han desarrollado estrategias complejas para evadir y explotar la señalización inmune del huésped para la supervivencia y propagación. Evasión inmune viral, lo que implica la defensa del huésped y la evasión viral, ofrece una de las interfaces más fascinantes y dinámicos para discernir la interacción huésped-virus. Estos estudios avanzan nuestros conocimientos en la regulación inmune innata y allanan el camino para desarrollar nuevas terapias antivirales.

Murino HV68 es un patógeno natural de los roedores murinos. HV68 infección de ratones como modelo animal pequeño manejable para examinar la respuesta antiviral a HVSK humana y VEB de que la perturbación de la in vivo interacciones virus-huésped no es aplicable. Aquí se describe un protocolo para determinar la producción de citoquinas antivirales. Este protocolo se puede adaptar a otros Virusos y las vías de señalización.

Recientemente, se ha descubierto que HV68 secuestra MAVS y IKKβ, componentes inmunes innatas clave de señalización corriente abajo de la citosólica RIG-I y MDA5, se decida suprimir la activación de NFkB y la producción de citoquinas antivirales. Específicamente, la infección activa HV68 IKKβ y que IKKβ activado fosforila relación a acelerar la degradación de RelA. Como tal, γ HV68 desacopla eficazmente la activación de NFkB de su ascendente IKKβ activado, negando antiviral expresión génica de citocinas. Este estudio aclara una estrategia compleja por lo que la activación inmune innata aguas arriba es interceptada por un patógeno viral para anular la activación transcripcional intermedio inmediato y evadir la producción de citoquinas antivirales.

Introduction

Estudios recientes han indicado las cascadas de señalización en general en el montaje de acogida la respuesta inmune innata. Residiendo en compartimentos distintos, los receptores de reconocimiento de patrones (RRP) detectar patógenos asociados a patrones moleculares (PAMP) de diverso origen para desencadenar inmune innato señalización ^1. El gen inducida por ácido retinoico-I (GAR-I) y antígeno de diferenciación de melanoma (5) MDA5 proteínas citosólicas son sensores que reconocen especies de ARN con características estructurales específicas ^2. Después de la activación, RIG-I interactúa con sus MAVS aguas abajo (también conocido como IPS-1, VISA y CARDIF) adaptador que, a su vez, activa la IKK (IKKαβγ) y relacionados con IKK-quinasa (TBK1 y IKKε, también conocido como Ikki ) Los complejos de ^3-6. Quinasas activadas fosforilan inmunes innatas reguladores clave de la expresión génica, incluyendo factores de transcripción y los inhibidores de los mismos, y permiten la activación transcripcional de los genes antivirales de acogida (por ejemplo, IL-6, TNF & #945;, CCL5, y IFNß). Estas cascadas de señalización constituyen potentes respuestas inmunes innatas intrínsecas que establecen un estado anti-microbiana para restringir la propagación de patógenos durante las primeras etapas de la infección.

Murino HV68 está estrechamente relacionado con oncogénico VHSK humana y VEB. Así, la infección de los ratones HV68 proporciona un modelo animal pequeño manejable para examinar la respuesta inmune del huésped a la infección por virus del herpes gamma in vivo ^7. Usando HV68, nuestro laboratorio ha descubierto una estrategia compleja cual HV68 secuestra albergar señalización inmune innata para permitir la infección viral. Por un lado, HV68 activa la vía MAVS-IKKβ para promover la activación de la transcripción viral a través de la dirección de IKKβ activado para fosforilar transactivador la replicación (ACR), el factor de transcripción clave para la replicación viral HV68 ^8. Por otra parte, la fosforilación mediada por IKKβ prepara de RelA para la degradación y plazoinates activación de NFkB ^9. Como tal, la infección HV68 evita con eficacia la producción de citoquinas antivirales. Curiosamente, una proyección que utiliza una biblioteca de expresión de la HV68 identificó RTA como una ligasa E3 para inducir la degradación de RelA y suprimirá la activación de NFkB ^10. Estos resultados descubren una estrategia de evasión inmune compleja mediante el cual los eventos de señalización inmune aguas arriba son aprovechados por HV68 para negar lo último la producción de citoquinas antivirales.

Aquí se describe un protocolo para medir la producción de citoquinas antivirales en ratones infectados con HV68 tanto in vivo como ex viv o. En el protocolo se explora aún más la expresión "reconstituido" de los componentes de la inmunidad innata en los fibroblastos de embriones knockout mediante transducción lentiviral, que establece claramente la función de las moléculas inmunes innatas específicas en la regulación de la producción de citoquinas antivirales. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otros viruses y vías de señalización.

Protocol

Declaración de Ética: Todo animal de trabajo se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) de la Universidad del Sur de California.

1. Cytokine Gene Expression Cuantitativo en tiempo real PCR y secreción por ELISA en ratones infectados-HV68

1. Anestesie, 6-8 semanas de edad C57BL / 6 de camada (B6) emparejados por sexo (8-12 ratones / grupo) a través de la inyección intraperitoneal de 1,5 mg de ketamine/0.12 mg de xilazina, e inocular por vía intranasal con 40 UFP de HV68 en 40 l (infección se detalla en el Dong Feng y ^11). En diferentes puntos de tiempo después de la infección, la eutanasia a los ratones mediante inhalación de CO ₂ seguido por dislocación cervical.
2. Abre el cofre con un corte lateral izquierda por el sternum y cortar a través de las costillas con unas tijeras afiladas. Recoge los tejidos pulmonares.
3. Recoger medio del tejido pulmonar (lóbulo izquierdo) en tubos de 1,5 ml con tapón de rosca estériles que contienen 500 l 1,0 mm perlas de zirconia / sílice. Añadir 1 ml de DMEM libre de suero frío en el tubo y homogeneizar el tejido pulmonar por el grano que el maltrato durante 30 segundos. Chill tubos en hielo durante 2 minutos y repetir este proceso una vez.
4. Centrifugar los tubos (15.000 x g durante 10 min) a 4 ° C, recoger el sobrenadante y medir la producción de citoquinas como se describe a continuación.
5. Medir citoquinas utilizando kits de ELISA de citoquinas disponibles en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
6. Recoger la otra mitad del tejido pulmonar (lóbulo derecho) en otro tubo que contiene perlas y añadir 1 ml de TRIzol. Homogeneizar y se recoge el sobrenadante como se describe en el paso 1.3 y ARN extracto de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determinar la concentración de ARN mediante la adopción de las lecturas de absorbancia a 260 y 280 nm. Preparar ADNc con 1 g de ARN total y la transcriptasa inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (el volumen final total fue de 20 l). Diluir cDNA 50 veces con DNasa y RNasa libre de agua y llevar a cabo cuantitativa en tiempo real PCR.
7. Lleve a cabo el programa en un tiempo real de la máquina de PCR cuantitativa. Cada reacción contiene 0,5 l de un par de cebadores específicos de gen o cebadores de control de GAPDH (la concentración de trabajo de los cebadores eran 10 mM, CE 500 nM para cada cebador), 5 l de la mezcla maestra de SYBR y 4 l de la diluyeron ADNc. Calcular ΔΔCt para determinar la cantidad relativa de transcritos de ARNm de citoquinas antivirales.

2. La infección de la célula MEF y citoquinas cuantificación por ELISA y QRT-PCR

1. Crecer Mavs ^{+ / +} y Mavs ^{- / -} células MEF a sub-confluente (aproximadamente el 80%) la densidad de las placas, las células.
2. Dividir células MEF en 12-queplacas ll en 100.000 células / pocillo (la densidad celular será de alrededor de 70% en el segundo día). Llevar a cabo la infección HV68 por triplicado, con una multiplicidad de infección (MOI) de 5-10 para sincronizar y maximizar la inducción de citoquinas.
3. Preparar HV68 suspensión en medio DMEM completo que contiene la cantidad adecuada de virus (1 ml para cada pocillo).
4. Retire medio y agregue HV68-que contiene la suspensión de células MEF.
5. Colocar la placa en el cultivo de tejidos incubadora, el rock cada 30 minutos, y permitir un total de 2 horas de incubación.
6. Retire el medio que contiene HV68-, lavar una vez con PBS, y reemplazar con DMEM completo fresco.
7. En varios puntos de tiempo después de la infección, el medio de la cosecha en 1,5 ml de tubos de Eppendorf. Lavar las células con PBS frío y recoger las células infectadas por digestión con tripsina.
8. Mida citocinas antivirales en un medio tal como se describe en el paso 1.5.
9. Extraer el ARN, ADNc preparar y realizar QRT-PCR para determinar la expresión de genes de citocina antiviralcomo se describe en los pasos 1.5 hasta 1.7.

3. Producción lentivirus, Infección, y Generación de líneas celulares estables

1. Dividir las células 293T un día antes de la transfección y permiten que las células lleguen a ~ 40% de confluencia en el momento de la transfección.
2. Transfectar 10 cm placa de células 293T con los plásmidos de embalaje (1,2 microgramos de pVSV-G y 6 g de pDR8.9) y 7,2 g de Pcdh-Bandera-MAVS o el control Pcdh por precipitación de fosfato de calcio.
3. Reemplazar medio a 6 a 8 horas después de la transfección con DMEM completo fresco.
4. En 72 horas después de la transfección, recoger medio que contiene lentivirus, centrifugar a 4000 xg durante 15 min, y el filtro con 0,22 m de membrana. Para aumentar el título de lentivirus, que centrífuga el medio que contiene el virus a 110.000 xg durante 2,5 horas a 4 ° C. Resuspender cuidadosamente el sedimento viral en pequeño volumen de medio de interés.
5. Mavs Seed ^{- / -} MEF células u otras células MEF nocaut un día before infección en placas de 6 pocillos a ~ 30-40% de confluencia.
6. Infectar las células MEF con 1 ml de lentivirus y 2 ml de DMEM completo fresco, suplementado con polibreno a una concentración final de 10 mg / ml.
7. Centrifugar la placa a 500 xg a 30 º C durante 30 min y transferir la placa a una incubadora de cultivo de tejidos.
8. Reemplace medio a 6 horas después de la infección con DMEM completo fresco.
9. Dividir las células MEF en 24 horas después de la infección y se suman a la puromicina a una concentración final de 1 mg / ml a las 48 horas después de la infección para seleccionar las células que expresan de forma estable MAVS.
10. Mantener MEF células en medio que contenía puromicina y verificar la expresión de proteínas por inmunotransferencia con anticuerpos correspondientes.
11. Las células se pueden utilizar para la infección viral, la expresión de genes de citoquinas y la secreción de experimentos como se describe en el Protocolo 2.

Representative Results

Tres figuras representativas se muestran aquí, incluyendo la producción de citoquinas en el pulmón de Mavs infectados-HV68 ^{+ / +} y ^{Mavs-/ -} ratón, la secreción de citoquinas y la expresión génica nivel de Mavs infectados-HV68 ^{+ / +} y Mavs ^{- / -} MEFs, y niveles de citoquinas mRNA de Mavs infectadas HV68 ^{- / -} MEFs "reconstituidas" con MAVS. Estos experimentos representativos utilizan ratones knockout de genes para investigar la producción de citoquinas antiviral in vivo y explorar MEFs knockout para diseccionar el mecanismo de la producción de citoquinas regulado ex vivo. Específicamente, la infección HV68 de Mavs ^{- / -} ratones condujo a una producción notablemente mayor de CCL5 in vivo. Mavs ^{- / -} MEFs producidos citocina antiviral más de Mavs ^{+ / +} MEFs durante la infección HV68, que recapitula el fenotipo in vivo. "Reconstitucióntuido "expresión de MAVS en Mavs ^{- / -} MEFs disminución de la producción CCL5 Colectivamente, estos resultados demuestran que MAVS es necesario para HV68 para suprimir la producción de citoquinas antivirales tanto in vivo como ex vivo..

Figura 1. HV68 infección aguda induce una mayor producción de citoquinas en los pulmones de los Mavs ^{- / -} ratones que en Mavs ^{+ / +} ratones. Edad y Mavs el sexo con ajuste ^{+ / +} y Mavs ^{- / -} ratones fueron infectados por vía intranasal con 40 UFP de HV68 y CCL5 en los pulmones infectados en días indicados después de la infección se midió por ELISA. HV68 infección de Mavs ^{- / -} ratones dio lugar a significativamente mayor producción de citocina antiviral CCL5, lo que sugiere que MAVS es necesario para la HV68 para suprimir la producción de citoquinas antivirales. Los datos se presentan como la media ± el error estándar de la media (SEM). La significación estadística: *, p <0,05; **, p <0,02. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 2. Tras la infección HV68, Mavs ^{- / -} MEFs producen citoquinas más antiviral que Mavs ^{+ / +} MEFs Mavs ^{+ / +} y Mavs ^{-. / -} MEFs fueron infectadas con HV68 y cosechados en las horas indicadas después de la infección (hpi), CCL5 en el sobrenadante se evaluó por ELISA (A) y la expresión de genes en células MEF por cuantitativa en tiempo real PCR (B). The resultados de Mavs ^{- / -} MEFs infectadas con HV68 recapitulan los de Mavs infectadas HV68 ^{- / -} ratones. Los datos se presentan como la media ± SEM de tres experimentos independientes. La significación estadística:. **, P <0,02, *** p <0,005 clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 3. "Reconstituido" expresión de MAVS en Mavs ^{- / -} MEFs disminución de la producción CCL5 (A) Mavs ^{-. / -} MEFs fueron infectadas con el control o MAVS-expresión de los lentivirus y la expresión de MAVS se analizaron por inmunotransferencia. (B) Mavs ^{- / -} MEFs "reconstituido" con MAVS estaban infectados con γHV68. MEFs fueron cosechadas en la infección de horas después de la indicada (hpi) y el ARN fue analizado por cuantitativa en tiempo real PCR con cebadores específicos para CCL5. Los datos se presentan como la media ± SEM de tres experimentos independientes. La significación estadística:. **, P <0,02 Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Discussion

Evasión inmune viral es una de las interacciones más dinámicas y fascinantes interfaces delito viral y la defensa de acogida ^9. Los componentes de la inmunidad innata de acogida están estructurados de tal manera que la transducción de señales que se inicie de manera efectiva y transmitida fielmente. Delimitación de la jerarquía y la regulación de las cascadas de señalización es un tema prominente de la inmunidad innata. Aquí, presentamos un protocolo para identificar las funciones de regulación de un componente inmunitario innato, MAVS, en la evasión viral de la producción de citoquinas. El protocolo comprende un método para determinar la producción de citoquinas en el ratón infectado por virus y la evaluación de la expresión de genes de citoquinas y la producción en MEFs. Los MEFs knockout del gen y del ratón proporcionan herramientas que permiten la disección genética y bioquímica de la función de las proteínas in vivo y ex vivo. Construido sobre las cepas de ratones genéticamente modificados, muchos de los cuales están disponibles en el mercado y el número de las que están aumentando a un ritmo acelerado, este protocol explora aún más la expresión "reconstituido" de tipo salvaje o mutantes de proteínas de interés mediante lentivirus. Una posible limitación de la expresión "reconstituido" de los componentes de la inmunidad innata es la señalización inmune no deseada provocada por la expresión exógena, lo que puede afectar la infección viral y la transducción de señales de los mismos. Optimización de lograr bajo nivel de expresión comparables a los niveles endógenos puede reducir el efecto secundario. En el evento se utiliza una proteína mutante que lleva dirigidos "lesiones", que nos permitirá establecer con exactitud la función de un dominio en particular, la modificación posterior a la traducción, o la interacción proteína-proteína en la regulación inmune durante la infección viral. Si las células "reconstituidas" se trasplantan en ratón knockout, la función in vivo de los componentes inmunes seleccionados o mutante dirigido puede ser examinado.

En comparación con el "knock-in" o la expresión transgénica de proteínas mutantes, "reconstitbuido expresión "de tipo salvaje o mutantes de proteínas de interés mediante lentivirus es más económico y eficaz en el tiempo, lo que permite la investigación con diversos mutantes de ganancia o pérdida de la función. El paso crítico de todo el protocolo es que la proteína reconstituida deben ser comparables a nivel de la proteína endógena, especialmente cuando la proteína es una enzima o factor de transcripción. El exceso de expresión de algunas proteínas puede conducir a la activación aberrante de la vía de señalización y resultados ambiguos.

Aunque el protocolo se centra principalmente en fibroblastos de ratón, que es en gran parte debido a la regulación intrínseca del componente inmune innato en la replicación HV68, aplicaciones similares pueden extenderse a otros componentes inmunes, incluyendo los macrófagos y las células dendríticas. Además, estos enfoques pueden ser adaptados a los estudios mecanísticos que implican diversos patógenos. La aplicación se está convirtiendo ¹² y es probable que tome más roles de centroizquierda por etapas en el futuro.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA