Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

Summary

İnsan Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) ve Epstein-Barr virüsü (EBV) ile yakından ilgili olan bir model herpesvirüs, kemirgen gamma herpes virüsü 68 (γ HV68) ile enfekte olan fareler içindeki antiviral sitokin üretimini ölçmek için bir protokolü tarif eder. Genetik olarak modifiye edilmiş olan fare soyları ve fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) kullanarak, biz antiviral sitokin üretimini in vivo ve ex vivo hem de değerlendirildi. Lentiviral transdüksiyonu ile nakavt embriyonik fibroblastlar içinde doğal bağışıklık bileşenlerinin ifade "yeniden kurgulamak", daha fazla belirli doğuştan gelen bağışıklık moleküllerin kesin ve diferansiyel antiviral sitokin üretimini düzenler, anahtar sinyal olayları incelemek.

Abstract

Bir viral enfeksiyona yanıt olarak, ana doğuştan gelen bağışıklık tepkisi antiviral sitokin gen ekspresyonu ve üretimi düzenlemek kadar aktive edilir. Tersine, virüsler hayatta kalma ve çoğalma için konakçı bağışıklık sinyalizasyon kaçmasına ve sömürmek için karmaşık stratejiler gelişmiştir. Viral bağışıklık kaçırma, konak savunması ve viral kaçırma gerektiren, ev sahibi-virüs etkileşimi ayırt etmek en büyüleyici ve dinamik arayüzler biri sağlar. Bu çalışmalar doğal bağışıklık düzenlenmesinde anlayışımızı ilerletmek ve yeni antiviral tedaviler geliştirmek için yol açmıştı.

Murin γHV68 murin kemirgenler doğal bir patojendir. Farelerin γHV68 enfeksiyonu in vivo virüs-host etkileşimleri pertürbasyon geçerli değildir ki insan KSHV ve EBV antiviral yanıt incelemek için izlenebilir küçük bir hayvan modeli sağlar. Burada antiviral sitokin üretimini belirlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol, diğer vir uyarlanabilirkullanır ve sinyal yolları.

Son zamanlarda, γHV68 NFKB aktivasyonu ve antiviral sitokin üretimini ortadan kaldırmak için, mavs ve IKKβ, sitosolik Rig-I ve MDA5 alt akışında önemli bir doğuştan gelen bağışıklık sinyal bileşenleri ele geçirilmesini keşfettiler. Özellikle, γHV68 enfeksiyon IKKβ aktif hale gelir ve bu aktive IKKβ RelA bozulma hızlandırmak için ilişki fosforile eder. Bu nedenle, etkili bir anti-viral γ HV68 sitokin gen ekspresyonunu negating akış yukarı aktive IKKβ ikinci NFKB aktivasyon birbirinden ayrılacak. Bu çalışma memba bağışıklık aktivasyonu hemen aşağı transkripsiyonel aktivasyonu geçersiz ve antiviral sitokin üretimini kaçmasına viral patojen tarafından yakalanan sayede karmaşık bir strateji açığa kavuşturmaktadır.

Introduction

Son çalışmalar konak doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını montaj genel sinyal kaskadlarını hatlarıyla. Ayrı bölmeleri içinde ikamet eden, örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) ¹ sinyalizasyon doğuştan bağışıklık tetiklemek için farklı kökenli patojen ilişkili moleküler şekilleri (PAMPs) algılar. Retinoik asit-indüklenmiş gen I (Rig-I) ve melanoma farklılaşma antigen 5 (MDA5) proteinlerinin spesifik yapısal ² RNA türlerinin, sitosolik sensörleridir. Aktivasyonu üzerine, Rig-I sırayla, aynı zamanda Ikki olarak bilinen IKK (IKKαβγ) ve IKK-ilişkili kinaz (TBK1 ve IKKε, aktive eder, adaptör (ayrıca IPS-1, VISA ve Cardif olarak da bilinir) alt Mavs ile etkileşime ) ^3-6 kompleksleri. Aktif Doğuştan gelen bağışıklık kinazlar, transkripsiyon faktörlerinin ve bunların önleyicileri dahil olmak üzere, gen ekspresyonunun önemli regülatörleri, fosforile ve konakçı antiviral genlerin (örneğin IL-6, TNF ve içinde transkripsiyonel aktivasyonu sağlar945;, CCL5 ve IFNβ). Bu sinyal cascades enfeksiyonunun erken safhaları sırasında patojen yayılma sınırlamak için, bir anti-mikrobiyal devlet kurmak etkili iç doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini oluşturmaktadır.

Murin γHV68 yakın insan onkojenik KSHV ve EBV ile ilgilidir. Böylece, farelerin γHV68 enfeksiyonu in vivo ⁷ gamma herpes virüs enfeksiyonu bağışıklık tepkisini incelemek için izlenebilir küçük bir hayvan modeli sağlar. ΓHV68 viral enfeksiyon etkinleştirmek için doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyon ev sahipliği hijacks sayede γHV68 kullanarak, bizim laboratuvar karmaşık bir strateji ortaya çıkardı. Bir yandan, γHV68 çoğaltma transaktivatörü (RTA), γHV68 çoğaltma ⁸ viral transkripsiyon faktörü anahtar fosforile aktif IKKβ yönlendirilmesi ile viral kopyalama aktivasyonunu desteklemek üzere Mavs-IKKβ yolu aktive eder. Öte yandan, IKKβ aracılı fosforilasyonu bozulması ve bir dönem için göreceli hazırlarNFKB aktivasyonunu ⁹ inates. Bu nedenle, etkili bir anti-viral enfeksiyon γHV68 sitokin üretimini önler. İlginç bir şekilde, γHV68 bir ifade kütüphanesi kullanan bir tarama RelA bozulmasını uyarmak ve NFKB ¹⁰ aktivasyonunu ortadan kaldırmak için, bir E3 ligaz gibi RTA tespit edilmiştir. Bu bulgular üst bağışıklık sinyalizasyon olaylar nihai antiviral sitokin üretimini inkâr γHV68 tarafından boyunduruk sayede karmaşık bir bağışıklık kaçırma stratejisi ortaya çıkarmak.

Burada in vivo ve ex viv o iki γHV68 ile enfekte edilmiş farelerdeki antiviral sitokin üretimini ölçmek için bir protokolü tarif eder. Protokolde, bundan başka, anti-viral sitokin üretiminin düzenlenmesinde belirli doğuştan gelen bağışıklık moleküllerin fonksiyonu saptar lentiviral transdüksiyon ile nakavt embriyonik fibroblastlar içinde doğal bağışıklık bileşenlerinin "sulandırılmış" ifade araştırmak. Bu protokol, kolayca diğer Viru uyarlanabilirses ve sinyal yolları.

Protocol

Etik Açıklama: Tüm hayvan çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerilerine sıkı göre altında yapıldı. Protokol Southern California Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1.. ΓHV68 enfeksiyonlu Farelerde ELISA ile kantitatif gerçek zamanlı PCR ve sitokin salgılaması tarafından Gene Expression

1. Periton boşluğu içine ksilazin ketamine/0.12 mg, 1.5 mg ile enjekte cinsiyeti eşleştirilmiş, 6-8 haftalık C57BL / 6 (B6) litermatını (8-12 fare / grup) anestezi, ve 40 ul içinde 40 PFU γHV68 ile intranazal yoldan inoküle (Dong Feng ve ¹¹ ayrıntılı enfeksiyonu). Farklı zaman noktalarında Enfeksiyondan, servikal dislokasyon _CO2 inhalasyon ile farelerin euthanize.
2. Ster boyunca sol yanal kesim ile göğüs açınnum ve keskin bir makas ile kaburga kesti. Akciğer dokuları toplayın.
3. 500 ul 1,0 mm Zirkonyum / Silika boncuklar içeren steril 1.5 ml vidalı kapaklı tüpler içine akciğer dokusunda (sol lob) yarısını toplayın. Tüp içine soğuk serum içermeyen DMEM içinde 1 ml ilave edilir ve 30 saniye boyunca boncuk dövmenin ile akciğer dokusu homojenize edilmiştir. 2 dakika boyunca buz üzerinde tüpler soğuk ve bir kez bu işlemi tekrarlayın.
4. Tüpleri (15,000 x santrifüj 4 ° C'de 10 dakika) için g, süpernatan toplamak ve aşağıda tarif edildiği gibi sitokin üretimi ölçülür.
5. Üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari olarak temin edilebilen ELISA kitleri kullanılarak sitokin sitokinler ölçün.
6. Başka bir boncuk içeren tüp içine akciğer dokusunda (sağ lob) diğer yarısını toplayın ve 1 ml TRIzol ekleyin. Homojenizasyon ve üreticinin talimatlarına uygun olarak aşama 1.3 ve RNA ekstresi tarif edildiği gibi supernatant toplamak. 260 ve 280 nm'de absorbans okumaları alarak RNA konsantrasyonu belirleyin. Total RNA'nın 1 | ig ile cDNA'nın hazırlanması ve üreticinin talimatlarına (toplam 20 ul son hacim olarak) göre ters transkriptazı. DNAz ve RNAse içermeyen su ile cDNA 50 kez seyreltilir ve kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.
7. Kantitatif gerçek zamanlı PCR makinede programı yapın. Her reaksiyon, GAPDH (primerlerin çalışma konsantrasyonu, her bir primerden 10 uM, 500 nM idi CE) gen spesifik primerler veya kontrol primerleri bir çift, 0.5 ul içeren, SYBR ana karışımı 5 ul ve 4 ul seyreltilmiş cDNA. Antiviral sitokinlerin mRNA transkriptlerinin nispi miktarını belirlemek için ΔΔCt hesaplayın.

2. ELISA ve Mah-PCR ile MEF Hücre Enfeksiyon ve sitokin miktarının

1. Mavs ^{+ / +} ve Mavs büyütün ^{- / -} hücreleri kaplama önce alt konfluent (yaklaşık% 80) yoğunluğuna MEF hücreleri.
2. 12-biz içine MEF hücreleri bölmede 100,000 hücre / (hücre yoğunluğu ikinci gününde% 70 civarında olacaktır) ll için plakalar. Sitokin indüksiyonu senkronize etmek ve en üst düzeye çıkarmak için, 5-10 arasında bir enfeksiyon çokluğu (MOI) ile üçlü olarak γHV68 enfeksiyonu yürütmek.
3. Virüs uygun miktarda (her bir 1 ml) ihtiva eden DMEM ortamı içinde tam γHV68 süspansiyon hazırlayın.
4. Ortamı çıkarın ve MEF hücreleri γHV68 ihtiva eden bir süspansiyon ilave edin.
5. , Doku kültürü inkübatörü içinde, plakayı her 30 dakikada bir kaya ve inkübasyon 2 saat bir toplam izin verir.
6. , ΓHV68 içeren ortam çıkarmak bir kez PBS ile yıkayın ve taze bitmiş DMEM ile değiştirin.
7. Çeşitli zaman 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine sonrası enfeksiyon, hasat orta işaret. Soğuk PBS ile hücreleri yıkayın ve sindirim tripsin tarafından enfekte hücreleri toplamak.
8. Adım 1.5 'de tarif edildiği gibi bir ortam içinde antiviral sitokinler ölçün.
9. , RNA ekstrakte cDNA hazırlamak ve antiviral sitokin gen ekspresyonunu tespit etmek QRT-PCR işlemi gerçekleştirmek1,5-1,7 adımları tarif edildiği gibi.

3. Kararlı Hücre Hatları lentivirüstür üretimi, Enfeksiyon ve Üretimi

1. Bölünmüş 293T hücreleri transfeksiyondan bir gün önce ve hücreler transfeksiyon zamanında ~% 40 ortak akışkanlığa ulaşmaya izin verir.
2. Ambalaj plazmid (1.2 pVSV-G ug ve 6 ug pDR8.9 arasında) ve 7.2 PCDH-FLAG-Mavs ya da kalsiyum fosfat çökeltme ile PCDH kontrol ug ile 293T hücreleri 10 cm tabak transfekte.
3. Taze tam DMEM ile 6-8 saat sonrası transfeksiyon orta yerine.
4. 72 saat post-transfeksiyon anda, 0.22 mikron membran orta ihtiva eden lentivirüs, 15 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüj ve filtre toplamak. Lentivirüs titresini arttırmak için, 4 ° C'de 2.5 saat boyunca 110,000 x g'de virüs içeren ortam santrifüj Dikkatle ilgi orta küçük bir hacim içinde viral pelletini.
5. Tohum Mavs ^{- / -} MEF hücreleri veya diğer nakavt MEF hücreleri bir gün befo~% 30-40 birbirine karıştığında, 6 oyuklu plakalar içerisinde yeniden enfeksiyon.
6. 1 ml lentivirüs ve 10 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar polibren ile takviye edilmiş, 2 ml taze tam DMEM ile MEF hücreleri enfekte etmektedir.
7. 30 dakika boyunca 30 ° C'de 500 x g'de plaka santrifüj ve bir doku kültürü kuluçka makinesine plaka aktarın.
8. Taze tam DMEM ile 6 saat sonrası enfeksiyon orta yerine.
9. Bölünmüş MEF 24 saat sonrası enfeksiyon hücreleri ve kararlı bir şekilde ifade eden hücreleri seçin Mavs 48 saat sonrası enfeksiyon 1 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar puromisin ekleyin.
10. Puromisin-ihtiva eden ortam içinde MEF hücreleri korumak ve bunlara karşılık gelen antikorlar ile immunoblotting protein ekspresyonu doğrulamak.
11. Hücreler, viral enfeksiyon, sitokin gen ifadesi ve Protokol 2 de tarif edildiği gibi salgılama deneyleri için de kullanılabilir.

Representative Results

Üç örnek şekiller γHV68 enfeksiyonlu Mavs akciğerinde sitokin üretimi de dahil olmak üzere, burada gösterilmektedir ^{+ / +} ve ^{Mavs-/ - / - -} γHV68 enfekte Mavs ^{+ / +} ve Mavs fare, sitokin salgılama ve gen ekspresyon seviyesi MEF'ler ve γHV68-enfekte Mavs sitokin mRNA seviyeleri ^{- / -} MEF'ler Mavs ile "yeniden". Bu örnek deneyler, in vivo olarak anti-viral sitokin üretimini incelemek ve düzenlenmiş sitokin üretiminin ex vivo mekanizmasını incelemek için nakavt MEFS keşfetmek için gen nakavt fareleri kullanır. Özellikle, Mavs of γHV68 enfeksiyon ^{- / - farelerde} in vivo CCL5 önemli ölçüde daha yüksek üretim yol açtı. Mavs ^{- / - Diğer} antiviral üretilen sitokin MEF'ler in vivo fenotipi tekrarıdır γHV68 enfeksiyon sırasında, Mavs ^{+ / +} MEF'ler daha. "Reconsti"ikâmeli Mavs içinde Mavs sentezlenmesinin ^{- / -} MEF'ler CCL5 üretiminde azalma Toplu olarak, bu sonuçlar, in vivo olarak γHV68 ve ex vivo hem de anti-viral sitokin üretimini bastırmak için MAVS gerekli olduğunu göstermektedir..

Şekil 1. ^{- / -} fareler Mavs ^{+ / +} farelerinde daha γHV68 akut enfeksiyon Mavs akciğerlerinde daha fazla sitokin üretimini uyardı. Yaş ve cinsiyet uyumlu Mavs ^{+ / +} ve Mavs ^{- / -} fareler burundan sonrası enfeksiyon ELISA ile ölçüldü belirtilen günde enfekte akciğerlerde γHV68 ve CCL5 40 PFU'nun ile enfekte edildi. Mavs of γHV68 enfeksiyonu ^{- / -} fareler antiviral sitokin C daha yüksek üretim yol açtıΓHV68 antiviral sitokin üretimini bastırmak için MAVS gerekli olduğunu ileri CL5. Veriler, ortalama (SEM) standart hatası ± ortalama olarak sunulmuştur. Istatistiksel anlamlılık: *, p <0.05; **, p <0.02. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. ΓHV68 enfeksiyon üzerine, Mavs ^{- / -. - / -} MEF'ler Mavs ^{+ / +} MEF'ler den Mavs ^{+ / +} ve Mavs daha fazla antiviral sitokin üretilen süpernatan içinde MEF'ler γHV68 ile enfekte edildi ve belirtilen sonrası Enfeksiyondan (HPI) toplandı, CCL5 ELISA kantitatif gerçek zamanlı PCR (B) MEF hücrelerinde (A) ve gen ekspresyonu ile değerlendirildi. ThMavs e sonuçları ^{- / - / - -} fareler γHV68 ile enfekte MEF'ler γHV68-enfekte Mavs bu özetlemek. Veriler, üç bağımsız deneyin ortalaması ± SEM olarak sunulmuştur. Istatistiksel anlamlılık:. **, P <0.02, *** p <0.005 büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. Mavs içinde Mavs ifade "Çözülmüş" ^{- / -} MEF'ler CCL5 üretiminde azalma (A) Mavs ^{-. / -} MEF'ler kontrol veya lentivirüs ve Mavs ifade immüno-lekeleme ile analiz edilmiştir MAVS-ifade ile enfekte edilmiştir. (B) Mavs ^{- / -} Mavs ile "yeniden" MEF'ler γHV ile enfekte edildi68. MEF'ler belirtilen saat sonra enfeksiyonu (HPI) hasat edilmiş ve RNA CCL5 için özel primerler ile kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edilmiştir. Veriler, üç bağımsız deneyin ortalaması ± SEM olarak sunulmuştur. Istatistiksel anlamlılık:. **, P <0.02 resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Discussion

Viral bağışıklık kaçırma viral suç ve konak savunmasını ⁹ arayüz en dinamik ve etkileyici etkileşimleri biridir. Konak doğuştan gelen bağışıklık bileşenlerini sinyal iletimi etkili başlayan ve sadakatle iletilir şekilde yapılandırılmıştır. Kaskadlarını sinyal hiyerarşisini ve düzenleme çizen doğal bağışıklığın bir önde gelen konudur. Burada, sitokin üretiminin viral kaçırma bir doğuştan gelen bağışıklık bileşen, mavs, düzenleyici rolleri belirlemek için bir protokol getirmektedir. Protokol, virüs-enfekte edilmiş fare sitokin üretimini belirlenmesi ve MEF'ler sitokin gen ekspresyonu ve üretimi değerlendirilmesi için bir yöntem ihtiva eder. Gen nakavt MEF'ler ve fare in vivo ve ex vivo olarak protein işlevinin genetik ve biyokimyasal disseksiyon sağlayacak araçlar sağlamaktır. Piyasada mevcut olan ve sayısı, bir hızlanan bir tempoda bu pr artmaktadır birçoğu genetik olarak değiştirilmiş fare suşları üzerinde inşaotocol ayrıca vahşi tip veya lentivirüs ilgilenilen mutasyona uğramış protein "sulandırılmış" ifade araştırır. Doğuştan gelen bağışıklık bileşenlerinin "sulandırılmış" ifadesi bir potansiyel sınırlama bunun viral enfeksiyon ve sinyal transdüksiyonunu etkileyebilecek eksojen ifadesi ile tetiklenen istenmeyen bağışıklık sinyal vardır. Endojen seviyeleri ile karşılaştırılabilir seviyelerde ifade düşük bir seviyeye ulaşmak için Optimizasyonu yan etkisini azaltabilir. Hedef "lezyon" taşıyan bir mutant protein kullanıldığı durumunda, bize viral enfeksiyon sırasında bağışıklık düzenleme olarak, belirli bir etki fonksiyonu, post-translasyonel modifikasyon veya protein-protein etkileşimlerini belirlemekte sağlayacaktır. "Sulandırılmış" knockout fare hücre nakil durumunda, seçilen bağışıklık bileşenleri veya hedeflenen mutant of in vivo işlev incelenebilir.

"Knock-in" ya da mutant proteinlerin transgenik ekspresyonu, "reconstit karşılaştırıldığındaVahşi tip ya da lentivirüs ilgilenilen mutasyona uğramış protein usulünde "ifadesi farklı kazanç-kayıp veya fonksiyon-mutantları ile tetkik edilmesine izin verir, daha düşük maliyetli ve zaman etkilidir. bütün protokol önemli bir adım olduğunu yeniden protein Protein, bir enzim ya da transkripsiyon faktörü, özellikle de endojen protein seviyesi ile karşılaştırılabilir nitelikte olmalıdır. sinyal yolu ve belirsiz sonuç olarak anormal aktivasyona yol açabilir aşırı ifadesi bazı proteinlerin.

Bizim protokol büyük ölçüde γHV68 replikasyonu üzerindeki doğuştan gelen bağışıklık bileşenin iç düzenlenmesi için fare fibroblastları, öncelikle odaklanmasına rağmen, benzer uygulamalar makrofaj ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere başka bağışıklık bileşenlerinin, uzatılabilir. Buna ek olarak, bu yaklaşımların çeşitli patojenleri gerektiren mekanik çalışmalar için adapte edilebilir. Uygulama ¹² gelişmekte olan ve büyük olasılıkla gelecekte daha fazla merkez sahnelenen rol alacak.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA