Summary
생명 전좌 실험 용액에 고체 상태의 나노 기공을 제조하는 방법이 제시된다. 높은 전기장의 짧은 펄스를인가함으로써, 나노 기공 직경이 나노 미터 이하로 제어 정밀도로 확대 될 수 있고 그 전기적 잡음 특성이 크게 개선되었다. 이 절차는 실험 조건 하에서 표준 실험실 장비를 사용하여 반응계 내에서 수행된다.
Abstract
고체 상태의 나노 기공은 핵산과 단백질 1과 같은 단일 생체 분자의 특성에 대한 다양한 도구로 등장했습니다. 다만, 얇은 절연 막에 나노 기공의 생성은 어려운 남아있다. 전문 집속 전자 빔 시스템을 포함하는 제조 방법은 잘 정의 된 나노 기공을 생성 할 수 있지만, 시판 막 안심 저잡음 나노 기공의 수율은 2,3 낮게 유지 및 사이즈 제어가 4,5 사소하다. 여기에, 미세 조정에 높은 전기 분야의 응용 프로그램이 최적의 저잡음 성능을 보장하면서 나노 기공의 크기는 보여줍니다. 높은 전기장이 짧은 펄스는 자연 그대로의 전기 신호를 생성 및 장기간 노출에 나노 미터 이하의 정밀도로 나노 기공의 확대를 허용하는 데 사용됩니다. 이 방법은 (S)의 수율 및 재현성을 향상 표준 실험실 장비를 사용하여 수성 환경에서 반응계에서 행한다올 리드 상태 나노 기공 제조.
Introduction
생물학 및 고체 나노 기공은 단일 분자 레벨 1 생체 분자 분석을 감지하는 수단을 제공한다. 각각의 나노 기공은 일반적으로 두 가지 액체 저수지 사이를 통과하는 이온 전류에 대한 유일한 도관을 제공, 얇은 절연 막에 포함됩니다. 대규모 콜터 카운터의 원리를 활용하여 나노 기공 실험 그들이 전기영 외부 전기장의 존재하에 나노 기공을 통해 구동되는 것처럼 청구 생체 분자의 길이, 크기, 전하 및 형태를 결정하는 이온 전류의 변화에 관한 것이다.
이러한 α-용혈 같은 생물학적 나노 기공은 일반적으로 더 큰 감도와 낮은 노이즈 특성 3을 제공하지만, 지원하는 지질 이중층은 적용을 제한, 연약하고 고정 된 크기입니다. 고체 나노 기공, 반면에, 얇은 (10-50 NM) 실리콘 질화물 또는 실리콘 산화물 막으로 제조되며 다른 SIZ 제조 될 수있다ES 용이 웨이퍼 스케일 기술 6,7에 통합하고,보다 강력한, 실험 조건의 넓은 범위를 허용 할. 이러한 장점에도 불구하고, 고체 상태의 나노 기공 기술은 생체 분자 연구에 대한 자신의 유용성을 제한하는 몇 가지 실제적인 단점으로 고생. 나노 기공 크기의 제어가 가능하지만, 그것을 특수 장비 및 인력의 숙련을 필요로 달성하기 위해 전형적으로 비싸고 힘드는이다. 예를 들어, 집중 이온 빔에 의해 천공 나노 기공 최근 주 사형 전자 현미경 (SEM) 소재 구체적인 실험 조건 하에서 줄어드는 것으로 나타났다. 다른 방법으로, 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 천공 나노 기공은 빔 조건으로 수성 용매 8에 후속 노광에 따라 확대 또는 축소 할 수있다. 나노 기공의 크기는 화학적 처리 다음으로 변경하거나 할 수있는 경우에, 나노 기공 크기의 달성 가능한 범위는 제한 제어가 곤란하고 심지어 신뢰할특정 액체 환경 9에 몰입 할 때.
고체 상태의 나노 기공을 통해 이온 전류도 높은 소음에서 고통을 수의 소스는 나노 기공 문학 2,3,10,11에서 강렬한 연구 주제이다. 다양한 방법은 전기적 잡음을 줄이기 위해 제안되었지만, 신뢰성, 안정성 저잡음 나노 기공의 수율은 통상적으로 낮다. 드릴링 및 촬상 중에 탄소 질 잔류 물의 증착 종종 완전한 습윤에게 챌린지를 만들고 12을 제거하기 어려울 수 나노 버블의 형성을 일으키는 전기 신호의 질에 해로운 영향을 가질 수있다. 또한, 피 분석 물 분자에 의해 나노 기공의 막힘은 신호 품질의 렌더링이 추가 실험 13,14위한 사용 불가 기공 저하시킨다. 합해서, 이러한 효과는 크게 기능성 나노 기공 장치의 수율을 감소시키고, 고체 나노 기공 연구와 관련된 비용을 증가시킨다.
애플리케이션0.15-0.3 V / nm 범위에서 높은 전기장을 생성하는 자세 / AgCl을 전극과 전압 기는이 문제에 대한 놀라 울 정도로 간단한 솔루션을 제공합니다. 짧은 전압 펄스, 단일 분자 연구를위한 깨끗하고 노이즈가 적은 나노 기공 표면에 최적의주기적인 응용 프로그램을 통해 생산된다. 높은 전기장에 장시간 노출은 나노 기공 직경의 증가의 결과 기공 벽을 구성하는 막 재료의 제거를 개시한다. 이러한 성장은 정확하게 펄스 강도 및 지속 시간을 조정함으로써 제어 될 수있다. 분자가 나노 기공의 표면에 흡착 현재 트레이스 인해 나노 기공의 막힘 실험 과정 동안 저하 같이,이 프로세스는 달리 폐기했을 막힌 장치를 복구하기 위해 반복 될 수있다. 이와 같이, 기능성 나노 기공의 수율은 상기 동일한 장치를 여러 번 사용할 수있는 능력에 의해 증가된다. 이 급속 실험 하에서 액상에서 수행되는이 방법은 몇 가지 장점을 제공한다조건은, 오직 표준 실험실 장비를 필요 소프트웨어 자동화 될 수 있고, 95 % 이상의 수율로 기능적 고품질 나노 기공을 생성한다.
Protocol
1. 나노 기공 제조 및 청소
참고 : 나노 기공이 절연성 막에 존재하면 단계 2에서 설명한 바와 같이, 직접, 추가 처리 또는 클리닝없는 액체 셀에 장착 될 수있다. 또는 산소 플라즈마 (2)에 노출 :이 실험 간의 오염 물질의 흔적을 제거 할 필요가있는 경우에는, 나노 기공 칩 피라니아 용액 3,15,16 (H 2 O 2 3시 1분 H 2 SO 4)을 사용하여 세정 될 수있다. 따라서, 피라니아 솔루션에 노출 예비 세정하는 것은 필요하지 않은 경우 다음과 같은 프로토콜 1.9 1.2은 선택 단계를 반복합니다.
- 드가는 40 ℃에서 30 분 동안 초음파 분쇄기에 진공 상태에서 배치하여 탈 (DI) 물을 여과
- 정중 3 ㎖ 1 ㎖의 과산화수소 다음에 황산을 첨가하여 10 ㎖의 비이커에 피라니아 용액을 준비한다. 피펫에 환류에 의해 철저하게 섞는다. 주의 : 피라니아 솔루션은 매우 위험합니다. 하십시오 따 모든주의 사항을 애.
- 내산성 핀셋을 사용하여 조심스럽게 완전히 칩 잠수함 표면에 떠있는 상태를 피하기 위해 피라니아 용액에 에지 - 제 - 함유 나노 기공 멤브레인 칩을 삽입한다.
- 정수 된 물을 철저하게 핀셋을 씻어.
- 90 ° C에 핫 플레이트 사전에 비커를 놓고 적어도 30 분 동안 청소 할 수 있습니다.
- 조심스럽게 깨끗한 유리 피펫을 사용하여 비커에서 피라 솔루션을 제거하고 충분한 물에 버린다.
- 깨끗한 유리 피펫을 사용하여 씻어 비커에 1.1 단계에서 가스가 제거 된 탈 이온수 5 ㎖를 추가합니다. 물을 제거하고 최소 5 배를 반복합니다.
- 조심스럽게 깨끗한 날카로운 팁 핀셋을 사용하여 비커에서 나노 기공 칩을 제거합니다. 나노 기공 막 매우 허약하기 때문에 특히주의해서 다루십시오.
- 온화하게 흡입기를 사용하여 에지에 흡입을 적용함으로써 칩 말린다. 사용할 준비가 될 때까지 깨끗한 페트리 접시에 칩을 저장합니다.
- 20 % 질산 용액에 놓고 10 분 동안 끓는 테플론 나노 기공 셀 (도 1)를 청소한다. 주의 : 모든 필요한 개인 보호 장비를 사용 및 관리에 산을 처리합니다.
- 조심스럽게 10 분 동안 끓는 DI 물에 질산과 장소에서 세포를 제거합니다.
- 질산의 완전한 제거를 보장하기 위해 추가로 10 분 동안 DI 물에서 세포를 끓인다. 핫 플레이트에서 비이커를 제거하고 실온으로 냉각시킨다.
- 비커에서 세포를 제거하고 여과 된 공기 또는 N 2로 건조한다. 깨끗한 배양 접시에 세포를 보관합니다.
- 드가는 40 ℃에서 30 분 동안 초음파 분쇄기에 진공 상태에서 배치하여 (산도 8시 HEPES 버퍼링)의 KCl 용액을 여과
- 적어도 10 분 동안 에탄올에서 초음파 처리하여 각 나노 기공 칩 클린이 실리콘 엘라스토머 개스킷.
- 깨끗한 엘라스토머 개스킷 존재의 carefu에 나노 기공 칩을 놓습니다개스킷의 구멍에 막 윈도우를 정렬하는 L. 배치하고 칩 꼭대기에 두 번째 가스켓을 맞 춥니 다.
- 청소 나노 기공 세포의 절반의 저수지 입구에 칩과 가스켓을 놓습니다. 대신에 나머지 절반을 돌려서 셀을 조립합니다. 나노 기공 셀 성분의 분해 사시도가도 1에 도시된다.
- 세포 저수지에 에탄올을 피펫 팅 몇 거품이 입구를 종료 볼 때까지 진공 챔버에 배치하여 나노 기공 칩을 적시.
- 필터링의 KCl 용액을 탈기 적어도 3 ㎖의 저수지를 세척하여 에탄올을 제거합니다. 흡입기를 사용하여 오버 플로우를 제거하기 위해주의하십시오.
3. 나노 기공 특성
- 전기 차폐 실험 장치에 나노 기공 세포를 놓고 각 저수지에 자세 / AgCl에 전극을 배치합니다. 이 설정은 외부 전원 공급 및 전류 증폭기를 제외한도 2에 도시 된 것과 유사하다저잡음 저항 피드백 앰프로 대체.
- 전압 클램프 모드에서 저잡음 증폭기를 사용하여, +200 mV 범위 -200 mV 이상 연소 및 IV 특성을 기록 전위를 적용한다.
- 용액 (17)에 그것의 직경을 계산하는 데 사용될 수 나노 기공 컨덕턴스를 구하는 IV 커브를 장착한다. 계산 된 직경은 TEM 영상에서 예상보다 훨씬 작은 경우, 모공이 완전히 침수되지 것입니다 및 / 또는 이물질 또는 오염 물질이 포함되어 있습니다.
- 나노 기공에 걸쳐 200 MV 잠재력을 적용하고 30 초 동안 이온 전류를 기록한다.
- 이온 전류의 전력 스펙트럼 밀도 (PSD) 분석을 실시하고 나노 기공의 전기적 잡음 특성을 정량화하기 위해 통합. 잡음이 5 kHz의 대역폭에서 15 펜실바니아 RMS 이상일 경우, 기공이 완전히 습윤되지 가능성 및 / 또는 오염을 포함하고 안정적으로 실험에 사용 할 수 없다.
4. 높은 전기 피에를 사용하여 컨디셔닝 나노 세공LDS
참고 : IV 곡선이 출품 비대칭 이하 예상보다 전도성을 생성하거나, 현재 추적이 낮은 주파수에서 불안정과 높은 소음 수준을 보였다 경우에는 공에 어떤 오염 물질을 제거하는 높은 전기 분야에 나노 기공을 조절하는 것이 필요하다 표면 및 / 또는 기공을 적시. 이 방법은 막의 정전 용량 측정에 사용되는 전류 증폭기의 입력에 결합 된 임의의 기생 용량에 기인 한 고주파 잡음에 영향을주지 않지만, (도 1 / f 노이즈라고도 함) 저주파 노이즈 (18)가 크게 감소 될 수있다. 이 조절을 수행하는 데 사용되는 셋업의 개략도는도 2에 도시된다.
- 패치 클램프 증폭기에서 전극을 분리합니다.
- 생성 할 수있는 컴퓨터 제어 전원으로 전극 중 하나에 연결> 6 V (> 0.2 V / NM 전계 여기서 사용 30 ㎚ 두께의 막에 대한 강도) 및 E에 다른실시간으로 모니터링 할 수있는 전류 증폭기를 xternal.
참고 : 높은 전기장의인가는 다양한 재료 및 막 두께에 나노 기공을 컨디셔닝하는데 사용될 수있다. 달리 명시되지 않는 한 모두 30 나노 및 10 나노 멤브레인이 여기에 설명되어 있지만, 설명 전압은 30-nm 두께의 막에 사용되는 참조하십시오.
- 적어도 5 초 동안 나노 기공에 걸쳐 400 MV (측정 전압)의 전위차를 적용합니다.
- 나노 기공의 전도도를 결정하는 데이터의 마지막 1 초에서 평균 전류 값을 계산한다. 가능성이 가장 높은 지오메트리에 기반 소프트웨어 및 선택의 나노 기공 컨덕턴스 모델을 사용하여 자동으로 수행되어야이 컨덕턴스에 기초하여 상기 나노 기공의 직경을 계산한다. 그것은 IV 곡선에서 측정 된 직경에 해당한다.
- 5 초 측정 기간이어서 0.2 V / ㎚의 전기장을 생성하도록 나노 기공 걸쳐 6 V의 200 밀리 초 펄스 (습윤 전압)을 적용400 MV에서. 또 다시, 데이터의 마지막 1 초를 이용한 나노 기공의 직경을 산출하고 나노 기공이 완전히 젖어되도록 TEM 측정으로부터 기대 값과 비교한다. 필요한 경우, 여러 번 반복한다.
- 필요한 경우, 측정 기간 중에 전류 신호까지 점증 전압과 높은 전계 펄스의인가를 반복 안정적이고 예상 전도도를 보이고있다. 이 크게 확대하거나 빠르게 나노 기공을 손상시킬 수로, 10 V (즉> 0.3 V / 뉴 멕시코)를 초과하지 않는 것이 좋습니다.
5. 높은 전기 필드를 사용하여 나노 세공을 확대
참고 : 나노 기공의 직경은 특정 생체 분자 감지를위한 어플리케이션의 기능을 결정하는데 중요하다. 이를 위해, 나노 기공은 적절한 직경을 청소하고 습식 사용 된 동일한 설정으로 달성 될 때까지 TEM 높은 전계를인가하여 원하는 크기로 확대 될 수있는 사용하여 만든나노 기공 (그림 2).
- 파트 4와 동일한 전자 구성을 사용하여, 직경 방향 치수를 구하는 세공에 걸쳐 200-500 MV 바이어스를 적용한다. IV 커브 피트 미만 정확한 동안 단일 포인트 측정 대략 급속 나노 기공의 크기를 추정하기 위해 사용될 수있다.
- 400 MV에 최소 5 초의 측정 기간 다음에 나노 기공에 걸쳐 8 V의 2 초 펄스를 적용합니다. 새로운 지름의 계산은 일반적으로 나노 기공의 크기가 매우 작은 증가 (<0.1 nm의) 표시됩니다.
- 현장 및 나노 기공의 직경을 증가의 실시간 측정에서 얻을 수 확대 및 측정 전압을 교대로 주기적으로이 과정을 반복합니다.
- 빠른 성장 속도가 바람직한 경우, 모공 nS는 0.03 / s의 EC 및 # 이르는 전도성의 증가 비율로 확대 전형적 가속화 10 V. 성장까지 점진적으로인가 전압의 크기를 증가160; 10 ns의 / 초, 전계의 나노 기공, 강도와 전해액 특성의 크기에 따라.
- 원하는 직경에 도달하면, 높은 전기장의인가를 멈춘다. 이것은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 자동으로 수행 될 수있다.
- 전극 패치 클램프 증폭기를 다시 연결합니다.
- 위의 5 - 나노 기공의 직경을 확인하고 단계 3.2에서와 같이 낮은 노이즈 전류 신호를 확인하기 위해 200 MV에서 새로운 IV와 현재 추적 데이터를 수집. 필요한 경우, 에어컨 및 확대 프로토콜 (- 5.5 4.1 단계) 반복합니다.
6. DNA 전좌
- 이전의 생체 분자 시료를 추가로, 저장조에 오염이 없도록 제어 실험을 수행한다. 전류 봉쇄는 2 분 후 검출되지 않음을 확인하기 위해 모든 샘플의 부재에 150-300 측정 값의 적용 가능성에 따라 현재 추적을 취득.
- 에 λ의 DNA (48.5 KBP 이중 가닥)를 추가 <EM> 0.5 NG / μL의 최종 농도에 대한 시스 저수지. 저수지에 걸쳐 시료의 균일 한 분포를 보장하기 위해 최소 10 초 동안 피펫으로 부드럽게 환류.
- 30-nm 두께의 나노 기공의 경우, 트랜스 저수지 150-300 측정 값의 잠재적 인 편견을 적용하고 나노 기공을 통과하는 이온 전류를 측정한다. 매우 짧은 전좌 이벤트의 경우, 상대적으로 높은 로우 패스 필터링 주파수 (100 kHz에서)와 고주파수 (250 kHz 또는 그 이상)로 샘플링하는 것이 바람직하다.
- 분자가 나노 기공을 통해시키다 같이 과도 전류 봉쇄를 검출 소프트웨어를 사용하여 이온 전류를 모니터한다. 분자 전좌의 이온 전류 트레이스 방해물 깊이, 지속 기간 및 그 샘플에 대한 정보를 추론하기 위해 주파수를 결정하기 위해 분석 될 수있다. 전좌 분자에 대한 정보를 알고있는 경우에는 반대로,이 데이터는 나노 기공 자체의 성질을 조사하는데 사용될 수있다.
Representative Results
본 연구에 사용 된 나노 기공은 30 ㎚ 이상 10 ㎚ 두께의 질화 실리콘 막 윈도우 뚫고 있었다. 설명한 프로토콜은 다양한 재료의 고체 나노 기공 임의의 방법을 이용하여 제조에 적용 할 수 있지만, 그들은 일반적으로 이전에 설정된 프로토콜 11,14 TEM을 사용하여 천공된다. TEM에 의해 드릴 나노 기공의 직경 4-8 nm의 (그림 2) 사이에 일반적입니다. 모두 30 ㎚, 10 ㎚ 두께의 막을 부착하고, 상기 프로토콜을 사용하여 조절 될 수 있지만, 설명 된 전압 바이어스는 달리 명시되지 않는 한 30 ㎚ 두께의 막에 대한 요구들을 참조. 다른 크기의 멤브레인의 경우,인가 된 전압은 나노 기공 내부 0.15-0.3 V / nm 범위에서 전계를 생성하도록 조정되어야한다.
그림 3a는 30-nm 두께의 막에있는 10 nm의 나노 기공의 두 가지 일반적인 전도성 트레이스 전에 높은 전기장과 치료 후를 보여줍니다. 새로 D 장착시나노 기공을 rilled, 불안정한 시끄러운 이온 전류 신호를 얻는 저주파 변동의 높은 수준을 나타낼 가능성이 일반적으로 높다. 그림 3a에 도시 된 나노 기공이 동작을 강조한다. 그것의 전도로 인해 불완전 습윤 가장 가능성이 크기의 나노 기공에 대해 예상보다 상당히 작습니다. 8 V 펄스 (2 초 지속 시간의 90 펄스)에 의해 생성 된 크기가 0.27 V / 뉴 멕시코의 높은 전기 분야의 응용 프로그램에 따라, 나노 기공이 완전히 젖었 이후에 직경 21 나노 미터로 확대된다. 이 시점에서, 기공은 저잡음 특성을 갖는 안정한 컨덕턴스를 나타낸다. 유사 나노 기공 노이즈의 정량 분석은도 3b에서의 전력 스펙트럼 밀도 플롯으로 도시된다. unwet 및 / 또는 막힌 구멍의 저주파수 잡음 진폭이 실험에서 사용 불가들을 렌더링 (> 20 펜실바니아 RMS) 매우 높다. 높은 전기장, 낮은 주파수에서 잡음 전력 (<10 kHz에서)와 에어컨이 diminis 주셔야합니다최대 3 크기의 주문 및 저잡음 실험을위한 준비가 HED.
적용 가능성이 확대 낮은 전기장 측정 기간 동안 높은 전기 필드 사이 펄스대로 그림 4a는 일반적인 전류 측정을 보여줍니다. 이후의 각 펄스 후 (나노 기공 전도도 즉) 측정 전압의 나노 기공을 통해 생성 된 이온 전류는 유한 한 양만큼 증가합니다. 이 직경 (D)이 유효 길이 (L)의 EFF의 원통 형상을 갖는 것으로 나노 기공 근사, 도전율 σ의 용액에서의 컨덕턴스 G로부터 추론 될 수있는 나노 기공이, 크기가 증가되는 것을 보여준다. 다양한 모델의 형상 17,19-21에 나노 기공 전도도의 관계를 위해 존재하지만, 기하학적 용어 및 액세스 저항 용어를 통합 다음 관계는, 높은 소금 TEM 드릴 나노 기공 유효 입증되었습니다dsDNA 전좌 17,22에 대한 관심의 직경의 넓은 범위의 농도.
원하는 직경에 도달하면, 프로세스는 소프트웨어에 의해 자동으로 정지된다. 도 4b에 도시 된 바와 같이 생성 된 나노 기공 직경은, 정확한 IV 측정을 이용하여 확인할 수있다.
그것은 높은 전기장을 사용하여 치료 나노 기공이 완전한 기능하는 것이 중요합니다. 그림 5a에서 제시 한 전도성 트레이스와 같이 이것은, λ DNA 전좌의 검출에 의해 확인된다. 이 그림에서, dsDNA는 설명 된 방법을 사용하여 11 나노 및 32 나노로 확대 된 두 개의 나노 기공을 통해 구동된다. 각각의 경우, 초기 전도도가 매우 안정되어 dsDNA 분자가 나노 기공을 통해시키다 명확 봉쇄가 높은 신호 표시, 관찰잡음 단일 분자 전위의 높은 소음을 전시 모공 치료에 비해 이벤트. 도 5a의 인 세트에 도시 된 바와 같이, 이러한 크기의 나노 기공을 위해 예상대로 개별 접혀 분자,시키다 같이, 다 이산 방해물 레벨이 관찰된다. 각각의 기공을 통해 전위 이벤트 기간 동안 나노 기공 전도도의 히스토그램은 그림의 (b)에 표시됩니다. 두 번 차단 상태 (두 DNA 가닥 - 접히는) - 나노 기공의 저잡음 특성 기준에 해당하는 고유 한, 쉽게 분해 피크 (아무 DNA), 싱글 (펼쳐진 하나의 DNA 가닥을) 알 수있다. 메모의 기공을 점유 한 dsDNA 분자에 대응 컨덕턴스의 변화가 크고 작은 나노 기공을위한 다른 것이 사실이다. 이것은 다른 기공이나 균열이 t에 생성 될된다면 높은 전기장의인가는 동일한 방해물 진폭이 관찰되는 바와 같이, 기존의 나노 기공을 확대 사실로되어 간접적 인 증거를 제공한다그는 공정 17시 멤브레인.
마찬가지로,도 6은 다양한 두께의 막으로 제조 된 나노 기공을 확대 높은 전기장의 효과를 나타낸다. 여기서, 10 ㎚의 막에 SiNx로 만들어진 나노 기공이 불안정하고 비교적 작은 컨덕턴스를 표시하는, 처음에 부분적 unwet이다. ± 3 V 교류의 응용 프로그램에 따라 4 초 지속 시간 (총 30)의 펄스 (0.3 V / nm의 ±), 나노 기공은 젖은되고, 3 nm의 기공에 대한 최적의 IV 특성을 나타낸다. 방법은 다음 (400) 이후의 펄스 반복하고 나노 기공은 8 나노 미터로 확대되었다. 이 확대는 비교 전기 분야에서 수행하지만, 30 나노 멤브레인으로 제조 나노 기공보다 낮은인가 전압 바이어스는, 프로세스가 구동 주로 전기장 것을 보여줍니다. 얇은 막을 통해 전좌 의해 생성 전류 봉쇄 얇은 막에 두껍게 기공, 나노 기공에서 생산보다 클수록이 방식으로 처리 증가 된 감도를 가진 단백질과 같은 짧은 분자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1. 나노 기공 셀 어셈블리는. 나노 기공을 포함하는 실리콘 질화물 막을 전해질 저수지를 포함하는 두 개의 테프론 반 세포에 의해 압축 차례에 실리콘 엘라스토머 개스킷, 사이에 배치된다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 나노 기공 조절 및 설정을 확대. 30 nm 두께의 질화 실리콘 막 (왼쪽)에 드릴 나노 기공은 두 전해질 저수지를 연결합니다.컴퓨터를 패치 - 클램프 증폭기 또는 전해질 저장조에 침지 자세 / AgCl을 전극을 통해 나노 기공을 가로 질러 전위 바이어스를인가 외부 전원 공급 장치 (DAQ 카드) 중 하나를 제어하기 위해 사용된다. 전류 증폭기는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 실시간으로 모니터링 할 측정 된 이온 전류를 중계한다. 이 그림은 [11]에서 수정되었습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 높은 전기장의 현재 흔적 전후의 응용 프로그램입니다. () 설치, 심지어 피라 솔루션을 청소 다음과 같은시, 나노 기공의 전도는 불안정하고 원통형의 10 나노 기공 (파랑)의 예상보다 적습니다. 8 V의 2 초 펄스, 적용 후나노 기공이 완전히 침수 및 확대, 안정된 전도성을 전시 및 생체 분자 검출 실험 (녹색)에 사용할 수있다. (b)의 전력 스펙트럼 밀도의 불완전 습윤 막힌 나노 기공 (각각 블루와 오렌지,)의 플롯. 8 V의 200 밀리 초 펄스의 응용 프로그램에 따라, 나노 기공은 습윤 파편 (녹색, 빨간색, 각각)을 제거 하였다. 이 그림은 [11]에서 수정되었습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 높은 전기장을 이용한 나노 기공이 확대. (a) 증설 및 측정 전위 바이어스 (레드)를 교대하는 나노 기공 (블루)를 통해 이온 전류가 유한 단계로 증가한다는 것을 보여준다. 그 결과 행위ANCE 측정은 나노 기공 직경을 추론하는데 사용될 수있다. 원하는 직경이 달성되면, 프로세스는 정지된다. (B) 전도의 정확한 IV 측정은 나노 기공의 크기가 증가했는지 확인합니다. 그들이 적합 할 수 있고 자신의 대칭 및 오믹 동작이 확인 될 수있는 이러한 플롯은 단일 포인트 전류 값보다 기공 크기의 더 나은 추정을 제공한다. 이 그림은 [11]에서 수정되었습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 에어컨 나노 기공을 통해 DNA 전좌. (150) 값의 바이어스에서 나노 기공의 한면에 dsDNA의 () 또한 (48.5 KBP는) 과도 11 나노 (파란색)의 전도성 트레이스의 봉쇄 및 32 나노 포를 생산ES (레드). (b)는 나노 기공의 각각의 전도성의 히스토그램은 하나의 기준에 해당하는 이산 봉우리 두 번 전좌 이벤트를 표시합니다. 이 그림은 [11]에서 수정되었습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6. 10 nm의 막에 나노 기공의 확대. 10 나노 멤브레인 원래 전시 약간의 전도성 및 비대칭 IV 특성 (오렌지)의 나노 기공. 30 ± 3 V (4 초 지속 시간) 사이의 교류 펄스, 나노 기공 적신다와의 응용 프로그램에 3 나노 기공 (파랑)의 예상과 일관성 전도 이상적인 IV 특성을 나타낸다. ± 3 V의 추가 펄스 (400)는 13 ㎚의 직경을 나노 기공을 확대(녹색). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
나노 기공의 크기의 제어는 생체 분자 감지 애플리케이션에 기본적인 중요하다. 나노 기공 직경은 프로빙되는 분자의 크기의 주문에 있어야한다; 그들은 시료를 수용 할 수있을만큼 충분히 커야하지만, 최적의 신호대 잡음비를 달성 할 정도로 작아야한다. 크기의 컨트롤이 높은 전기 필드를 적용하는 제시하는 방법을 사용하는 동안은 그 나노 기공의 직경에 단방향에만 프로세스 전반에 걸쳐 증가, 3 ~ 100 나노 미터 사이의 직경을 갖는 나노 기공은 나노 미터 이하의 정밀도로, 구식이 될 수 있습니다. 3-4 nm의 기공이 쉽게 TEM (23)을 이용하여 제조 될 수있는 바와 같이, 이것은 부피 단백질 - 리간드 복합체의 상호 작용에 ssDNA를 구조 프로빙에서 다양한 애플리케이션을위한 고체 나노 기공의 안정적인 제조 할 수있는 장점이있다. 100 nm의 상기 나노 기공의 성장이 매우 빠르고 덜 정확하게 될 수있는 반면,보다 온건 확대 조건은 프로세스보다 나은 제어를 달성하기 위해 사용될 수있다. 들로UCH 효과적인 사이즈 제어를 실현하기위한 가장 중요한 단계는 기 확 효율 원하는 세공 직경을 달성하는데 필요한 정밀도 수준을 양립하기 위해 펄스 강도 및 지속 시간의 선택이다. 이 더욱 확대는 낮은 바이어스하지만 비교 전계 강도를 관찰 얇은 나노 기공 (10-nm의 두께)의 확대에 의해 강조된다. 최종 크기에 따라서는 몇 분만에 서브-100-nm의 직경을 나노 기공을 확대하는 것은 일반적으로 가능하다.
이 배경 소음에서 전위 신호를 구별하는 것은 거의 불가능하다 마찬가지로, 큰 저주파 전류 변동은 단일 분자 연구를 배제. 불완전한 24 일로, 초기 제조 (25)와 나노 기공 벽 (13)에 이물질이 흡착 후 남은 잔류 탄소의 존재가 자주 있습니다 강한 화학 치료를 추가 청소를 필요로하는, 신호 품질이 저하 될 수 있습니다nefficacious. 고체 나노 기공 프로토콜 습윤을 보조 또는 드릴링, 이미징 및 취급 과정에서 남은 임의의 오염을 제거하기 위해 장착 전에 피라니아 용액 또는 산소 플라즈마로 나노 기공 청소의 중요성을 강조하기 위해 흥미롭게 것이 일반적이다. 심지어이 치료를하지만, 나노 기공은 종종 젖은하지 않거나 높은 소음을 계속 보게하고, 실패한 시도에 대한 제안 된 솔루션은 매우 시간이 14을 소비 할 수 있습니다 추가 청소를 수행하는 것입니다. 높은 전기장의인가,이 긴 프로토콜은 응용 분야에 따라 필요하지 않을 수도있다. 그것은 대부분의 장치는, 결과적으로 준비 시간 및 가혹한 화학 처리 할 필요성을 감소, 본원에 기재된 방법을 사용하여 반응계 내에서 재 조절 될 수 있다는 것을 발견 하였다. 전기 노이즈를 완화에서 가장 중요한 단계는 완전히 모공을 적시고 느슨하게 결합 파편을 제거하기 위해 전압 및 / 또는 펄스 지속 기간에 단순 증가이다.이러한 방식으로 처리하여 나노 기공을 확실 같은 DNA와 단백질과 같은 생체 분자 통로 전좌 실험에 사용될 수있다. 이러한 분자가 막힌 시끄러운 전기 신호로 이어지는 기공 벽에 부착하는 경우, 높은 전기장 펄스는 장애물을 제거하고 유체 셀에서 나노 기공 칩의 마운트 해제하지 않고, 추가 실험을위한 저잡음 특성을 회복하기 위해 다시 적용 할 수 있습니다.
설명 된 설정을 사용하여 높은 전기장의 적용을 위해 높은 대역폭 (> 1 kHz에서)에서 감도와 저잡음 특성이 결여 10 V 및 전류 증폭기까지 적용 할 수있는 외부 전원의 필요에 의해 제한된다 단일 분자 감지. 일반적인 생명 실험은 ± 1 V로 제한 저잡음 전류 증폭기에 의존하고 있지만, 그것은 adju 높은 전기장 조절하고 민감한 전류 측정을 모두 수행 할 수있는 하나의 시스템을 설계하는 간단안정 이득. 이러한 제한에도 불구하고, 다른 하나의 설정으로의 전환이 빠르고 간단합니다. 그러한 SEM 4.0, 열 산화 및 8을 재편 막의 사용과 같은 나노 기공의 크기를 제어하기위한 기존의 기술에 비해, 높은 전기장이 표준 장비를 이용하여 실험실 벤치에서 수행하고 제공 할 수있는보다 신속하고 정확하고 덜 비싼 방법을 제안 나노 기공 크기의 광범위한. 신속하고 재현성 저주파 소음을 감소 할 수있는 능력은 또한 초기 제작은 믿을 수있는 이전에 사용 모공이 추가 실험을위한 젊어지게 할 수 있으므로, 고체 상태의 나노 기공의 수명을 연장. 전부, 높은 전기 분야와 에어컨 다양한 두께의 나노 기공의 95 % 이상이 생체 분자 검출에 적합한을 렌더링, 약간의 저주파 잡음 특성을 나타내었다. 제작은 고체 상태의 나노 기공 실험이 더를 접근하고, 따라서 더 쉽고 신뢰할연구자에 적합한 용 및 잠재적으로 더 강력한 제조 공정을 통해 나노 기공 기술의 상용화를 향한 경로를 허용한다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 캐나다 자연 과학 및 혁신에 대한 캐나다 재단, 그리고 온타리오 연구 기금의 기술 연구위원회에 의해 지원을 인정합니다. 우리는 나노 기공 소프트웨어 및 계측 설계에 대한 도움 가치있는 토론 및 기술 지원을위한 나노 기공의 제조 및 특성, L. Andrzejewski의 원조 Y. 리우 감사합니다, A. Marziali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JEM-2100F TEM | JEOL | Drilling requires 200 kV accelerating voltage | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | Low-noise voltage and current amplifier | |
| X-Series data acquisition card | National Instruments | PCI-6351 | Interfacing with setup, apply of high electric fields |
| LabVIEW 2012 software | National Instruments | Apply voltages, record current, data analysis | |
| Current amplifier | Keithley | Current amplification during high electric field pulses | |
| 30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005X | Substrate in which nanopores are created |
| 10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005Z | Substrate in which nanopores are created |
| Silicone elastomer O-rings | Marian Chicago | HT6135 | Punched for sealing the nanopore chip |
| Ag/AgCl electrodes | In Vivo Metric | E255 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 52004P | Used for cleaning cells - handle with caution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H323 | Used for piranha solution - handle with caution |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | Used for piranha solution - handle with caution |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P335 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | Buffering KCl solution |
| Primary Faraday cage | Shielding nanopore cell, electrodes | ||
| Secondary Faraday cage | Shielding headstage, electrode wires | ||
| Teflon cell | To hold nanopore chip and reservoirs | ||
| Hot plate | VWR | Heating piranha solution |
References
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