Boyutu ince ayar ve Solid-state nanopores Gürültü en aza indirmek

Summary

Biyomoleküler translokasyon deneyler için çözelti içinde katı-hal nanopores hazırlanması için bir yöntem sunulmuştur. Yüksek elektrik alanların kısa darbeleri uygulayarak, nanopore çapı kontrollü subnanometer hassasiyetle genişlemiş olabilir ve elektriksel gürültü karakteristikleri önemli ölçüde geliştirilmiş. Bu prosedür, deney koşulları altında, standart laboratuar ekipmanı kullanılarak yerinde gerçekleştirilir.

Abstract

Solid-state nanopores gibi nükleik asitlerin ve proteinlerin ¹ gibi tek biyomoleküllerin karakterizasyonu için çok yönlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, ince bir yalıtım zar içinde bir nano-gözeneklere yaratılması zor olmaya devam etmektedir. Özel odaklanmış elektron ışını sistemlerini içeren fabrikasyon yöntemleri iyi tanımlanmış nanopores üretebilir, ancak piyasada mevcut zarlarında, güvenilir ve düşük gürültü nanopores verimi ^2,3 düşük kalır ve boyut kontrol ^4,5 saçma değildir. Burada, ince ayar yüksek elektrik alanların uygulama optimal düşük gürültü performansı sağlarken Nanopore boyutu gösterilmiştir. Yüksek elektrik alanının, kısa darbeler bozulmamış bir elektrik sinyali üreten ve uzun süreli maruz kalma üzerine subnanometer hassasiyetle nanopores büyütülmesi için izin vermek için kullanılır. Bu yöntem, s veriminin ve yeniden üretilebilirliğinin geliştirilmesi, standart laboratuar ekipmanı kullanarak sulu bir ortam içinde yerinde gerçekleştirilirolid-state nanopore fabrikasyon.

Introduction

Biyolojik ve katı-hal nanopores tek molekül düzeyinde ¹ biyomoleküler analitlerinin algılama için bir araç sağlar. Bağımsız nanopores genellikle iki sıvı rezervuar arasında geçmesine iyonik akımı için tek boru sağlayan, ince yalıtım membran gömülür. Daha büyük ölçekli bir Coulter sayacı prensiplerini kullanarak, çok küçük gözenek deneyler bu elektroforetik olarak bir dış elektrik alanı varlığında, bir nano-gözenekler ile tahrik edildiği gibidir yüklü biyomoleküllerin uzunluğu, boyut, yük ve yapısını belirlemek için iyonik akımında bir değişiklik ile ilgilidir.

Böyle α-hemolisin gibi biyolojik nanopores genellikle daha büyük bir duyarlılık ve düşük gürültü özelliklerini ³ sunarken, destekleyen çift katlı lipid uygulanabilirliğini sınırlayan, kırılgan ve sabit bir boyutu. Solid-state nanopores, diğer taraftan, ince (10-50 nm) silisyum nitrür ya da silisyum oksit zarlarında imal edilir ve farklı sIz yapılabilires, kolayca gofret ölçekli teknolojileri ^6,7 ile entegre ve daha sağlam, deneysel koşullarda daha geniş bir aralığı için izin olabilir. Bu avantajlara rağmen, solid-state nanopore teknolojileri biyomoleküler çalışmaları için kullanışlılığını sınırlayan birkaç pratik sakıncaları muzdarip. Küçük gözenek boyutunun kontrolü mümkün olsa da, bu özel bir donanım ve kalifiye personel gerektiren, elde etmek için genellikle, pahalı ve zahmetli bir iştir. Örneğin, odaklanmış iyon demeti tarafından açılan nanopores yakın bir tarama elektron mikroskobu (SEM) ^5'te belirli deney koşulları altında küçültmek için gösterilmiştir. Diğer yaklaşımlarda, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından açılan nanopores ışın koşulları ve sulu çözücülerin ⁸ sonraki maruz bağlı olarak genişletmek veya küçültmek olabilir. Nanopore büyüklüğü kimyasal muamele ya da aşağıdaki değişiklik gibi, bu durumda da, çok küçük gözenek boyutları elde aralığı sınırlı kontrolü zor ve hatta güvenilmezBelirli bir sıvı ortamda ⁹ içine daldırıldığında.

Solid-state nanopores aracılığıyla iyonik akım da yüksek gürültü muzdarip olabilir, kaynaklarıdır nanopore literatürde ^2,3,10,11 bir yoğun araştırıldı konudur. Çeşitli yöntemler, elektriksel gürültüyü azaltmak için önerilmiş olsa da, güvenilir ve kararlı düşük gürültü nanopores verimi tipik olarak düşüktür. Sondaj ve görüntüleme sırasında karbonlu artıkların birikmesi sıklıkla tam ıslatma bir meydan okuma yapma ve ¹² kaldırmak için zor olabilir nanobubbles oluşumuna neden, elektrik sinyali kalitesi üzerinde zararlı etkileri olabilir. Ayrıca, analit molekülleri tarafından Nanopore tıkanma sinyal kalitesi render başka deneyde ^13,14 için kullanılamaz hale gözenekleri düşürür. Toplamda, bu etkileri büyük ölçüde işlevsel Nanopore cihazların verimini azaltır ve katı-hal Nanopore araştırma ile ilişkili maliyetini artırabilir.

Uygulamalar0,15-0,3 V / nm aralığında yüksek elektrik alanları üretmek için Ag / AgCl elektrotlu bir voltaj tion, bu sorunlar için şaşırtıcı derecede basit bir çözüm sunar. Kısa voltaj darbeleri, tek-molekül çalışmalar için temiz, düşük gürültü Nanopore yüzey ideal döngüsel uygulama sayesinde üretilir. Yüksek elektrik alanlarına uzun süre maruz kalmak küçük gözenek çapında bir artışa neden gözenek duvarı oluşturan zar malzemesi, kaldırılmasını başlatır. Bu büyüme, tam olarak darbe gücü ve süresi ayarlanması sureti ile kontrol edilebilir. Moleküller nanopore yüzeye adsorbe olarak mevcut izleri nedeniyle Nanopore tıkanma bir deney boyunca aşağılamak gibi, bu süreç aksi takdirde iptal olurdu tıkalı cihazları kurtarmak için tekrar edilebilir. Bu nedenle, fonksiyonel nanopores verimi daha da birden çok kez, aynı cihazı kullanma yeteneği artar. Bu hızlı bir şekilde deneysel altında sıvı içinde gerçekleştirilir ki bu yöntem çeşitli avantajlar sağlarkoşullar, ancak standart laboratuar ekipmanı gerektirir yazılımı ile otomatik olabilir ve% 95 üzerinde bir verimle fonksiyonel, yüksek kaliteli nanopores üretir.

Protocol

1.. Nanopore Fabrikasyon ve Temizlik

Not: Bir küçük gözenek yalıtıcı bir zar bulunmaktadır kez aşama 2'de tarif edildiği gibi, doğrudan, ya da daha fazla işlem temizleme olmadan sıvı hücre içinde monte edilebilir. Veya oksijen plazmaya ² maruz: Bu deneyler arasında kirleticilerin izlerini kaldırmak için gerekli olan, ancak, nanopore cips piranha çözüm ^3,15,16 (H ₂ O ₂ 03:01 H ₂ SO ₄₎ kullanılarak temizlenebilir. Bu nedenle, pirana çözeltisine maruz bırakılarak ön yıkama gerekli değilse, aşağıdaki protokolde 1,2-1,9 isteğe bağlı adım.

1. Gazını 40 ° C'de 30 dakika boyunca bir sonikatöre vakum altına yerleştirilerek deiyonize (Dİ) su, süzüldü
2. Dikkatli bir şekilde 3 ml 1 mi, ardından hidrojen peroksit sülfürik asit eklenerek bir 10 ml beher içine pirana çözelti hazırlayın. Pipet içinde geri akışlayarak iyice karıştırın. DİKKAT: Piranha çözümü son derece tehlikelidir. Lütfen ta tüm tedbirleri ke.
3. Aside dayanıklı cımbız kullanarak, dikkatle tamamen çip daldırın ve yüzeyinde yüzen bunu önlemek için piranha çözüm içine kenar ilk nanopore içeren zar çipi takın.
4. Filtrelenmiş su ile iyice durulayın cımbız.
5. 90 ° C'ye kadar bir sıcak plaka üzerinde önceden behere koyun ve en az 30 dakika boyunca temizlenir izin verir.
6. Dikkatlice temiz bir cam pipet kullanarak kaptan piranha çözüm kaldırmak ve bol miktarda su içinde atın.
7. Temiz bir cam pipet kullanarak durulama için beher içine adım 1.1 gazı giderilmiş iyonu giderilmiş suyun 5 ml ekleyin. Su çıkarmak ve en az 5x tekrarlayın.
8. Dikkatle temiz, keskin uçlu cımbız kullanarak beherlerinden nanopore çipi çıkartın. Nanopore membran çok kırılgan olduğu gibi aşırı dikkatli olun.
9. Hafifçe bir aspiratör kullanarak kenarına emme uygulanarak çipi kurutun. Kullanıma hazır olana kadar temiz Petri kabındaki çipi saklayın.

ve_title "> 2. nanopore Montaj

1. % 20 nitrik asit çözeltisi içinde yerleştirilmesi ve 10 dakika için kaynatma ile Teflon nanopore hücre (Şekil 1) temizleyin. DİKKAT: Tüm gerekli kişisel koruyucu donanım kullanın ve dikkatle asitleri anlaştım.
2. 10 dakika boyunca dikkatli bir şekilde kaynar DI su içinde, nitrik asit ve yerden hücre çıkarın.
3. Nitrik asidin tam olarak çıkarılmasının sağlanması için ek bir 10 dakika boyunca DI su içinde hücreyi kaynatın. Sıcak plakadan beher çıkarın ve bu sırada oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
4. Beher gelen hücre çıkarın ve filtre edilmiş hava ya da kuru bir _N2 ile darbe. Temiz Petri kabındaki hücre saklayın.
5. Gazını 40 ° C'de 30 dakika boyunca bir sonikatöre vakum altına yerleştirilerek (pH 8 HEPES ile tamponlanmış) KCI çözeltisi süzüldü
6. En az 10 dakika boyunca etanol içinde sonike her küçük gözenek çip için temiz, iki silikon elastomer contalar.
7. Temiz bir elastomer conta varlık carefu üzerinde nanopore çip yerleştirinconta açıklığı olan membran penceresi hizalamak için l. Yerleştirin ve çip üstüne ikinci bir conta hizalayın.
8. Temizlenen nanopore hücrenin bir yarısının rezervuar girişine çipi ve contalar yerleştirin. Yerine diğer yarısı vidalanarak hücre bir araya getirin. Nanopore hücre bileşenlerinin bir dağıtılmış görünüşüdür, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
9. Hücre rezervuar içine pipetle etanol ve birkaç kabarcıkları girişleri çıkmak için görülür kadar bir vakum odası içinde yerleştirerek nanopore çip ıslatın.
10. KCl, süzüldü çözeltisi gazı alınmış en az 3 ml rezervuarları yıkama ile etanol çıkarın. Bir aspiratörü kullanarak taşma kaldırmak için özen gösterin.

3. Nanopore Karakterizasyonu

1. Elektriksel ekranlı deney kurulumunda nanopore hücre yerleştirin ve her rezervuar Ag / AgCl elektrotlar yerleştirmek. Bu kurulum olarak, dış güç kaynağı ve akım amplifikatör haricinde, Şekil 2'de gösterilene benzer,düşük gürültü direnç geri besleme amplifikatörü ile değiştirilir.
2. Voltaj-kıskaç modunda düşük parazitli bir amplifikatör kullanılarak, +200 mV -200 mV ile süpürme ve IV özelliklerinin kayıt potansiyelleri geçerlidir.
3. Çözelti ^17, çapı hesaplamak için kullanılabilir küçük gözenek iletkenliği elde etmek için IV eğrisi monte edin. Hesaplanan çap TEM görüntüleme beklenenden çok daha küçük ise, gözenek tam olarak muhtemelen ıslatılmış değildir ve / veya artık veya kontaminasyonu içerir.
4. Nanopore genelinde 200 mV potansiyeli uygulayın ve 30 saniye için iyonik akımı kaydedebilirsiniz.
5. Iyonik akımın bir güç spektral yoğunluğu (PSD) analizi gerçekleştirmek ve nanopore elektriksel gürültü özelliklerini ölçmek için entegre. Gürültü 5 kHz bant genişliği 15 pA RMS üzerinde ise, o zaman gözenek tam olarak ıslanmamış muhtemeldir ve / veya kirlenme ihtiva eder ve güvenilir bir deneyde kullanılamaz.

4. Yüksek Elektrik Fie kullanma Yastıkları Nanoporeslds

Not: IV eğrisi sergilenen asimetri veya daha az beklenenden iletkenlik oluşturulan veya mevcut iz düşük frekanslarda istikrarsızlık ve yüksek gürültü seviyelerini gösterdi, bu gözenek üzerinde herhangi bir kontaminasyonu temizlemek için yüksek elektrik alanları ile Nanopore durum için gerekli yüzey ve / veya gözenek ıslak. Bu yöntem, zar ya da kapasitans ölçümlerinde kullanılan mevcut amplifikatörünün girişine bağlanmış bir parazit kapasitans kaynaklanan yüksek frekanslı gürültü etkilemez birlikte, (aynı zamanda 1 / f gürültü olarak da adlandırılır), düşük frekanslı gürültü ¹⁸ büyük ölçüde azaltılabilir. Bu kurutma gerçekleştirmek için kullanılan bir düzeneğin şematik Şekil 2 'de gösterilmiştir.

1. Patch-kelepçe amplifikatör elektrotları çıkarın.
2. Üretme yeteneğine sahip bir bilgisayar kontrollü güç kaynağına elektrotların bir geç> 6 V (> 0.2 V / nm elektrik alanı burada kullanılan 30 nm kalınlığında bir membran için kuvvet) ve e, diğergerçek zamanlı olarak izlenebilir akım amplifikatör xternal.

   Not: yüksek elektrik alanlarının uygulama çeşitli zar malzemeleri ve kalınlıklarda nanopores durum için kullanılabilir. Aksi belirtilmedikçe, her ikisi de 30 nm ve 10 nm membranlar Burada ele olmakla birlikte, tarif edilen gerilimleri 30 nm kalınlığında bir membran için kullanılan bakın.

3. En az 5 saniye boyunca nanopore genelinde 400 mV (ölçüm voltaj) bir potansiyel farkı uygulanması.
4. Nanopore iletkenliği belirlemek için veri son 1 sn den ortalama akım değerini hesaplayın. En olası geometrisine göre yazılım ve seçim nanopore iletkenlik modeli kullanılarak otomatik olarak yapılmalıdır bu iletkenlik göre nano-gözeneklere, çapını hesaplamak. Bu IV eğrisinden ölçülen çapma uygun olmalıdır.
5. Bir ölçüm süresi 5 saniye, ardından 0.2 V / nm arasında bir elektrik alanı oluşturmak için nano-gözeneklere boyunca 6 V bir 200 msn darbesi (ıslatma voltaj) uygulayın400 mV'de. Yine, verilerin son 1 saniye ile nano-gözenekler bir çapı hesaplamak ve nanopore tamamen ıslak olduğundan emin olmak için TEM ölçümlerinden tahmin değeri ile karşılaştırılması. Gerekirse birkaç kez tekrarlayın.
6. Gerektiğinde, ölçüm süresi boyunca akım sinyali kadar artan gerilim ile yüksek elektrik alan palslarının uygulanmasını tekrar istikrarlı ve beklenen iletkenlik gösteren. Bu önemli ölçüde büyütmek ya da hızla Nanopore zarar verebilir gibi, 10 V (yani> 0.3 V / nm) aşmayacak şekilde tavsiye edilmez.

5. Yüksek Elektrik Alanları Kullanarak nanopores büyütme

Not: nano-gözeneklere çapı özel bir uygulama için, biyomoleküler algılama işlevselliği belirlenmesinde önemlidir. Bu amaçla, çok küçük gözenek çapı, uygun temiz ve ıslatmak için kullanılan aynı ayarı ile elde edilene kadar bir TEM yüksek elektrik alanları uygulanarak istenen bir boyuta büyütülebilir kullanılarak oluşturulannanopore (Şekil 2).

1. Bölüm 4 ile aynı elektronik konfigürasyonu kullanılarak, bir çap ölçümünü elde etmek için gözenek boyunca 200-500 mV önyargı geçerlidir. Bir IV eğri uydurma daha az hassas olsa da, tek bir nokta ölçümü yaklaşık hızla nanopore büyüklüğünü tahmin etmek için de kullanılabilir.
2. 400 mV en az 5 saniyelik bir ölçüm süresi ardından nano-gözeneklere çapında 8 V bir 2 saniye darbe uygulanır. Yeni çapının hesaplanması genellikle Nanopore boyutu çok küçük bir artış (<0.1 nm) gösterecektir.
3. Situ ve nanopore çapı artan gerçek zamanlı ölçümler elde etmek için büyütme ve ölçüm gerilimleri arasında değişen, periyodik bu işlemi tekrarlayın.
4. Daha hızlı bir büyüme oranı arzu edilir ise, gözenek 0.03 nS / s ile ec & # arasındaki iletkenlik artış oranı ile genişledikçe tipik olarak hızlanır 10 V. Büyüme kadar aşamalı olarak uygulanan voltajın büyüklüğünü artırmak160, 10 nS / saniye, elektrik alanının küçük gözenek, kuvvet ve elektrolit solüsyonu özellikleri boyutuna bağlı olarak değişebilir.
5. İstenen çap ulaşıldığında, yüksek elektrik alanları uygulanmasını durdurur. Bu bilgisayar programı kullanılarak otomatik olarak yapılabilir.
6. Elektrotlara patch-clamp amplifikatör takın.
7. Yukarıda 3.5 - nanopore çapı onaylamak ve adımları 3.2 gibi düşük gürültü akım sinyallerini doğrulamak için 200 mV yeni IV ve mevcut izleme verilerini edinin. Gerekirse, klima ve büyütme protokolü (4,1-5,5 adımları) tekrarlayın.

6. DNA Translokasyon

1. Önce bir Biyomoleküler örnek ekleyerek, rezervuar hiçbir kirlenme olduğunu sağlamak için bir kontrol deneyini gerçekleştirmek. Geçerli bir blokajlar 2 dakika sonra tespit doğrulamak için bir örnek yokluğunda 150-300 mV uygulanan potansiyelin altında bir akım izleme elde edin.
2. Için λ DNA (48.5 KBP çift sarmallı) Ekle <em> 0.5-2 ng / ul son konsantrasyon için cis rezervuar. Rezervuar boyunca numunenin homojen dağılımını sağlamak için en az 10 saniye boyunca pipet ile hafifçe geri akışa.
3. , 30 nm kalınlığında bir nano-gözenekler için, trans hazneye 150-300 mV potansiyel bir önyargı uygulamak ve nano-gözeneklere geçen iyonik akım ölçer. Çok kısa bir translokasyon olaylar için, nispeten yüksek bir alçak geçirgen filtre frekans (100 kHz) ile yüksek frekansta (250 kHz veya daha fazla) da örnek için tercih edilir.
4. Moleküller Nanopore aracılığıyla transloke olarak geçici akım barikatları algılamak için yazılım kullanarak iyonik akımını izlemek. Moleküler translokasyon iyonik mevcut izleri tıkanıklık derinliği, süresi ve ilgi numunesi hakkında bilgi anlaması sıklığını belirlemek için analiz edilebilir. Translocating moleküller hakkında bilgiler bilinmektedir Tersine, eğer, bu veriler nanopore kendisi özelliklerini incelemek için kullanılabilir.

Representative Results

Bu çalışmada kullanılan nanopores 30 nm veya 10 nm kalınlığında bir silikon nitrit zar pencereler açılmıştır. Açıklanan protokol çeşitli malzeme katı-hal nanopores herhangi bir yöntemi kullanılarak imal uygulanabilir olsa da, genellikle daha önce kurulmuş protokolleri ^11,14 kullanarak TEM ile delinir. TEM tarafından delinmiş Nanopores çapı 4-8 nm (Şekil 2) arasında genellikle bulunmaktadır. Her ikisi de 30-nm ve 10 nm kalınlığında membranlar monte ve yukarıdaki protokolünü kullanarak klimalı edilebilir olsa da, açıklanan gerilim önyargıları aksi belirtilmedikçe 30-nm kalınlığında zarları için gerekli olan bakın. Farklı boyutta membran için, uygulanan voltaj nano-gözenekler içinde 0,15-0,3 V / nm aralığında bir elektrik alanı oluşturmak için ayarlanmalıdır.

Şekil 3a, 30 nm kalınlığında bir zar içinde bir 10 nm nano-gözeneklere iki tipik iletkenlik izleri önce ve yüksek elektrik alanları ile muamele edildikten sonra gösterilmektedir. Yeni d üzerine monteNanopore rilled, dengesiz ve gürültülü iyonik akım sinyalini elde düşük frekanslı dalgalanma yüksek derecede sergileme olasılığı genellikle yüksektir. Şekil 3a'da gösterilen bu küçük gözenek davranışı vurgulamaktadır. Bu iletkenlik nedeniyle eksik ıslatma için en olası büyüklüğü, bir nano-gözeneklere için beklenenden önemli ölçüde daha azdır. 8 V bakliyat (2 sn süresi 90 bakliyat) tarafından üretilen büyüklüğü 0.27 V / nm yüksek elektrik alanların başvuru üzerine, nanopore tamamen ıslak olur ve daha sonra çapı 21 nm büyütülür. Bu noktada, gözenek düşük gürültü özellikleri ile kararlı bir iletkenlik sergiler. Benzer olan nano-gözeneklerde gürültü nicel analizi, Şekil 3b'de güç spektral yoğunluğu araziler olarak gösterilir. Unwet ve / veya tıkanmış gözeneklerin düşük frekanslı gürültü genlik deneyde kullanılamaz onları render (> 20 pA RMS) çok yüksektir. Yüksek elektrik alanları, düşük frekanslarda gürültü gücü (<10 kHz) ile klima diminis olduğunu Upon3'e kadar büyüklükte emir ve düşük gürültü deneyler için hazır tarafından hed.

Uygulanan potansiyel büyütme ve düşük elektrik alan ölçüm dönemleri için yüksek elektrik alanlar arasında darbeli olarak Şekil 4a tipik bir akım ölçümü gösterir. Ardışık her bir palsta sonra, (örneğin, küçük gözenek iletkenliği) ölçüm voltajı da nano-gözeneklere yoluyla elde edilen iyonik geçerli sınırlı bir miktarda arttırır. Bu çap d ​​etkili uzunluğu l _eff silindirik bir geometriye sahip olarak Nanopore yakın, iletkenlik σ eden bir çözelti içerisinde kendi iletkenliği G anlaşılacağı gibi nanopore, boyut olarak artmış olduğunu göstermektedir. Diğer çeşitli modeller geometrisi ^17,19-21 ile nanopore iletkenlik ilişkin için mevcut olmakla birlikte, bir geometrik terim ve bir erişim direnç terim içeriyor aşağıdaki ilişki, yüksek tuz TEM-delinmiş nanopores için geçerli kanıtlanmıştırdsDNA translokasyon ^17,22 için ilgi çekici geniş bir çap aralığında konsantrasyonları.

İstenen çap ulaşıldığında, bu işlem otomatik olarak yazılım tarafından durdurulur. Şekil 4b'de gösterildiği gibi, elde edilen küçük gözenek çapı, daha sonra kesin IV ölçümleri kullanılarak teyit edilebilir.

Yüksek elektrik alanlarını kullanarak tedavi nanopores tamamen fonksiyonel olduğunu not etmek önemlidir. Şekil 5a'da gösterilen iletim izleri de gösterildiği gibi, λ DNA translokasyon tespiti ile doğrulanır. Bu şekilde, dsDNA tarif edilen yöntem kullanılarak 11 nm ve 32 nm genişletilmiştir iki nanopores ile tahrik edilir. Her durumda, temel iletkenlik son derece kararlı ve dsDNA molekülleri nanopore aracılığıyla transloke gibi net barikatlar yüksek sinyal görüntüleniyor gözlenmektedir-Gürültü tek-molekül translokasyon yüksek gürültü sergilemek işlenmemiş gözenekleri göre olaylar. Şekil 5a ilavelerde gösterildiği gibi, bu boyuttaki nanopores için beklendiği gibi ayrı ayrı katlanmış molekülleri, yerini değiştirmek gibi, bir çok ayrı blokaj seviyeleri gözlenir. Her bir gözenekten translokasyon olaylar sırasında nanopore iletkenlik histogramları Şekil 5b'de gösterilmiştir. Ve çift tıkanma durumları (iki DNA ipliklerini kapandı -) - nanopores düşük gürültü özellikleri başlangıca tekabül ayrı, kolayca çözülebilir zirveleri (hayır DNA), tek (katlanmamış bir DNA iplikçik) ortaya koymaktadır. Dikkat çekici gözenek işgal eden tek bir dsDNA moleküle karşılık iletkenlikteki değişiklik büyük ve küçük nano-gözeneklerde için farklı olduğu bir gerçektir. Bu, diğer gözenekler veya çatlak t oluşturulmaktadır olsaydı, yüksek elektrik alanların uygulama aynı blokaj genlik gözlemlenebilir gibi, mevcut nanopores büyütme aslında bu dolaylı kanıt sağlaro işlemi sırasında ¹⁷ zar.

Benzer şekilde, Şekil 6, farklı bir kalınlıkta membran imal nanopores büyütmek için yüksek elektrik alanlarının etkinliğini göstermektedir. İşte, bir 10-nm SiNx zarında oluşturulan bir nanopore dengesiz ve nispeten küçük iletkenlik görüntüleme, başlangıçta kısmen unwet olduğunu. ± 3 V alternatif başvurusu üzerine, 4 saniye süresince (30 toplam) bakliyat (0,3 V / nm ±), nanopore ıslak olur ve 3 nm gözenek için idealdir IV özellikleri sergiler. Metodoloji sonra 400 sonraki darbeler için tekrarlandı ve nanopore 8 nm genişletildi. Bu büyütme, benzer elektrik alanlarına gerçekleştirilebilir, ancak 30 nm zarlarında imal edilmiş olan nano-gözeneklerde için daha düşük tatbik edilen voltaj önyargı, işlem esas olarak tahrik edilen elektrik alanı olduğunu göstermektedir. Daha ince bir zar içinden translokasyonu ile üretilen akım blokajı ince zarlarında kalın gözenekler, nano-gözeneklerde üretilen daha büyük olduğuBu şekilde muamele edilmiş bu tür artan duyarlılığı ile proteinler gibi daha kısa moleküller incelemek için kullanılabilir.

Şekil 1. Nanopore hücre montaj. Nanopore içeren bir silisyum nitrür membran elektrolit rezervuarları içeren iki Teflon yarı-hücreleri tarafından sıkıştırılmış sırayla olan silikon elastomer contaların arasına yerleştirilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. Nanopore klima ve kurulum büyütme. 30 nm kalınlığında silisyum nitrür membran (solda) açılan bir nanopore iki elektrolit rezervuarları bağlar. ABilgisayar bir yama kelepçe amplifikatör veya elektrolit rezervuarlarda dalmış Ag / AgCl elektrotlar aracılığıyla nanopore genelinde potansiyel bir önyargı geçerlidir harici güç kaynağı (DAQ kartı) ya da kontrol etmek için kullanılır. Geçerli amplifikatör bilgisayar yazılımı kullanarak gerçek zamanlı olarak izlenebilir ölçülen iyonik akım röleleri. Bu rakam [11] modifiye edilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. Yüksek elektrik alanların Mevcut izleri öncesi ve sonrası uygulama. (A) montaj ve hatta pirana çözeltisi ile temizlerken, aşağıdaki üzerine, nanopore iletkenlik kararsız ve silindirik bir 10 nm gözenekli (mavi) için beklenenden daha azdır. 8 V 2 sn bakliyat, uygulandıktan sonraNanopore tamamen ıslanması ve genişlemiş, istikrarlı iletimi sergileyen ve biyomoleküler algılama deneyler (yeşil) için kullanılabilir edilir. (B) güç spektral bir eksik ıslatılmış ve tıkanmış Nanopore (sırasıyla mavi ve turuncu,) araziler. 8 V 200 msn bakliyat uygulanması üzerine, nanopores ıslatılmış ve moloz (yeşil ve kırmızı, sırasıyla) uzaklaştırılmıştır. Bu rakam [11] modifiye edilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 4. Yüksek elektrik alanları kullanarak büyütme nanopore. (A) genişleme ve ölçüm potansiyel önyargıları (kırmızı) arasında Alternatif nanopore (mavi) ile iyonik akım sonlu adımda artırdığını ortaya koymaktadır. Çıkan davranışance ölçüm nanopore çapı anlaması için kullanılabilir. İstenen çap elde edildikten sonra, işlem durdurulur. (B) iletkenlik hassas IV ölçümleri Nanopore boyutları artmıştır onaylayın. Bunlar uygun olabilir ve simetrik ve omik davranış teyit edilebilir araziler gibi tek nokta akım değerleri daha gözenek boyutundan daha iyi bir tahmin sağlar. Bu rakam [11] modifiye edilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,. Klimalı nanopores aracılığıyla gerçekleştirilen DNA translokasyon. 150 mV bir önyargı de nano-gözeneklere bir tarafına dsDNA (a) bir ek (48.5 kbp) geçici 11 nm (mavi) ve iletkenlik izleri blokajlar ve 32 nm por üretires (kırmızı). (B) nano-gözeneklerde her iletkenlik histogramları bir taban çizgisine karşı gelen ayrı tepe ve çift translokasyon etkinlik göstermektedir. Bu rakam [11] modifiye edilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 6,. 10 nm membranların nanopores Genişleme. 10 nm zarı, ilk sergiler çok az iletkenlik ve asimetrik IV karakteristikleri (turuncu) bir Nanopore. 30 ± 3 V (4 sn süre) arasında değişen bakliyat, nanopore ıslatır ve uygulama üzerine 3 nm gözenek (mavi) için beklenen tutarlı bir iletkenliğindeki ile ideal bir IV özellikleri sergiler. ± 3 V bir başka 400 darbeleri 8 nm çapa Nanopore büyütür(Yeşil). resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Discussion

Nanopore boyut kontrolü biyomoleküler algılama uygulamalarında temel bir öneme sahiptir. Nano-gözeneklere çapları problanmış olan moleküllerin büyüklüğü sırasına olmalıdır, bunlar örnek karşılamak için yeterince büyük, ancak en uygun bir sinyal-gürültü elde etmek için yeterince küçük olmalıdır. Boyutunun kontrol yüksek elektrik alanı uygulanması sunulan yöntemi kullanırken bu küçük gözenek çapları, yalnızca tek yönlü işlem boyunca artar, 3-100 nm arasında çaplara sahip nanopores subnanometer hassasiyetle moda olabilir. 3-4 nm gözenekleri hemen bir TEM ²³ kullanılarak imal ^edilebilir, bu hacimli ligand-protein komplekslerinin etkileşimine ssDNA yapı tarama gelen geniş bir uygulama yelpazesi için katı-hal nanopores güvenilir bir imalat sağlar. 100 nm üzerinde küçük gözenek büyüme çok hızlı ve daha az hassas olabilir, daha ılımlı koşullar büyütme işlemi üzerinde daha iyi kontrol sağlamak için kullanılabilecektir. S olarakuch, etkili boyutu kontrolü sağlamak için en önemli adım büyütme verimliliği ve istenilen gözenek çapı ulaşmada gerekli hassasiyet seviyesini dengelemek için darbe gücü ve süresi seçimdir. Bu daha fazla genişleme düşük bir önyargı ancak karşılaştırılabilir elektrik alan kuvveti görülmektedir tiner nanopores (10-nm kalınlık), genişleme ile vurgulanır. Son boyutuna bağlı olarak, bir kaç dakika içinde alt-100-nm çaplarına Nanopore büyütmek için genel olarak mümkündür.

Bu arka plan gürültü translokasyon sinyallerini ayırt etmek neredeyse imkansız olduğu gibi benzer şekilde, büyük düşük frekans akım dalgalanmaları tek-molekül çalışmalarını engellemektedir. Eksik ²⁴ ıslatma, ilk üretim ²⁵ ve nanopore duvara ¹³ enkaz emilmesinden sonra kalan karbonlu kalıntıların varlığı genellikle i olan sert kimyasal tedaviler ile ek temizlik gerektiren, sinyal kalitesini düşürebilirnefficacious. Solid-state nanopore protokoller ıslanmasına yardımcı veya delme, görüntüleme ve işleme süreçlerinden arta kalan herhangi bir kontaminasyonu temizlemek için montaj önce piranha çözüm veya oksijen plazma ile Nanopore temizlik önemini vurgulamak için İlginçtir, bu yaygındır. Hatta bu tedavi ile, ancak, nanopores sık sık ıslak değil yapmak ya da yüksek gürültü sergilemeye devam ve başarısız girişimleri için önerilen çözüm son derece zaman alıcı olabilir ¹⁴ ek temizlik yapmaktır. Yüksek elektrik alanların uygulama ile, bu uzun protokoller, uygulamaya bağlı olarak gerekli olmayabilir. Bu aygıtların çoğu zaman sonuç olarak hazırlanması ve sert kimyasallar ile başa çıkmak için gereksinimini azaltır, burada tarif edilen yöntem kullanılarak in situ yenilenmiş edilebilir olduğu bulunmuştur. Elektriksel gürültü azaltıcı en önemli adımlar tamamen gözenek ıslak ve gevşek bağlı enkaz kaldırmak için voltaj ve / veya darbe süresi basit bir artış var.Bu şekilde muamele edilmiş Nanopores güvenilir bir DNA ve proteinlerin geçişi olarak biyomolekül translokasyon deneylerde de kullanılabilir. Bu moleküller bir tıkanmış ve gürültülü elektrik sinyaline yol açan gözenek duvarına yapışır ise, yüksek elektrik alan bakliyat engeli çıkarın ve akışkan hücreden nanopore çip ayrılması olmadan, daha sonraki denemeler için düşük gürültü özelliklerini kazanmak için yeniden uygulanabilir.

Açıklanan kurulumu kullanarak yüksek elektrik alanların uygulama için yüksek bant genişliği (> 1 kHz) de hassasiyeti ve düşük gürültü özelliklerini eksikliği 10 V ve akım amplifikatörü, kadar uygulayabileceğiniz bir harici güç kaynağı ihtiyacı ile sınırlıdır tek molekül algılama. Tipik Biyomoleküler deneyler ± 1 V ile sınırlıdır düşük gürültü akım amplifikatörü güveniyor iken, bir Adju yüksek elektrik alan klima ve hassas akım ölçümü hem de başarabileceği tek bir sistem tasarımı basittiristikrarlı kazanç. Bu sınırlamaya rağmen, diğer bir kurulumdan geçiş hızlı ve basittir. Örneğin SEM ^5, termal oksidasyon ve ^8, şekillendirme zarın kullanımı gibi küçük gözenek boyutunu kontrol etmek için var olan teknikler ile karşılaştırıldığında, yüksek bir elektrik alanı standart ekipmanlar kullanılarak laboratuar tezgah üzerinde yapılır ve temin edilebilir, daha hızlı, daha hassas ve daha ucuz bir yöntem tavsiye Nanopore boyutları daha geniş bir dizi. Hızlı ve tekrarlanabilir düşük frekanslı gürültüyü azaltmak için yeteneği de ilk üretim daha güvenilir hale getirir ve daha önce kullanılan gözenekler daha fazla deneyler için gençleşmek gibi, katı-hal nanopores ömrünü uzatır. Toplamda, yüksek elektrik alanları ile klimalı değişen kalınlıklarda nanopores% 95 üzerinde biomolekül algılama için uygun hale getirilerek, çok az düşük frekanslı gürültü karakteristiği sergiledi. Fabrikasyon solid-state nanopore deneyleri daha accessi yapma, böylece daha kolay ve daha güvenilirAraştırmacılara ble ve potansiyel olarak daha güçlü fabrikasyon süreçleri aracılığıyla Nanopore teknolojilerin ticarileştirilmesi yönünde bir yol için izin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JEM-2100F TEM	JEOL		Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier	Molecular Devices		Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card	National Instruments	PCI-6351	Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software	National Instruments		Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier	Keithley		Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows	Norcada Inc.	NT005X	Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows	Norcada Inc.	NT005Z	Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings	Marian Chicago	HT6135	Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes	In Vivo Metric	E255
Nitric acid	Fisher Scientific	52004P	Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H323	Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid	Fisher Scientific	A300	Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride	Fisher Scientific	P335
HEPES	Fisher Scientific	BP310	Buffering KCl solution
Primary Faraday cage			Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage			Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell			To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate	VWR		Heating piranha solution