Finjustering av størrelse og minimere støy av Solid-state Nanopores

Summary

En metode for å forberede solid-state nanopores i løsning for biomolekylære trans eksperimenter er presentert. Ved å anvende korte pulser av høye elektriske felt, kan diameteren nanopore bli styrbart utvidet med subnanometer presisjon og dens elektriske støyegenskaper betydelig forbedret. Denne prosedyren utføres in situ ved å bruke standard laboratorieutstyr under eksperimentelle betingelser.

Abstract

Solid-state nanopores har dukket opp som et allsidig verktøy for karakterisering av enkelt biomolekyler som nukleinsyrer og proteiner ^en. Men etableringen av en nanopore i et tynt isolerende membran er fortsatt utfordrende. Fabrikasjon metoder som involverer spesialiserte fokusert elektronstråle systemer kan produsere veldefinerte nanopores, men utbyttet av pålitelige og støysvake nanopores i kommersielt tilgjengelige membraner fortsatt lav ^2,3 og størrelse kontroll er nontrivial ^4,5. Her, bruk av høye elektriske felt for å finjustere størrelsen på nanopore samtidig sikre optimal lav støy ytelse er demonstrert. Disse korte pulser av høy elektrisk felt brukes til å produsere en perfekt elektrisk signal og gir mulighet for utvidelse av nanopores med subnanometer presisjon ved langvarig eksponering. Denne metoden utføres in situ i et vandig miljø ved hjelp av standard laboratorieutstyr, forbedring av utbytte og reproduserbarheten solid-state nanopore fabrikasjon.

Introduction

Biologisk og solid-state nanopores være et middel for sensing biomolekylære analytter på ett molekyl nivå ^en. Individuelle nanopores er typisk innleiret i tynne isolerende membraner, noe som gir den eneste ledning for ionisk strøm til å passere mellom to væskereservoarer. Ved hjelp av prinsippene for større skala Coulter counter, nanopore eksperimenter relaterer endringer i ionisk strøm for å bestemme lengde, størrelse, ladning og bekreftelse av ladede biomolekyler som de er elektroforetisk drevet gjennom en nanopore i nærvær av et eksternt elektrisk felt.

Mens biologiske nanopores som α-hemolysin vanligvis gir større følsomhet og lav støyegenskaper ^3, er bære lipid-dobbeltlag skjør og av fast størrelse, noe som begrenser deres anvendbarhet. Solid-state nanopores, på den annen side, blir fremstilt i tynn (10-50 nm) silisiumnitrid eller silisium-oksid-membraner, og kan være laget av forskjellige sizes, være lett integreres med wafer-skala teknologier ^6,7, og er mer robust, noe som åpner for et bredere spekter av eksperimentelle forhold. Til tross for disse fordelene, solid-state nanopore teknologier lider av flere praktiske ulemper som begrenser nytten sin for biomolekylære studier. Selv om kontroll av nanopore størrelse er mulig, er det vanligvis dyre og arbeidskrevende å oppnå, og krever spesialutstyr og faglært personell. For eksempel har nanopores boret av fokusert-ionestråle nylig blitt vist til å krympe under spesielle eksperimentelle forhold i et skanning elektronmikroskop (SEM) ^5. I andre tilnærminger, kan nanopores boret av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) utvide eller krympe avhengig av strålen forhold og påfølgende eksponering for vannløsemidler ^åtte. I disse tilfeller, er begrenset, er vanskelig å kontrollere, og selv upålitelig den oppnåelige spekter av nanopore størrelser som størrelsen på nanopore endre følgende kjemiske behandling ellernår nedsenket i en bestemt flytende miljø ^9..

Den ioniske strømmen gjennom solid-state nanopores kan også lider av høyt støy, kildene som er et intenst undersøkt tema i nanopore litteratur ^2,3,10,11. Mens ulike metoder har vært foreslått å redusere elektrisk støy, er utbyttet av pålitelige, stabile støysvake nanopores vanligvis lav. Nedfall av karbonholdige avleiringer under boring og bildebehandling kan ha skadelige effekter på det elektriske signalkvalitet, ofte gjør fullstendig fukting en utfordring og forårsaker dannelsen av nanobubbles som kan være vanskelig å fjerne ^12. Videre tilstopping av nanopore av analytt molekyler forringer signalkvaliteten rende porene ubrukelig for ytterligere eksperiment ^13,14. Til sammen disse effektene i stor grad redusere utbyttet av funksjonelle nanopore enheter og øke kostnadene forbundet med solid-state nanopore forskning.

Påføringsjon av en spenning med Ag / AgCl-elektroder for å produsere høye elektriske felt i området fra 0,15 til 0,3 V / nm viser en overraskende enkel løsning på disse utfordringene. Gjennom den sykliske bruk av korte spenningsimpulser, en ren, lav støy nanopore overflaten ideell for single-molekyl studier er produsert. Langvarig utsettelse for høye elektriske felt initierer fjerning av membranmaterialet som utgjør porevolumet veggen, noe som resulterer i en økning i nanopore diameter. Denne vekst kan kontrolleres nøyaktig ved å justere pulsstyrke og varighet. Som aktuelle spor nedbrytes i løpet av et eksperiment på grunn av tilstopping av nanopore som molekyler adsorberes til nanopore overflaten, kan denne prosessen gjentas for å gjenopprette tette enheter som ellers ville ha blitt kassert. Som sådan, er utbyttet av funksjonelle nanopores ytterligere økes ved muligheten til å bruke det samme apparatet flere ganger. Denne fremgangsmåten gir flere fordeler da det er raskt utført i væske under eksperimentelleforhold, krever bare standard laboratorieutstyr, kan automatiseres med programvare, og produserer funksjonelle kvalitets nanopores med en yield på over 95%.

Protocol

En. Nanopore Fabrikasjon og rengjøring

Merk: Når en nanopore eksisterer i en isolerende membran, kan det være montert direkte i det flytende celle uten ytterligere behandling eller rensing, som beskrevet i trinn 2.. Imidlertid, hvis det er nødvendig å fjerne spor av forurensninger mellom eksperimenter, nanopore chips kan renses ved hjelp av enten piraja løsning ^3,15,16 (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ eller ved eksponering for oksygen plasma ^2.. Som sådan, trinn 1.2 til 1.9 i det følgende protokoll er valgfritt dersom preliminær ved eksponering for piraja oppløsning er ikke nødvendig.

1. Degas filtrert deionisert (DI) vann ved å sette under vakuum i en sonikator i 30 minutter ved 40 ° C.
2. Forbered piraja løsning i et 10 ml begerglass ved forsiktig å tilsette 3 ml svovelsyre, etterfulgt av 1 ml hydrogenperoksyd. Bland grundig ved å koke i pipetten. FORSIKTIG: Piranha løsning er ekstremt farlig. Vennligst ta ke alle forholdsregler.
3. Ved hjelp av syrefaste pinsett, sett tilfreds nanopore holdige membran chip kant først ned i piraja oppløsningen for å fullstendig senk chip og unngå det flytende på overflaten.
4. Skyll pinsett grundig i filtrert vann.
5. Plasser begeret på en kokeplate forhåndsinnstilt til 90 ° C og la den til å rydde i minst 30 min.
6. Fjern forsiktig piraja løsning fra begeret med en ren glass pipette og kast i rikelige mengder vann.
7. Ved hjelp av et rent glass-pipette tilsett 5 ml av avgasset deionisert vann fra trinn 1.1 i begerglasset for å skylle. Fjern vannet og gjenta i det minste 5x.
8. Fjern forsiktig nanopore chip fra begeret med ren skarp-spiss pinsett. Håndteres med ekstrem forsiktighet som nanopore membran er svært skjøre.
9. Tørk chip ved å forsiktig påføre suge til kanten ved hjelp av en vifte. Oppbevar chip i en ren petriskål til alt er klart til bruk.

ve_title "> to. Montere Nanopore

1. Rens Teflon nanopore celle (fig. 1) ved å plassere i 20% saltpetersyre-oppløsning og kokes i 10 minutter. FORSIKTIG: Bruk all nødvendig personlig verneutstyr og håndtere syrer med forsiktighet.
2. Fjern forsiktig cellen fra salpetersyre og legges i kokende DI vann i 10 min.
3. Kok cellen i DI vann i ytterligere 10 min for å sikre fullstendig fjernelse av salpetersyre. Fjern begeret fra den varme platen og la den avkjøles til romtemperatur.
4. Fjern cellen fra begeret og føn med filtrert luft eller N _2. Oppbevar celle i en ren petriskål.
5. Degas filtrert KCl-oppløsning (buffret med HEPES ved pH 8) ved å sette under vakuum i en sonikator i 30 minutter ved 40 ° C.
6. Clean to silikon elastomer pakninger for hver nanopore chip ved sonicating i etanol i minst 10 min.
7. Plasser nanopore chip på en ren elastomer pakning vesen careful å justere membranen vinduet med pakningen åpningen. Plasser og justere en annen pakning på toppen av chip.
8. Plasser chip og pakninger på reservoaret innløpet av en halvdel av den rensede nanopore cellen. Monter cellen ved å skru den andre halvparten på plass. Et utspilt riss av de nanopore cellekomponenter er vist i figur 1..
9. Fukt nanopore chip ved å pipettere etanol inn i cellen reservoarer og plassere i et vakuumkammer inntil for få bobler er sett til å gå ut av inntakene.
10. Fjern etanol ved å spyle reservoarene med minst 3 ml avgasset filtrert KCl-løsning. Pass på å fjerne overløp ved hjelp av en vifte.

Tre. Nanopore Karakterisering

1. Plasser nanopore celle i den elektrisk skjermet eksperimentelle oppsettet og plassere Ag / AgCl elektroder i hvert reservoar. Dette oppsettet er lik den som er vist i figur 2, med unntak av den eksterne strømtilførsel og strømforsterker som ererstattes med en lav-støy resistiv tilbakekoblingsforsterkeren.
2. Bruk av lav støy forsterker i spenning-klemme-modus, gjelder potensialer feiende fra -200 mV til 200 mV og registrere IV egenskaper.
3. Monter IV kurve for å oppnå nanopore konduktans, noe som kan brukes til å beregne dens diameter i løsning ^17.. Hvis det beregnede diameter er mye mindre enn forventet fra TEM avbildning, er pore sannsynlig ikke fullstendig fuktet og / eller inneholder rester eller forurensninger.
4. Påfør et 200 mV potensial på tvers nanopore og registrere ionisk strøm i 30 sek.
5. Utfør en makt spektral tetthet (PSD) analyse av den ioniske strømmen og integrere for å kvantifisere den elektriske støyen egenskapene til nanopore. Hvis støyen er over 15 pA RMS ved 5 kHz båndbredde, så pore er sannsynlig ikke fullstendig fuktet og / eller som inneholder urenheter, og kan ikke på en pålitelig måte anvendes i forsøket.

4. Conditioning Nanopores Ved hjelp av High Electric Fields

Bemerk: Dersom IV kurve generert utstilt asymmetri eller mindre enn forventet ledningsevne, eller den gjeldende kurven viste ustabilitet og høye støynivå ved lave-frekvenser, er det nødvendig å kondisjonere nanopore med høye elektriske felt for å fjerne eventuelle forurensninger på pore overflate-og / eller fukte pore. Selv om denne metoden ikke påvirker den høyfrekvente støy forårsaket av membranen kapasitans eller en parasittisk kapasitans koplet til inngangen på den strømforsterker benyttet i målinger, kan lav-frekvensstøy (også kalt en / f støy) ¹⁸ bli sterkt redusert. En skjematisk av oppsettet som brukes til å utføre denne condition er vist i figur 2.

1. Koble elektrodene fra patch-clamp forsterker.
2. Koble en av elektrodene til en datamaskin-styrt strømforsyning stand til å generere> 6 V (> 0,2 V / nm elektrisk feltstyrke på 30 nm tykke membraner som brukes her), og den andre til en eXternal strømforsterker som kan bli overvåket i sann tid.

   Merk: Anvendelsen av høye elektriske felt kan brukes til å kondisjonere nanopores i forskjellige membranmaterialer og tykkelser. Mens både 30-nm og 10 nm-membraner er omtalt her, spenninger beskrevet referere til de som brukes for 30-nm tykke membraner med mindre annet er oppgitt.

3. Påfør en potensialforskjell på 400 mV (målespenning) over nanopore i minst 5 sek.
4. Beregn middelverdien gjeldende verdi fra den endelige 1 s av data for å bestemme ledningsevne på nanopore. Beregn diameteren av nanopore basert på denne konduktans, noe som bør skje automatisk ved hjelp av programvare og nanopore konduktans modell av valg basert på det mest sannsynlige geometri. Det bør tilsvare diameteren målt fra kurven IV.
5. Påfør (fukte spenning) en 200 ms puls på 6 V over nanopore for å produsere et elektrisk felt på 0,2 V / nm, etterfulgt av en 5 sek måleperiodenved 400 mV. Igjen, beregne en diameter på nanopore ved hjelp av det endelige 1 sek data, og sammenligne med verdien forventet fra TEM-målinger for å sikre at nanopore er fullstendig våt. Om nødvendig, gjenta flere ganger.
6. Om nødvendig gjenta anvendelsen av høye elektriske felt pulser med økende spenning til strømsignalet i løpet av måleperioden er stabilt og viser forventet ledningsevne. Det anbefales ikke å overstige 10 V (dvs.> 0.3 V / nm), da dette kan betydelig forstørre eller skade nanopore raskt.

5. Forstørring Nanopores Bruke høye elektriske felt

Merk: Diameteren på nanopore er avgjørende for dens funksjonalitet for en bestemt biomolekylære sensing program. For dette formål opprettes en nanopore ved hjelp av en TEM kan forstørres til en ønsket størrelse ved å anvende høye elektriske felt til ønsket diameter oppnås med det samme oppsett som brukes for å rense og fuktenanopore (figur 2).

1. Ved hjelp av den samme elektroniske konfigurasjon som i del 4, anvende en 200-500 mV skjevhet på tvers av pore å skaffe en diameter-måling. Mens mindre presis enn monterings IV kurve, kan et enkelt punkt måling bli brukt til å anslå omtrent nanopore størrelse raskt.
2. Påfør en 2 sek puls med 8 V over nanopore etterfulgt av en måleperiode på minst 5 sekunder ved 400 mV. Beregning av den nye diameter vil typisk vise en svært liten økning i nanopore størrelse (<0,1 nm).
3. Gjenta denne prosessen syklisk, alternerende mellom utvidelse og målespenninger å skaffe in situ og sanntidsmålinger av økende nanopore diameter.
4. Dersom hurtigere vekstrate er ønskelig å øke størrelsen av den spenning som påtrykkes trinnvis inntil 10 V. Veksten vil vanligvis akselerere som pore forstørrer med økningen i ledningsevne som strekker seg fra 0,03 nS / s ec & #160; til 10 nS / sek, avhengig av størrelsen på nanopore, styrken av det elektriske felt og elektrolytt-løsning egenskaper.
5. Når den ønskede diameter er nådd, stopper anvendelsen av høye elektriske felt. Dette kan gjøres automatisk ved hjelp av dataprogram.
6. Koble patch-clamp forsterker til elektrodene.
7. Tilegne seg ny IV og nåværende spordata på 200 mV for å bekrefte diameteren på nanopore og kontrollere støysvake strømsignaler som i trinn 3.2 til 3.5 ovenfor. Gjenta om nødvendig condition og utvide protokollen (trinn 4,1 - 5,5).

6. DNA Translokasjon

1. Før tilsetting av en biomolekylære prøve, å utføre en kontrolleksperiment for å sikre at det ikke er noen forurensning i beholderen. Skaff et strøm spor under en påført potensial på 150-300 mV i fravær av en hvilken som helst prøve for å bekrefte at ingen aktuelle blokkeringer er detektert etter 2 min.
2. Legg λ DNA (48,5 kbp dobbelt-trådet) i <em> cis reservoar for en sluttkonsentrasjon på 0,5-2 ng / mL. Tilbakeløpskjøling forsiktig med pipette i minst 10 sekunder for å sikre homogen fordeling av prøven gjennom hele reservoaret.
3. For en 30-nm tykt nanopore, gjelder en potensiell skjevhet på 150-300 mV til trans reservoaret og måle den ioniske strømmen som går gjennom nanopore. For svært korte trans hendelser, er det ønskelig å prøve på en høy frekvens (250 kHz eller høyere) med en relativt høy lav-pass filtrering av frekvens (100 kHz).
4. Overvåk ioniske strømmen med programvare for å oppdage forbigående nåværende blokader som molekyler translocate gjennom nanopore. De ioniske løpende spor av molekyltranslokasjon kan analyseres for å bestemme blokkering dybde, varighet og frekvens for å utlede informasjon om prøven av interesse. Motsatt, hvis informasjon om de translocating molekyler er kjent, disse dataene kan brukes til å undersøke egenskapene til nanopore selv.

Representative Results

De nanopores brukt i denne studien ble boret i 30-nm eller 10 nm tykk silisiumnitrid membran vinduer. Mens protokollen beskrevet kan brukes til solid-state nanopores av ulike materiale fabrikkert ved hjelp av en metode, blir de ofte boret av TEM hjelp tidligere etablerte protokoller ^11,14. Nanopores boret ved TEM er vanligvis mellom 4-8 nm i diameter (figur 2). Mens både 30-nm og 10 nm-tykke membraner kan monteres og betinget bruker over protokollen, spenning skjevheter beskrevet henvise de som kreves for 30-nm tykke membraner med mindre annet er oppgitt. For membraner av forskjellig størrelse, bør den anvendte spenning kan justeres for å generere et elektrisk felt i området fra 0,15 til 0,3 V / nm inne nanopore.

Fig. 3a viser to typiske konduktans spor av en 10-nm nanopore i en 30 nm tykk membran før og etter behandling med høye elektriske felt. Ved montering av en nylig drilled nanopore, er sannsynligheten for å få en ustabil og støyende ioniske strømsignal, som oppviser en høy grad av lavfrekvente svingninger, vanligvis er høy. Nanopore vist i figur 3a fremhever denne atferden. Dets ledningsevne er betydelig mindre enn forventet for en nanopore av sin størrelse, mest sannsynlig på grunn av ufullstendig fukting. Ved anvendelse av høye elektriske felt av 0,27 V / nm i størrelse fremstilt ved 8 V pulser (90 pulser av 2 sek varighet) blir nanopore fullstendig våt og blir deretter utvidet til 21 nm i diameter. På dette punktet, viser pore en stabil ledningsevne med lavt støyegenskaper. Kvantitativ analyse av støy i lignende nanopores vises som makt spektral tetthet tomter i figur 3b. Den lavfrekvente støy amplitude av unwet og / eller tette porer er meget høy (> 20 pA RMS), gjør dem ubrukelige i eksperimentet. Ved condition med høye elektriske felt, støy strøm ved lave frekvenser (<10 kHz) er diminished med opp til tre størrelsesordener og klar for støysvake eksperimenter.

Fig. 4a viser en typisk strømmålinger som potensialet påført er pulset mellom høye elektriske felt for en utvidelse og en lav elektrisk feltmåleperioder. Etter hver etterfølgende puls, den resulterende ionisk strøm gjennom nanopore på målespenningen (dvs. nanopore konduktans) øker med en begrenset mengde. Dette viser at nanopore er økt i størrelse, som diameteren d kan utledes fra den konduktans G i en løsning av ledningsevne σ, tilnærmet nanopore sert med sylindrisk geometri effektive lengde l _eff. Mens flere andre modeller finnes for om nanopore konduktans til sin geometri ^17,19-21, har følgende forhold, som inkorporerer en geometrisk begrep og en tilgang motstand sikt, blitt dokumentert gyldig for TEM-boret nanopores i høy saltkonsentrasjoner, over et bredt utvalg av diametre av interesse for dsDNA trans ^17,22.

Så snart den ønskede diameter er nådd, blir prosessen automatisk stanset av programvaren. Den resulterende nanopore diameter kan deretter bli bekreftet ved hjelp av nøyaktige målinger IV, som vist i figur 4b.

Det er viktig å merke seg at nanopores behandlet ved hjelp av høye elektriske felt er fullt funksjonelle. Dette blir bekreftet ved påvisning av λ DNA-translokasjon, som vist i konduktans spor som presenteres på figur 5a. I denne figuren er dsDNA kjørt gjennom to nanopores som ble forstørret til 11 nm og 32 nm ved bruk av den beskrevne metode. I hvert fall er det baseline konduktans ekstremt stabile og klare blokader er observert som dsDNA molekyler translocate gjennom nanopore, viser høyt signal-tilStøy single-molekyl trans arrangementer som sammenlignet med ubehandlede porer som utviser høy støy. Som vist i innfellinger av figur 5a, er flere adskilte blokkeringsnivåer observert som individuelle foldede molekyler translocate, som forventet for nanopores av disse størrelser. Histogrammer av nanopore ledningsevne under trans hendelser gjennom hver pore er vist i figur 5b. Støysvake egenskapene til nanopores avslører tydelige, lette å løse topper tilsvarende grunnlinjen (ingen DNA), single (en DNA-tråden - utfoldet) og doble blokkering stater (to DNA-trådene - kastet). Å merke er at forandringen i konduktans som svarer til en enkelt molekyl dsDNA opptar porevolumet er forskjellig for de store og små nanopores. Dette gir indirekte bevis for at bruk av høye elektriske felt er faktisk utvide eksisterende nanopores, som samme blokkering amplitude ville bli observert dersom andre porer eller sprekker ble opprettet i than membran under prosessen ^17.

Tilsvarende, Fig. 6 illustrerer effekten av høye elektriske felt for å utvide nanopores fabrikkert i membraner av forskjellig tykkelse. Her, en nanopore opprettet i en 10-nm sinx membran er i utgangspunktet delvis unwet, viser ustabil og relativt liten ledningsevne. Ved anvendelse av vekselstrøm ± 3 V (± 0,3 V / nm) pulser av 4 sek varighet (30 totalt), blir nanopore våt og oppviser ideelle IV egenskaper for et 3 nm pore. Metodikken ble så gjentatt for 400 påfølgende pulser og nanopore ble utvidet til 8 nm. Denne utvidelse, utført på tilsvarende elektriske felt, men lavere påtrykt spenning skjevhet enn for nanopores fremstille i 30-nm-membraner, viser at fremgangsmåten er først og fremst elektrisk felt drevet. Som den gjeldende blokade produsert ved translokasjon via en tynnere membran er større enn det som produseres i tykkere porer, nanopores i tynne membranerbehandlet på denne måte kan brukes til å studere kortere molekyler som proteiner med økt følsomhet.

Figur 1. Nanopore cellesammensetning. Silisiumnitrid En membran inneholdende et nanopore er plassert mellom silikon-elastomer pakninger, som igjen er komprimert av to Teflon halv-celler inneholdende elektrolyttreservoar. for å vise større bilde .

Figur 2. Nanopore condition og utvide oppsettet. Et nanopore boret i en 30 nm tykk silisiumnitrid membran (til venstre) kobles to elektro reservoarer. Adatamaskinen brukes til å styre enten en patch-clamp forsterker eller ekstern strømforsyning (DAQ kortet) som gjelder en potensiell skjevhet over nanopore via Ag / AgCl elektroder nedsenket i elektrolytten reservoarene. Den nåværende forsterker videresender ionisk strøm målt som skal overvåkes i sanntid ved hjelp av dataprogrammer. Dette tallet har blitt forandret fra [11]. Klikk her for å se større bilde .

Figur 3. Omløps spor før og etter påføring av høye elektriske felt. (A) Ved montering, og selv etter rensing med piraja løsning, er konduktansen av nanopore ustabil og mindre enn forventet for en sylindrisk 10 nm pore (blå). Etter anvendelsen av to sek pulser av 8 V, dennanopore er fullstendig fuktet og forstørret, oppviser en stabil ledeevne og kan brukes for biomolekylære føler eksperimenter (grønn). (B) Strøm spektral tetthet plott av en ufullstendig fuktet og tett nanopore (blå og oransje, henholdsvis). Ved anvendelse av 200 msek pulser av 8 V, ble nanopores fuktes og rusk fjernet (grønn og rød, henholdsvis). Dette tallet har blitt forandret fra [11]. Klikk her for å se større bilde .

Figur 4. Nanopore forstørring bruker høye elektriske felt. (A) Vekslende mellom utvidelse og måling potensielle skjevheter (rød) avslører at den ioniske strømmen gjennom nanopore (blå) øker i endelig trinn. Den resulterende oppførselledelse målingen kan brukes til å utlede nanopore diameter. Så snart den ønskede diameter er nådd, blir prosessen stoppet. (B) Presise IV målinger av ledningsevne bekrefte at nanopore størrelser har økt. Slike tomter gi et bedre estimat av størrelsen pore enn single-point gjeldende verdier som de kan være i form og deres symmetrisk og Ohmsk atferd kan bekreftes. Dette tallet har blitt forandret fra [11]. Klikk her for å se større bilde .

Figur 5. DNA translokasjon gjennom kondisjone nanopores. (A) Tilsetning av dsDNA (48,5 kbp) til den ene siden av nanopore på en skjevhet på 150 mV produserer transiente blokkader i konduktans spor av 11-nm (blått) og 32 nm pores (rød). (B) histogrammer av konduktansen av hver av de nanopores viser adskilte topper tilsvarende til grunnlinjen, enkle og doble trans arrangementer. Dette tallet har blitt forandret fra [11]. Klikk her for å se større bilde .

Figur 6. Utvidelsen av nanopores i 10 nm membraner. Et nanopore i en 10 nm membran opprinnelig utstillinger svært lite ledningsevne og asymmetriske IV egenskaper (oransje). Ved anvendelse av 30 pulser av vekslende mellom ± 3 V (4 sek varighet), nanopore fukter og oppviser ideelle IV egenskaper med en ledningsevne i overensstemmelse med det som var forventet for en 3 nm pore (blå). En ytterligere 400 pulser av ± 3 V forstørrer nanopore til en diameter på 8 nm(Grønn). Klikk her for å se større bilde .

Discussion

Kontroll av nanopore størrelse er av fundamental betydning i biomolekylære sensing applikasjoner. Nanopore diametre må være i størrelsesorden av størrelsen på de molekyler som blir analysert, og de må være store nok til å romme prøven, men liten nok til å oppnå optimal signal-til-støy. Selv om kontroll av størrelse ved hjelp av fremgangsmåten presentert av å anvende høye elektriske felt er ensrettet ved at nanopore diametre bare økes gjennom hele prosessen, kan nanopores med diameter mellom 3 til 100 nm være modnet, med subnanometer presisjon. Som 3-4 nm porene kan lett fabrikkert ved hjelp av en TEM ^23, gjør dette for den pålitelig fabrikasjon av solid-state nanopores for et bredt spekter av applikasjoner fra sondering ssDNA struktur til samspillet mellom store protein-ligand komplekser. Mens nanopore vekst over 100 nm kan være svært rask og mindre presis, kan mer moderate forstørring vilkår være ansatt for å oppnå bedre kontroll over prosessen. Som sUCH, er de viktigste trinn for å oppnå effektiv størrelse kontroll valg av puls-styrke og varighet for å balansere forstørring effektivitet og den grad av presisjon som kreves for å oppnå en ønsket porediameter. Dette er ytterligere fremhevet ved utvidelsen av tynnere nanopores (10 nm tykkelse), hvor utvidelse er observert en lavere skjevhet men kan sammenlignes elektrisk feltstyrke. Avhengig av den endelige størrelsen, er det vanligvis mulig å forstørre et nanopore til sub-100-nm diameter på noen få minutter.

Tilsvarende store lavfrekvente svingninger aktuelle hinder for single-molekyl studier som det er nesten umulig å skille trans signaler fra bakgrunnsstøy. Ufullstendig Wetting ^24, kan tilstedeværelsen av karbonholdige rester igjen etter innledende fabrikasjon ²⁵ og adsorpsjon av rusk på nanopore veggen ¹³ dårligere signalkvalitet, noe som krever ekstra rengjøring med sterke kjemiske behandlinger som er ofte inefficacious. Interessant, er det vanlig for solid-state nanopore protokoller for å understreke viktigheten av renhold nanopore i piraja løsning eller med oksygen plasma før montering for å hjelpe tisse eller fjerne forurensning igjen fra boring, bilde-og håndteringsprosesser. Selv med denne behandlingen, men nanopores ofte ikke vått eller fortsette å utvise høy støy, og den foreslåtte løsningen for mislykkede forsøk er å utføre ekstra rengjøring som kan være svært tidkrevende ^14. Med anvendelse av høye elektriske felt, kan disse lange protokoller ikke være nødvendig, avhengig av anvendelsen. Det ble funnet at de fleste enheter kan bli overhalt in situ ved å bruke metoden som er beskrevet heri, og følgelig redusere forberedelsestid og behovet for å behandle sterke kjemikalier. De viktigste trinnene i formildende elektrisk støy er en enkel økning i spenning og / eller pulsvarigheten til helt våt pore og fjerne løst bundet rusk.Nanopores behandlet på denne måte med sikkerhet kan anvendes i biomolekyl trans eksperimenter, slik som passasjen av DNA og proteiner. Hvis disse molekylene holder seg til pore veggen fører til et tett og støyende elektrisk signal, kan høy elektrisk feltimpulser på nytt for å fjerne hindringen og gjenvinne støysvake egenskaper for videre eksperimentering, uten demontering av nanopore chip fra fluidic celle.

Anvendelsen av høye elektriske felt ved hjelp av konfigurasjons beskrevet er begrenset av kravet om en ekstern strømforsyning som kan søke opp til 10 V og strømforsterker, som mangler følsomhet og lavt støyegenskaper ved høy båndbredde (> 1 kHz) for enkelt molekyl sensing. Mens typiske biomolekylære eksperimenter stole på en lav-støy nåværende forsterker som er begrenset til ± 1 V, er det enkelt å designe et enkelt system som kan oppnå både høy elektrisk felt condition og følsom strømmåling med en justabil gevinst. Til tross for denne begrensningen, er overgangen fra ett oppsett til den andre rask og grei. I sammenligning med eksisterende teknikker for styring nanopore størrelse som for eksempel bruk av SEM ^5, termisk oksidering og membranen omforming ^8, høye elektriske felt gir en raskere, mer nøyaktig og mindre kostbar metode som kan utføres på laboratoriebenken ved hjelp av standard utstyr og levere et bredere spekter av nanopore størrelser. Evnen til hurtig og reproduserbart å redusere lavfrekvensstøy også gjør initial fabrikasjon mer pålitelig og forlenger levetiden for solid-state nanopores, som tidligere brukte porer kan fornyes for videre eksperimenter. Til sammen over 95% av nanopores av varierende tykkelser klimaanlegg med høye elektriske felt utstilt svært lite lavfrekvent støy karakteristisk, gjør dem egnet for biomolecule sensing. Fabrication er dermed enklere og mer pålitelig, noe som gjør SSD-nanopore eksperimenter mer accessigjengelig for forskere og potensielt åpner for en vei mot kommersialisering av nanopore teknologi gjennom mer robuste fabrikasjon prosesser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JEM-2100F TEM	JEOL		Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier	Molecular Devices		Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card	National Instruments	PCI-6351	Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software	National Instruments		Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier	Keithley		Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows	Norcada Inc.	NT005X	Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows	Norcada Inc.	NT005Z	Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings	Marian Chicago	HT6135	Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes	In Vivo Metric	E255
Nitric acid	Fisher Scientific	52004P	Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H323	Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid	Fisher Scientific	A300	Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride	Fisher Scientific	P335
HEPES	Fisher Scientific	BP310	Buffering KCl solution
Primary Faraday cage			Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage			Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell			To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate	VWR		Heating piranha solution