Réglage fin de la taille et minimisant le bruit de l'état solide nanopores

Summary

Une méthodologie pour la préparation des nanopores à l'état solide en solution pour des expériences de translocation biomoléculaires est présenté. Par l'application d'impulsions courtes de champs électriques élevés, le diamètre de nanopore peut être agrandi de manière contrôlée avec une précision inférieure au nanomètre, et ses caractéristiques de bruit électrique nettement améliorée. Cette procédure est effectuée in situ en utilisant un équipement de laboratoire standard dans des conditions expérimentales.

Abstract

Nanopores semi-conducteurs ont émergé comme un outil polyvalent pour la caractérisation des biomolécules uniques tels que des acides nucléiques et des protéines ^1. Cependant, la création d'un nanopore dans une membrane isolante mince reste difficile. Les méthodes de fabrication impliquant des systèmes de faisceaux d'électrons focalisé spécialisés peuvent produire des nanopores bien définis, mais le rendement de nanopores fiables et à faible bruit dans les membranes disponibles dans le commerce reste faible ^2,3 et le contrôle de la taille est non triviale ^4,5. Ici, l'application de champs électriques haute pour affiner la taille de la nanopores tout en assurant une performance optimale à faible bruit est démontrée. Ces courtes impulsions de champ électrique élevé sont utilisés pour produire un signal électrique vierge et permettre l'élargissement de nanopores avec une précision inférieure au nanomètre lors d'une exposition prolongée. Ce procédé est réalisé in situ dans un milieu aqueux en utilisant un équipement de laboratoire standard, ce qui améliore le rendement et la reproductibilité des sétat-olid nanopores fabrication.

Introduction

Nanopores à état ​​solide biologique et fournissent un moyen de détection des analytes biomoléculaires à l'échelle de la molécule unique ^1. Nanopores individuels sont généralement intégrés dans minces membranes d'isolation, fournissant le seul conduit pour le courant ionique pour passer entre deux réservoirs de liquide. En utilisant les principes de la plus grande échelle des compteurs Coulter, nanopore expériences concernent les variations du courant ionique pour déterminer la longueur, la taille, la charge et conformation de biomolécules chargées car ils sont entraînés par électrophorèse à travers un nanopore en présence d'un champ électrique externe.

Bien que nanopores biologiques tels que α-hémolysine offrent généralement une plus grande sensibilité et des propriétés à faible bruit ^3, la bicouche lipidique de support est fragile et de taille fixe, ce qui limite leur applicabilité. Nanopores à l'état solide, d'autre part, sont fabriqués en mince (10 à 50 nm) de nitrure de silicium ou de membranes d'oxyde de silicium et peuvent être faits de différents sizes, être facilement intégré avec les technologies plaquette échelle ^6,7, et sont plus robustes, ce qui permet une plus large gamme de conditions expérimentales. Malgré ces avantages, les technologies de nanopores semi-conducteurs souffrent de plusieurs inconvénients pratiques qui limitent leur utilité pour les études biomoléculaires. Bien que le contrôle de la taille des nanopores est possible, il est généralement coûteux et laborieux à réaliser, nécessitant un équipement spécialisé et de personnel qualifié. Par exemple, les nanopores percés par faisceau focalisé d'ions a été démontré récemment à se rétrécir dans des conditions expérimentales spécifiques dans un microscope électronique à balayage (SEM) ^5. En d'autres approches, des nanopores forés par microscopie électronique à transmission (MET) peuvent se dilater ou se contracter en fonction des conditions de faisceau et une exposition ultérieure à des solvants aqueux ^8. Dans ces cas, la gamme de tailles réalisable nanopore est limité, difficile à contrôler et peu fiable, même lorsque la taille du nanopore peut changer après un traitement chimique oulorsqu'il est immergé dans un milieu liquide particulier ^9.

Le courant ionique à travers des nanopores à l'état solide peut également souffrir de bruit élevé, dont les sources sont un sujet intensément étudié dans la littérature nanopores ^2,3,10,11. Bien que diverses méthodes ont été proposées pour réduire le bruit électrique, le rendement de fiables, stables nanopores à faible bruit est généralement faible. Le dépôt de résidus carbonés en cours de forage et d'imagerie peut avoir des effets néfastes sur la qualité du signal électrique, ce qui rend souvent difficile mouillage complet et provoquant la formation d'nanobubbles qui peuvent être difficiles à enlever ^12. Par ailleurs, le colmatage du nanopore par molécules d'analyte dégrade le rendu de la qualité de signal des pores inutilisable pour autre expérience ^13,14. Au total, ces effets réduisent considérablement le rendement des dispositifs de nanopores fonctionnels et augmentent le coût associé à la recherche de nanopores à l'état solide.

L'applicationtion d'une tension avec des électrodes Ag / AgCl pour produire des champs électriques élevés de l'ordre de 0,15-0,3 V / nm présente une solution étonnamment simple à ces défis. Grâce à l'application cyclique d'impulsions de courte de tension, un endroit propre, à faible bruit surface de nanopores idéal pour les études d'une seule molécule est produite. Une exposition prolongée à des champs électriques élevés initie l'enlèvement de la matière de membrane constituant la paroi des pores, ce qui entraîne une augmentation du diamètre des nanopores. Cette croissance peut être contrôlée avec précision par réglage de la force d'impulsion et de durée. Comme des traces de courant se dégradent au cours d'une expérience en raison de l'obstruction de la nanopore que les molécules sont adsorbées à la surface de nanopores, ce processus peut être répété pour récupérer les appareils obstrués qui auraient autrement été mis au rebut. En tant que tel, le rendement de nanopores fonctionnels est encore accrue par la possibilité d'utiliser le même dispositif à plusieurs reprises. Cette méthode présente plusieurs avantages car il est effectué rapidement dans un liquide sous expérimentalconditions, ne nécessite que du matériel de laboratoire standard, peuvent être automatisées avec le logiciel, et produit fonctionnels nanopores de haute qualité avec un rendement de plus de 95%.

Protocol

Une. Nanopore Fabrication et nettoyage

Remarque: Une fois un nanopore existe dans une membrane isolante, il peut être monté directement dans la cellule liquide en l'état ou de nettoyage, tel que décrit dans l'étape 2. Cependant, si il est nécessaire d'éliminer les traces de contaminants entre les expériences, les copeaux de nanopore peuvent être nettoyés en utilisant soit une solution piranha ^3,15,16 (3:1 de H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ ou par l'exposition à un plasma d'oxygène ^2. En tant que tel, les étapes 1,2 à 1,9 dans le protocole ci-après sont facultatives si le pré-nettoyage par une exposition à une solution piranha n'est pas nécessaire.

1. Degas filtrée désionisée (DI) de l'eau par mise sous vide dans un appareil à ultrasons pendant 30 min à 40 ° C.
2. Préparer une solution piranha dans un bécher de 10 ml, ajouter avec précaution 3 ml d'acide sulfurique suivi par 1 ml de peroxyde d'hydrogène. Mélanger soigneusement par reflux dans la pipette. ATTENTION: solution Piranha est extrêmement dangereux. S'il vous plaît ta ke toutes les précautions.
3. En utilisant des pinces résistantes à l'acide, insérez avec précaution la puce à membrane contenant des nanopores-bord-première dans la solution de piranha pour submerger totalement la puce et éviter flottant à la surface.
4. Rincer abondamment à l'eau pincettes filtré.
5. Placer le bécher sur un preset plaque chaude à 90 ° C et lui permettre de nettoyer pendant au moins 30 min.
6. Retirez délicatement la solution piranha du bêcher à l'aide d'une pipette de verre propre et jeter dans une grande quantité d'eau.
7. En utilisant une pipette en verre propre ajouter 5 ml de l'eau déminéralisée dégazée à l'étape 1.1 dans le bécher de rinçage. Retirer l'eau et répéter au moins 5 fois.
8. Retirez délicatement la puce de nanopores du bécher en utilisant propres pinces pointu-pointe. Manipuler avec soin extrême que la membrane de nanopores est très fragile.
9. Séchez la puce en appuyant légèrement aspiration à son bord à l'aide d'un aspirateur. Conservez la puce dans une boîte de Petri propre jusqu'à ce que prêt à l'emploi.

ve_title "> 2. Montage du Nanopore

1. Nettoyer la cellule en Téflon nanopore (figure 1) en plaçant dans une solution d'acide nitrique à 20% et l'ébullition pendant 10 minutes. ATTENTION: Utilisez tous les équipements de protection individuelle nécessaires et gérer acides avec soin.
2. Retirez délicatement la cellule de l'acide nitrique et le placer dans de l'eau déminéralisée bouillante pendant 10 min.
3. Faire bouillir la cellule dans de l'eau DI pendant 10 minutes de plus pour assurer l'élimination complète de l'acide nitrique. Retirer le bécher de la plaque chauffante et laisser refroidir à température ambiante.
4. Retirer la cellule du bêcher et sécher avec de l'air filtré ou N _2. Stocker la cellule dans une boîte de Petri propre.
5. Degas filtré solution KCl (tamponnée avec HEPES à pH 8) par mise sous vide dans un appareil à ultrasons pendant 30 min à 40 ° C.
6. Nettoyer les deux joints d'étanchéité en élastomère de silicone pour chaque puce de nanopore par sonication dans de l'éthanol pendant au moins 10 min.
7. Placez la puce de nanopores sur une surface propre joint élastomère être careful à aligner la fenêtre de la membrane avec l'ouverture du joint. Placer et aligner un deuxième joint au sommet de la puce.
8. Placer la puce et les joints d'étanchéité sur l'orifice d'entrée du réservoir d'une moitié de la cellule de nanopore nettoyé. Assemblez la cellule en vissant l'autre moitié en place. Une vue éclatée des composants de la cellule nanopore est représenté sur la figure 1.
9. Mouiller la puce de nanopore par pipetage de l'éthanol dans les réservoirs de cellule et en plaçant dans une chambre à vide jusqu'à ce que quelques bulles apparaissent à la sortie des orifices d'entrée.
10. Éliminer l'éthanol par le rinçage des réservoirs avec au moins 3 ml dégazée solution KCl filtré. Prendre soin d'enlever débordement à l'aide d'un aspirateur.

3. Nanopore Caractérisation

1. Placez la cellule de nanopores dans le dispositif expérimental blindé électriquement et placer les électrodes Ag / AgCl dans chaque réservoir. Cette configuration est similaire à celle représentée sur la figure 2 à l'exception de l'alimentation électrique externe et l'amplificateur de courant, qui sontremplacé par un amplificateur à faible bruit de contre-réaction résistif.
2. Utilisation de l'amplificateur à faible bruit en mode voltage-clamp, appliquer des potentiels de balayage de -200 mV à 200 mV et enregistrer les caractéristiques IV.
3. Monter la courbe IV pour obtenir nanopores conductance, qui peut être utilisé pour calculer son diamètre dans la solution ^17. Si le diamètre calculé est beaucoup plus petite que prévu à partir de l'imagerie TEM, le pore n'est probablement pas complètement mouillé et / ou contient des débris ou de la contamination.
4. Appliquer un potentiel de 200 mV à travers le nanopore et enregistrer le courant ionique pendant 30 sec.
5. Effectuez une densité spectrale de puissance (PSD) d'analyse du courant ionique et d'intégrer de quantifier les caractéristiques de bruit électrique de la nanopores. Si le bruit est au-dessus de 15 pA RMS à 5 kHz de largeur de bande, puis le pore n'est probablement pas complètement mouillé et / ou contient de contamination et ne peut pas être utilisé de façon fiable dans l'expérience.

4. Conditionné Nanopores Utilisation de haute Fie électriquelds

Note: Si la courbe IV généré asymétrie exposés ou moins que prévu conductance, ou la trace actuelle a montré des niveaux d'instabilité et bruit élevé à basses fréquences, il est nécessaire de conditionner le nanopore avec des champs électriques élevés pour éliminer toute contamination sur le pore surface et / ou en mouillant le pore. Bien que ce procédé n'affecte pas le bruit haute fréquence provoqué par la capacité de membrane ou de toute capacité parasite couplée à l'entrée de l'amplificateur de courant utilisée dans les mesures, le bruit à basse fréquence (appelé également le bruit en 1 / f) ¹⁸ peut être considérablement réduit. Un schéma du montage utilisé pour effectuer ce conditionnement est représentée sur la figure 2.

1. Débrancher les électrodes de l'amplificateur de patch-clamp.
2. Connectez l'une des électrodes à une alimentation capable de générer contrôlé par ordinateur> 6 V (> 0,2 V / nm intensité de champ électrique pour les membranes d'épaisseur 30 nm utilisées ici) et l'autre à un eXternal amplificateur de courant qui peut être suivie en temps réel.

   Remarque: l'application de champs électriques élevés peut être utilisé pour conditionner des nanopores dans différents matériaux et épaisseurs de membrane. Bien que les deux membranes de 30 nm et 10 nm sont discutés ici, tensions décrites se réfèrent à ceux utilisés pour 30 nm membranes épaisses, sauf indication contraire.

3. Appliquer une différence de potentiel de 400 mV (tension de mesure) à travers le nanopore pendant au moins 5 s.
4. Calculer la valeur moyenne du courant à partir de la dernière de 1 seconde données afin de déterminer la conductance du nanopore. Calculer le diamètre du nanopore sur la base de cette conductance, qui doit être effectué automatiquement en utilisant le logiciel et le modèle de conductance nanopore de choix basé sur la géométrie la plus probable. Il doit correspondre au diamètre mesuré à partir de la courbe IV.
5. Appliquer une impulsion de 200 ms de 6 V (tension de mouillage) à travers le nanopore pour produire un champ électrique de 0,2 V / nm suivie d'une période de mesure de 5 secondesà 400 mV. Encore une fois, calculer un diamètre de la nanopore en utilisant le dernier 1 sec de données et les comparer avec la valeur prévue à partir des mesures TEM pour s'assurer que le nanopore est entièrement mouillée. Si nécessaire, répéter plusieurs fois.
6. Si nécessaire, répéter l'application d'impulsions de champ électrique élevé avec une tension croissante jusqu'à ce que le signal de courant au cours de la période de mesure est stable et montrant la conductance prévu. Il est recommandé de ne pas dépasser 10 V (c'est à dire> 0,3 V / nm), car cela peut considérablement agrandir ou endommager rapidement le nanopore.

5. Agrandissement Nanopores usingHIGHQUALITY Champs électriques

Remarque: Le diamètre de la nanopores est crucial dans la détermination de sa fonctionnalité pour une application de détection biomoléculaire particulier. A cette fin, un nanopore créée à l'aide d'un TEM peut être agrandie à une taille souhaitée par l'application de champs électriques élevés jusqu'à ce que le diamètre approprié est réalisé avec la même configuration utilisée pour nettoyer et mouiller l'nanopore (Figure 2).

1. En utilisant la même configuration électronique dans la partie 4, appliquer une polarisation mV 200-500 à travers le pore pour obtenir une mesure de diamètre. Bien que moins précise que le montage d'un courbe IV, une mesure en un point unique peut être utilisé pour estimer à peu près la taille de nanopores rapidement.
2. Appliquer une impulsion de 2 sec de 8 V à travers le nanopore suivie d'une période de mesure d'au moins 5 secondes à 400 mV. Calcul de la nouvelle diamètre est généralement montrer une très faible augmentation de la taille des nanopores (<0,1 nm).
3. Répétez ce processus cyclique, alternant entre l'élargissement et de mesure des tensions pour obtenir mesures in situ et en temps réel de l'augmentation du diamètre de nanopores.
4. Si le taux de croissance plus rapide est souhaitable, augmenter l'amplitude de la tension appliquée progressivement jusqu'à 10 V. La croissance sera généralement accélérer le pore s'agrandit avec le taux d'augmentation de la conductance allant de 0,03 ns / s ec & #160; à 10 nS / s, en fonction de la taille du nanopore, la force du champ électrique et des propriétés de la solution d'électrolyte.
5. Lorsque le diamètre désiré soit atteint, arrêter l'application de champs électriques élevés. Ceci peut être réalisé automatiquement à l'aide du programme d'ordinateur.
6. Rebranchez l'amplificateur de patch-clamp sur les électrodes.
7. IV et d'acquérir de nouvelles données de trace actuelles à 200 mV pour confirmer le diamètre du nanopore et vérifier des signaux de courant à faible bruit comme dans les étapes 3.2 à 3.5 ci-dessus. Si nécessaire, répétez la climatisation et protocole élargissant (étapes 4.1 à 5.5).

6. La translocation de l'ADN

1. Avant d'ajouter un échantillon biomoléculaire, effectuer une expérience de contrôle pour s'assurer qu'il n'y a pas de contamination dans le réservoir. L'acquisition d'une trace de courant sous une tension appliquée de 150 à 300 mV, en l'absence de tout échantillon pour vérifier qu'aucun des blocages actuels sont détectés après 2 min.
2. Ajouter ADN de λ (48,5 kbp double brin) de la <em> réservoir cis pour une concentration finale de 0,5-2 ng / ul. Reflux doucement à la pipette pendant au moins 10 secondes pour assurer une distribution homogène de l'échantillon dans l'ensemble du réservoir.
3. Pour un nanopore épaisseur de 30 nm, appliquer un biais potentiel de 150 à 300 mV au réservoir trans et mesurer le courant ionique traversant le nanopore. Pour les événements de translocation très courts, il est souhaitable d'échantillonner à une fréquence élevée (250 kHz ou plus) avec une fréquence de filtrage passe-bas relativement élevée (100 kHz).
4. Surveillance du courant ionique en utilisant un logiciel pour détecter les blocages actuels transitoires sous forme de molécules translocation à travers le nanopore. Les traces de courant ioniques de translocation moléculaire peuvent être analysés pour déterminer la profondeur de blocage, de la durée et de la fréquence pour en déduire des informations sur l'échantillon d'intérêt. Inversement, si l'information sur les molécules translocation est connu, ces données peuvent être utilisées pour étudier les propriétés du nanopore lui-même.

Representative Results

Les nanopores utilisés dans cette étude ont été forés dans 30 nm ou 10 nm fenêtres de membrane de nitrure de silicium d'épaisseur. Alors que le protocole décrit peut être appliqué à l'état solide nanopores de divers matériaux fabriqués en utilisant n'importe quel procédé, ils sont généralement percés par MET en utilisant des protocoles établis antérieurement ^11,14. Nanopores percés par MET sont typiquement comprises entre 8.4 nm de diamètre (Figure 2). Bien que les deux 30 nm et 10 nm d'épaisseur membranes peuvent être montés et conditionnés en utilisant le protocole ci-dessus, les préjugés de tension décrites concernent celles requises pour les membranes d'épaisseur 30 nm, sauf indication contraire. Pour les membranes de différentes tailles, la tension appliquée doit être réglée pour générer un champ électrique dans la plage de 0,15 à 0,3 V / nm à l'intérieur du nanopore.

La figure 3a montre deux traces de conductance typiques d'un nanopore de 10 nm dans une membrane épaisse de 30 nm, avant et après le traitement par champs électriques élevés. Lors du montage d'un nouveau dnanopores emplissait, la probabilité d'obtenir un signal de courant ionique instable et bruyant, présentant un haut degré de fluctuation basse fréquence, est généralement élevé. Le nanopores le montre la figure 3a montre ce comportement. Sa conductivité est considérablement moindre que prévu pour un nanopore de sa taille, le plus probablement en raison d'un mouillage incomplet. Sur l'application de champs électriques élevés de 0,27 V / nm en grandeur produite par 8 V impulsions (90 impulsions de 2 durée de sec), le nanopore devient totalement humide et est ensuite agrandi à 21 nm de diamètre. À ce stade, le pore présente une conductance stable avec des propriétés à faible bruit. L'analyse quantitative de bruit dans des nanopores similaires est représenté en tant que puissance spectrales parcelles de densité dans la figure 3b. Le bruit basse fréquence amplitude de pores unwet et / ou obstrués est très élevé (> 20 pA RMS), ce qui les rend inutilisables dans l'expérience. Sur conditionné avec des hauts champs électriques, puissance de bruit à basses fréquences (<10 kHz) est diminished jusqu'à 3 ordres de grandeur et des prêts pour des expériences à faible bruit.

La figure 4a représente une mesure de courant typique comme le potentiel appliqué est pulsé entre des champs électriques élevés pour l'agrandissement et de faibles périodes de mesure de champ électrique. Après chaque impulsion suivante, le courant ionique à travers le nanopore résultante à la tension de mesure (c'est à dire la conductance nanopore) augmente d'une quantité finie. Ceci démontre que le nanopore est augmenté en taille, comme le diamètre d peut être déduite de sa conductance G dans une solution de conductivité σ, l'approximation de la nanopore comme ayant une géométrie cylindrique de la longueur effective L _eff. Alors que d'autres modèles existent pour relier les nanopores conductance de sa géométrie ^17,19-21, la relation suivante, qui incorpore un terme géométrique et un terme de résistance d'accès, a été prouvé valable pour nanopores TEM-percés en haute selconcentrations, sur une large gamme de diamètres d'intérêt pour l'ADN bicaténaire translocation ^17,22.

Une fois que le diamètre désiré soit atteint, le processus est arrêté automatiquement par le logiciel. Le diamètre des nanopores résultant peut ensuite être confirmé en utilisant des mesures précises IV, comme illustré sur la figure 4b.

Il est important de noter que les nanopores traitées en utilisant des champs électriques élevés sont entièrement fonctionnelles. Ceci est validée par la détection de la translocation de l'ADN λ, comme le montrent les traces de conductance présentés à la figure 5a. Sur cette figure, l'ADN bicaténaire est entraînée à travers deux nanopores qui ont été agrandies à 11 nm et 32 ​​nm selon la méthode décrite. Dans chaque cas, la conductance de base est extrêmement stable et blocages claires sont observées comme des molécules ADN double brin translocation à travers le nanopore, démontrant le haut signalBruit d'une seule molécule d'événements de translocation comparativement à pores non traitées qui présentent un bruit élevé. Comme représenté sur les garnitures de la figure 5a, plusieurs niveaux discrets de blocage sont observées sous forme de molécules individuelles pliées translocation, comme prévu pour des nanopores de ces grandeurs. Les histogrammes de la conductance nanopore pendant des événements de translocation à travers chaque pore sont montrées sur la figure 5b. Les propriétés de faible bruit des nanopores révèlent pics distincts, facilement résoluble correspondant à la ligne de base (pas d'ADN), seul (un brin d'ADN - déplié) et les états doubles blocage (deux brins d'ADN - pliées). Il faut souligner le fait que la variation de la conductance correspondant à une seule molécule ADN double brin occupant le pore est différente pour les grandes et petites nanopores. Ceci fournit une preuve indirecte que l'application de champs électriques élevés est, en fait, l'élargissement de nanopores existants, comme la même amplitude de blocage serait observée si d'autres pores ou les fissures ont été créées en til membrane pendant le processus ^17.

De même, la figure 6 illustre l'efficacité des champs électriques élevés pour l'agrandissement nanopores fabriqués dans des membranes d'épaisseurs différentes. Ici, un nanopore créé dans une membrane SiN x 10 nm est d'abord partiellement unwet, affichant conductance instable et relativement faible. À la demande d'une alternance de ± 3 V (± 0,3 V / nm) des impulsions de 4 durée de sec (30 au total), le nanopore devient humide et présente des caractéristiques IV idéal pour un pore de 3 nm. La méthodologie a été ensuite répété pour 400 impulsions suivantes et le nanopore a été élargi à 8 nm. Cet élargissement, réalisée à des champs électriques comparables mais polarisation de la tension appliquée inférieure à nanopores de membranes fabriquées à 30 nm, montre que le procédé est essentiellement champ électrique entraîné. Comme le blocage de courant produite par translocation à travers une membrane mince est plus grande que celle produite dans les pores, les nanopores plus épaisses dans les membranes mincestraitée de cette manière peut être utilisé pour étudier des molécules plus courtes telles que des protéines avec une sensibilité accrue.

Figure 1. Ensemble de cellule nanopore. Une membrane de nitrure de silicium contenant un nanopore est placée entre les joints d'étanchéité en élastomère de silicone, qui sont à leur tour comprimé par deux demi-cellules en téflon contenant des réservoirs d'électrolyte. Cliquer ici pour afficher cette image .

Figure 2. Nanopore conditionnement et agrandissant la configuration. Un nanopore percé dans une membrane de nitrure de silicium d'épaisseur 30 nm (à gauche) relie deux réservoirs d'électrolyte. Al'ordinateur est utilisé pour commander soit un amplificateur de patch-clamp ou une alimentation externe (carte d'acquisition de données) qui applique un potentiel de polarisation à travers le nanopore par des électrodes Ag / AgCl immergées dans les réservoirs d'électrolyte. L'amplificateur de courant relaie le courant ionique mesurée à surveiller en temps réel en utilisant un logiciel informatique. Ce chiffre a été modifié depuis [11]. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3. Traces de courant avant et après l'application de champs électriques élevés. (A) Lors du montage, et même après le nettoyage avec une solution piranha, la conductance de la nanopores est instable et moins que prévu pour un pore cylindrique de 10 nm (bleu). Après l'application de deux impulsions de sections de 8 V, lananopore est totalement mouillé et à plus grande échelle, présentant une conductance stable et peut être utilisée pour les expériences de détection biomoléculaires (en vert). (B) les parcelles de densité spectrale de puissance d'un nanopore incomplètement mouillée et bouché (bleu et orange, respectivement). Lors de l'application des impulsions de 200 ms de 8 V, les nanopores sont mouillées et que les débris enlevés (vert et rouge, respectivement). Ce chiffre a été modifié depuis [11]. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 4. Nanopore élargir l'utilisation de champs électriques élevés. (A) L'alternance entre l'élargissement et de la mesure des biais potentiels (rouge) révèle que le courant ionique à travers le nanopore (bleu) augmente dans les étapes finies. Le comportement résultantance de mesure peut être utilisée pour déduire le diamètre de nanopore. Une fois que le diamètre souhaité est atteint, le processus est arrêté. (B) les mesures IV précise de conductance confirment que la taille des nanopores ont augmenté. Ces parcelles offrent une meilleure estimation de la taille des pores de valeurs actuelles en un seul point, car ils peuvent être en forme et leur comportement symétrique et ohmique peut être confirmé. Ce chiffre a été modifié depuis [11]. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 5. Translocation de l'ADN par des nanopores climatisées. (A) L'ajout d'ADN double brin (48,5 kb) d'un côté de la nanopores à une polarisation de 150 mV produit blocus transitoires dans les traces de conductance de 11 nm (bleu) et 32 nm pores (rouge). (B) Les histogrammes de la conductance de chacun des nanopores montrent des pics discrets correspondant à la ligne de base, simples et doubles événements de translocation. Ce chiffre a été modifié depuis [11]. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 6. L'élargissement de nanopores à 10 membranes nm. Un nanopore dans une membrane de 10 nm à l'origine des expositions très peu de conductance et caractéristiques IV asymétriques (orange). À la demande de 30 impulsions d'alterner entre ± 3 V (4 durée de sec), les mouille nanopores et présente des propriétés IV idéales avec une conductance conforme à celle attendue pour un pore de 3 nm (bleu). 400 autres impulsions de ± 3 V élargit le nanopore à un diamètre de 8 nm(Vert). Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

Le contrôle de la taille des nanopores est d'une importance fondamentale dans les applications de détection biomoléculaires. diamètres de Nanopore doivent être de l'ordre de la taille des molécules étant sondés, ils doivent être suffisamment grand pour accueillir l'échantillon, mais assez petit pour atteindre signal sur bruit optimal. Alors que le contrôle de la taille en utilisant la méthode présentée d'appliquer des champs électriques élevés est unidirectionnel en ce que le diamètre de nanopores ne sont augmentés au long du processus, nanopores de diamètres compris entre 3-100 nm peuvent être façonné, avec une précision inférieure au nanomètre. Comme 3-4 pores nm peuvent être facilement fabriqués en utilisant un TEM ^23, ce qui permet pour la fabrication fiable de nanopores à état ​​solide pour une vaste gamme d'applications de sonder la structure ADN simple brin à l'interaction de complexes protéine-ligand volumineux. Alors que la croissance de nanopores plus de 100 nm peut être très rapide et moins précis, les conditions d'agrandissement plus modérés peuvent être utilisés pour obtenir un meilleur contrôle sur le processus. Comme such, l'étape la plus importante pour réaliser un contrôle efficace de taille est le choix de la résistance et de la durée d'impulsion, afin d'équilibrer l'efficacité agrandissement et le niveau de précision requis pour parvenir à un diamètre de pore désiré. Cela est en outre mis en évidence par l'élargissement de nanopores minces (épaisseur 10 nm), où l'élargissement est observé un biais plus faible, mais l'intensité du champ électrique comparable. En fonction de la taille finale, il est généralement possible d'agrandir le diamètre d'un nanopore sub-100-nm en quelques minutes.

De même, les grandes fluctuations de courant de basse fréquence empêchent études molécule unique car il est presque impossible de différencier les signaux de translocation du bruit de fond. Mouillage incomplet ^24, la présence de résidus carbonés restant après la fabrication initiale ²⁵ et l'adsorption de débris sur le mur de nanopores ¹³ peut dégrader la qualité du signal, nécessitant un nettoyage supplémentaire avec des traitements chimiques agressifs qui sont souvent inefficacious. Fait intéressant, il est courant pour les protocoles de nanopores à état solide pour souligner l'importance du nettoyage de la nanopores dans une solution de piranha ou avec un plasma d'oxygène avant de monter à l'aide de mouillage ou de supprimer toute contamination laissés par les processus de forage, d'imagerie et de manutention. Même avec ce traitement, cependant, nanopores font souvent pas humide ou continuent de faire preuve de bruit élevé, et la solution proposée pour tentatives infructueuses est d'effectuer un nettoyage supplémentaire qui peut être extrêmement chronophage ^14. Avec l'application de champs électriques élevés, ces longs protocoles peuvent ne pas être nécessaires en fonction de l'application. Il a été constaté que la plupart des appareils peuvent être reconditionnés in situ en utilisant la méthode décrite ici, par conséquent de réduire le temps de préparation et la nécessité de traiter avec des produits chimiques. Les étapes les plus importantes dans l'atténuation du bruit électrique est une simple augmentation de la tension et / ou de la durée d'impulsion pour mouiller complètement les pores et enlever les débris faiblement lié.Nanopores traités de cette manière peuvent être utilisés de manière fiable dans des expériences de translocation de biomolécules, telles que le passage de l'ADN et des protéines. Si ces molécules adhèrent à la paroi des pores conduisant à un signal électrique bouché et bruyant, les impulsions de champ électrique peuvent être appliqués à nouveau pour éliminer l'obstruction et de retrouver les propriétés à faible bruit pour de nouvelles expérimentations, sans démontage de la puce de nanopores de la cellule fluidique.

L'application de champs électriques élevés à l'aide de la configuration décrite est limitée par l'exigence d'une alimentation externe qui peut s'appliquer jusqu'à 10 V et amplificateur de courant, qui n'ont pas la sensibilité et les propriétés à faible bruit à bande passante élevée (> 1 kHz) pour seule détection de molécule. Bien que les expériences biomoléculaires typiques reposent sur un amplificateur de courant faible bruit qui est limitée à ± 1 V, il est facile de concevoir un système unique qui pourrait accomplir à la fois domaine de la haute conditionné électrique et la mesure du courant sensible avec un adjule gain stable. Malgré cette limitation, le passage d'une configuration à l'autre est rapide et simple. En comparaison avec les techniques existantes pour contrôler la taille de l'nanopore telles que l'utilisation de la SEM ^5, l'oxydation thermique et la membrane remodelage ^8, des champs électriques élevés offrent une méthode plus rapide, plus précise et moins coûteuse qui peut être effectuée sur le banc de laboratoire en utilisant un équipement standard et fournir un plus large éventail de tailles de nanopores. La capacité à réduire rapidement et de manière reproductible bruit basse fréquence permet également la fabrication initiale plus fiable et prolonge la durée de vie des nanopores à l'état solide, que les pores utilisés précédemment peuvent être rajeunis pour d'autres expériences. Au total, plus de 95% des nanopores de différentes épaisseurs climatisées avec des champs électriques élevés présentait très peu caractéristique de bruit basse fréquence, ce qui les rend appropriés pour biomolécule détection. La fabrication est donc plus facile et plus fiable, de faire des expériences de nanopores semi-conducteurs plus l'accessibilitéble pour les chercheurs et permettant potentiellement d'un chemin vers la commercialisation de technologies de nanopores à travers des processus de fabrication plus robustes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JEM-2100F TEM	JEOL		Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier	Molecular Devices		Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card	National Instruments	PCI-6351	Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software	National Instruments		Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier	Keithley		Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows	Norcada Inc.	NT005X	Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows	Norcada Inc.	NT005Z	Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings	Marian Chicago	HT6135	Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes	In Vivo Metric	E255
Nitric acid	Fisher Scientific	52004P	Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H323	Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid	Fisher Scientific	A300	Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride	Fisher Scientific	P335
HEPES	Fisher Scientific	BP310	Buffering KCl solution
Primary Faraday cage			Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage			Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell			To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate	VWR		Heating piranha solution