Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Engineering

Finjustere størrelse og minimere støj Solid-state Nanopores

doi: 10.3791/51081 Published: October 31, 2013

Summary

En metode til at forberede solid-state nanopores i opløsning for biomolekylære translokation eksperimenter præsenteres. Ved at anvende korte pulser med høje elektriske felter kan nanopore diameter være kontrollerbart udvidet med subnanometer præcision og dens elektriske støjegenskaber væsentligt forbedret. Denne procedure udføres in situ ved anvendelse af standard laboratorieudstyr under eksperimentelle betingelser.

Abstract

Solid-state nanopores er dukket op som et alsidigt værktøj til karakterisering af enkelte biomolekyler, såsom nukleinsyrer og proteiner 1. Men oprettelsen af ​​en nanopore i en tynd isolerende membran er stadig en udfordring. Fabrikation metoder involverer specialiserede fokuseret elektronstråle systemer kan producere veldefinerede nanopores, men udbyttet af pålidelige og støjsvage nanopores i kommercielt tilgængelige membraner fortsat lav 2,3 og størrelse kontrol er nontrivial 4,5. Her anvendelse af høje elektriske felter til at finjustere størrelsen af ​​nanopore samtidig sikre en optimal støjsvag ydeevne er dokumenteret. Disse korte pulser af høj elektrisk felt anvendes til at fremstille en uberørt elektrisk signal og muliggøre udvidelse af nanopores med subnanometer præcision ved længere tids eksponering. Denne fremgangsmåde udføres in situ i et vandigt miljø ved anvendelse af standard laboratorieudstyr, forbedre udbyttet og reproducerbarhed solid-state nanopore opspind.

Introduction

Biologisk og solid-state nanopores er et middel til sensing biomolekylære analytter på enkelt molekyle niveau 1. Individuelle nanopores er typisk indlejret i tynde isolerende membraner, der giver den eneste kanal for ionstrømmen at passere mellem to flydende reservoirer. Udnytte principperne i større skala Coulter tællere, nanopore eksperimenter vedrører ændringer i ionstrømmen at bestemme længden, størrelse, ladning og kropsbygning af ladede biomolekyler som de elektroforetisk drives gennem en nanopore i tilstedeværelse af en ekstern elektrisk felt.

Mens biologiske nanopores såsom α-hemolysin typisk tilbyde større følsomhed og støjsvage egenskaber 3, den støtte tolagede er skrøbelig og fast størrelse, hvilket begrænser deres anvendelighed. Solid-state nanopores på den anden side er fremstillet i tynd (10-50 nm) siliciumnitrid eller siliciumoxid membraner og kan være fremstillet af forskellige Sizes, let integreres med wafer-skala teknologier 6,7, og er mere robuste, giver mulighed for en bredere vifte af eksperimentelle betingelser. På trods af disse fordele, solid-state nanopore teknologier lider flere praktiske ulemper, der begrænser deres anvendelighed til biomolekylære studier. Mens kontrol af nanopore størrelse er mulig, er det typisk dyrt og besværligt at opnå, kræver specialiseret udstyr og uddannet personale. For eksempel har nanopores boret ved fokuseret-ionstråle nylig blevet vist at krympe under specifikke eksperimentelle betingelser i en scanning elektron mikroskop (SEM) 5. I andre fremgangsmåder kan nanopores boret ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) udvide eller indsnævre efter beam betingelser og efterfølgende udsættelse for vandige opløsningsmidler 8. I disse tilfælde den opnåelige række nanopore størrelser er begrænset, vanskelig at kontrollere og endda upålidelige som størrelsen af ​​nanopore kan ændre sig efter kemisk behandling ellernår nedsænket i en bestemt væske miljø 9.

Den ioniske strøm gennem solid-state nanopores kan også lider af forhøjet støj, kilderne som er et intenst undersøgt emne i nanopore litteratur 2,3,10,11. Selv om der er foreslået forskellige metoder til at reducere elektrisk støj, udbyttet af pålidelige, stabile støjsvage nanopores er typisk lavt. Deposition af kulstofholdige aflejringer under boring og billedbehandling kan have skadelige virkninger på det elektriske signal kvalitet, hvilket ofte gør fuldstændig befugtning en udfordring og forårsager dannelse af nanobubbles, der kan være svære at fjerne 12. Endvidere tilstopning af nanopore af analytmolekyler forringer signalkvaliteten rendering porer ubrugelig til yderligere forsøg 13,14. Tilsammen disse effekter i høj grad reducere udbyttet af funktionelle nanopore enheder og øge omkostningerne forbundet med solid-state nanopore forskning.

Anvendelsention af en spænding med Ag / AgCl elektroder til at producere høje elektriske felter i intervallet 0,15-0,3 V / nm præsenterer en overraskende enkel løsning på disse udfordringer. Gennem cykliske anvendelse af korte spændingsimpulser, en ren, støjsvag nanopore overflade ideel til enkelt-molekyle studier er produceret. Langvarig udsættelse for høje elektriske felter initierer fjernelse af membranmaterialet udgør pore væg, hvilket resulterer i en stigning i nanopore diameter. Denne vækst kan styres præcist ved tuning pulsen styrke og varighed. Da de nuværende spor nedbrydes i løbet af et eksperiment på grund af tilstopning af nanopore som molekyler adsorberes til nanopore overflade, kan denne proces gentages for at genvinde tilstoppede enheder, der ellers ville være blevet kasseret. Som sådan er udbyttet af funktionelle nanoporer yderligere af evnen til at anvende den samme enhed flere gange. Denne metode giver flere fordele, da det er hurtigt udført i væske under eksperimentelbetingelser, kræver kun standard laboratorieudstyr, kan automatiseres med software og frembringer funktionelle høj kvalitet nanopores med et udbytte på over 95%.

Protocol

1.. Nanopore Fabrication og rengøring

Bemærk: Når der findes en nanopore i en isolerende membran, kan den monteres direkte i flydende celle uden yderligere forarbejdning eller rengøring, som beskrevet i trin 2. Men hvis det er nødvendigt at fjerne spor af kontaminanter mellem eksperimenter nanopore chips kan renses ved hjælp af enten Piranha-opløsning 3,15,16 (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2) eller ved udsættelse for oxygenplasma 2. Som sådan trin 1,2-1,9 i følgende protokol er valgfri, hvis forrensning ved udsættelse for Piranha-opløsning er ikke nødvendig.

  1. Afgasse filtreret deioniseret (DI) vand ved anbringelse under vakuum i en sonikator i 30 min ved 40 ° C.
  2. Forbered Piranha-opløsning i et 10 ml bægerglas ved forsigtig tilsætning af 3 ml svovlsyre efterfulgt af 1 ml hydrogenperoxid. Bland grundigt ved tilbagesvaling i pipetten. ADVARSEL: Piranha løsning er ekstremt farlige. Venligst ta ke alle forholdsregler.
  3. Brug syrefaste pincet, forsigtigt indsætte nanopore-holdige membran chip kant først ind i Piranha løsning til helt at oversvømme chip og undgå det flyder på overfladen.
  4. Skyl pincet grundigt i filtreret vand.
  5. Bægerglasset anbringes på en forudindstillet varmeplade til 90 ° C og gør det muligt at rense for mindst 30 minutter.
  6. Fjern forsigtigt Piranha løsning fra bægeret ved hjælp af en ren glas pipette og kassér i rigelige mængder vand.
  7. Brug en ren glas pipette tilsættes 5 ml af den afgassede deioniseret vand fra trin 1.1 i bægeret for at skylle. Fjern vand og gentag mindst 5x.
  8. Fjern forsigtigt nanopore chip fra bægeret ved hjælp af rene skarpe spids pincet. Håndtag med ekstrem forsigtighed, da nanopore membranen er meget skrøbelig.
  9. Tør chippen ved forsigtigt at anvende sugning til kanten ved hjælp af en aspirator. Opbevar chip i en ren petriskål indtil den er klar til brug.
ve_title "> 2.. Montering nanopore

  1. Rengør Teflon nanopore celle (figur 1) ved at placere i 20% salpetersyreopløsning og kogning i 10 minutter. ADVARSEL: Brug alle nødvendige personlige værnemidler og håndtere syrer med omhu.
  2. Fjern forsigtigt cellen fra salpetersyre og sted i kogende demineraliseret vand i 10 min.
  3. Kog celle i DI-vand i yderligere 10 minutter for at sikre fuldstændig fjernelse af salpetersyre. Derefter fjernes bægerglasset fra varmepladen og lad den køle af til stuetemperatur.
  4. Fjern cellen fra bægeret og blæs tør med filtreret luft eller N2. Opbevar celle i en ren petriskål.
  5. Afgasse filtreret KCl-opløsning (bufret med HEPES ved pH 8) ved anbringelse under vakuum i en sonikator i 30 min ved 40 ° C.
  6. Clean to silikone elastomer pakninger til hver nanopore chip ved sonicating i ethanol i mindst 10 min.
  7. Placer nanopore chip på en ren elastomer pakning væsen careful at tilpasse vinduet membranen med pakningen åbning. Placer og justere en anden pakning på toppen af ​​chippen.
  8. Placer chip og pakninger på reservoiret indløb den ene halvdel af den rensede nanopore celle. Saml cellen ved at skrue den anden halvdel på plads. En eksploderet afbildning af nanopore cellekomponenter er vist i figur 1.
  9. Fugt nanopore chip ved pipettering af ethanol i cellen reservoirer og placere i et vakuumkammer indtil for et par bobler ses at forlade fjorde.
  10. Ethanolen fjernes ved at skylle beholderne med mindst 3 ml afgasset filtreret KCI-opløsning. Vær omhyggelig med at fjerne overløb ved hjælp af en aspirator.

3. Nanopore Karakterisering

  1. Placer nanopore celle i elektrisk afskærmet forsøgsopstillingen og placere Ag / AgCl-elektroder i hvert reservoir. Denne opsætning svarer til den vist i figur 2, med undtagelse af den eksterne strømforsyning og strøm forstærker, som ererstattet med en støjsvag resistiv feedback-forstærker.
  2. Brug af den støjsvage forstærker i spænding-clamp modus gælder potentialer fejer fra -200 mV til +200 mV og registrere IV egenskaber.
  3. Monter IV kurven for at opnå nanopore ledningsevne, som kan bruges til at beregne dens diameter i opløsning 17.. Hvis den beregnede diameter er meget mindre end forventet ud fra TEM billeddannelse, pore er sandsynligt ikke befugtes fuldstændigt og / eller indeholder snavs eller forurening.
  4. Påfør en 200 mV potentiale over nanopore og registrere den ioniske strøm i 30 sek.
  5. Udfør en power spectral density (PSD) analyse af den ioniske strøm og integrere at kvantificere de elektriske støjkarakteristika nanopore. Hvis støjen er over 15 pA RMS ved 5 kHz båndbredde, så pore sandsynligvis ikke befugtes fuldstændigt og / eller som indeholder forurening, og kan ikke anvendes pålideligt i eksperimentet.

4.. Conditioning Nanopores Brug High Electric FieLDS

Bemærk: Hvis IV kurve genereret udviste asymmetri eller mindre end forventet ledningsevne, eller det aktuelle spor viste ustabilitet og høje støjniveauer ved lave frekvenser, er det nødvendigt at betinge nanopore med høje elektriske felter for at fjerne enhver forurening på pore overflade og / eller våd pore. Selv om denne fremgangsmåde ikke påvirker den højfrekvente støj forårsaget af membranen kapacitans eller parasitisk kapacitans koblet til indgangen af strømforstærkertrinnet anvendes i målingerne, kan lavfrekvent støj (også kaldet 1 / f støj) 18 blive reduceret betydeligt. En skematisk setup anvendes til at udføre denne konditionering er vist i figur 2.

  1. Afbryd elektroderne fra plastret-clamp forstærker.
  2. Slut den ene af elektroderne til en computer-kontrollerede strømforsyning stand til at generere> 6 V (> 0,2 V / nm elektrisk feltstyrke til 30-nm tykke membraner, der anvendes her) og den anden til en eKSTERN nuværende forstærker, der kan overvåges i realtid.

    Bemærk: Anvendelsen af ​​høje elektriske felter kan bruges til at konditionere nanopores i forskellige membranmaterialer og tykkelser. Mens begge 30 nm og 10 nm membraner er diskuteret her, spændinger beskrevet henvises til dem, der anvendes til 30 nm tykke membraner, medmindre andet er angivet.

  3. Anvend en spændingsforskel på 400 mV (målespænding) på tværs nanopore mindst 5 sek.
  4. Beregn den gennemsnitlige aktuelle værdi fra den sidste 1 sek af data til at bestemme ledeevne af nanopore. Beregn diameteren af ​​nanopore baseret på denne ledningsevne, hvilket bør ske automatisk ved hjælp af softwaren og nanopore ledningsevne model valg baseret på de mest sandsynlige geometri. Det bør svare til diameteren målt fra IV kurve.
  5. Påfør en 200 msek puls på 6 V (befugtning spænding) over nanopore at producere et elektrisk felt på 0,2 V / nm efterfulgt af en måleperiode 5 sek400 mV. Igen beregnes en diameter nanopore vha. endelig 1 sek af data og sammenlignes med den forventede værdi fra TEM målinger for at sikre, at nanopore er helt vådt. Gentag om nødvendigt flere gange.
  6. Gentag om nødvendigt anvendelsen af ​​høj elektrisk felt pulser med stigende spænding, indtil det aktuelle signal i måleperioden er stabil og viser den forventede ledningsevne. Det anbefales ikke at overstige 10 V (dvs.> 0,3 V / nm), da dette i væsentlig grad kan forstørre eller beskadige nanopore hurtigt.

5.. Udvidelse Nanopores Brug High elektriske felter

Bemærk: diameter nanopore er afgørende for dens funktionalitet til en bestemt biomolekylært sensing ansøgning. Til dette formål en nanopore oprettet ved hjælp af en TEM kan forstørres til en ønsket størrelse ved anvendelse af høje elektriske felter, indtil den ønskede diameter er opnået med den samme opsætning bruges til at rense og befugtenanopore (figur 2).

  1. Ved hjælp af samme elektroniske konfiguration som i del 4, anvende en 200-500 mV skævhed på tværs af pore at opnå en måling diameter. Mens mindre præcis end at montere et IV-kurve, kan et enkelt punkt måling bruges til groft skøn nanopore størrelse hurtigt.
  2. Anvend en 2 sek puls på 8 V over nanopore efterfulgt af en måleperiode på mindst 5 sekunder ved 400 mV. Beregning af den nye diameter vil typisk udvise en meget lille stigning i nanopore størrelse (<0,1 nm).
  3. Gentag denne proces cyklisk, vekslende mellem udvidelsen og måling spændinger til at opnå in situ og real-time målinger af voksende nanopore diameter.
  4. Hvis hurtigere vækst er ønskelig, øge størrelsen af den anvendte spænding trinvist op til 10 V. Væksten vil typisk accelerere som pore udvider med stigningstakten i ledningsevne spænder fra 0,03 nS / s ec & #160; 10 nS / sek, afhængigt af størrelsen af ​​nanopore, styrken af ​​det elektriske felt og elektrolyt opløsningsegenskaber.
  5. Når den ønskede diameter er nået, standse anvendelsen af ​​høje elektriske felter. Dette kan gøres automatisk ved hjælp af edb-programmet.
  6. Tilslut patch-clamp forstærker til elektroderne.
  7. Tilegne sig ny IV og aktuelle spor data på 200 mV for at bekræfte diameter nanopore og kontrollere støjsvage nuværende signaler i trin 3,2-3,5 ovenfor. Gentag om nødvendigt condition og udvide protokol (trin 4,1-5,5).

6.. DNA translokation

  1. Før tilsætning af en biomolekylær prøve udføre et kontrolforsøg for at sikre, at der ikke er nogen forurening i reservoiret. Anskaf en aktuel spor under en påført potentiale 150-300 mV i fravær af enhver prøve for at kontrollere, at ingen aktuelle blokader opdages efter 2 min.
  2. Tilføj λ-DNA (48,5 kbp dobbeltstrenget) til <em> cis reservoir til en slutkoncentration på 0,5-2 ng / ul. Tilbagesvaling forsigtigt med pipette i mindst 10 sek sikre en homogen fordeling af prøven gennem reservoiret.
  3. For en 30-nm tyk nanopore, anvende en potentiel bias på 150-300 mV til trans reservoir og måle den ioniske strøm passerer gennem nanopore. For meget korte translokation begivenheder, er det ønskeligt at prøve på en høj frekvens (250 kHz eller højere) med en relativ høj lavpasfiltreringen frekvens (100 kHz).
  4. Overvåg den ioniske strøm ved hjælp af software til at opdage transient strøm blokader som molekyler translocate gennem nanopore. De ioniske nuværende spor af molekylær translokation kan analyseres for at bestemme blokering dybde, varighed og hyppighed til at udlede oplysninger om prøven af ​​interesse. Omvendt, hvis oplysninger om translokere molekyler er kendt, denne data kan anvendes til at undersøge egenskaberne af nanopore selv.

Representative Results

De nanoporer anvendt i denne undersøgelse blev udført i 30 nm eller 10 nm tyk siliciumnitrid membran vinduer. Mens den beskrevne protokol kan anvendes til solid-state nanopores af forskellige materialer fremstillet ved hjælp af metoder, er de almindeligvis boret ved TEM anvendelse af tidligere etablerede protokoller 11,14. Nanopores boret ved TEM er typisk mellem 4-8 nm i diameter (figur 2). Mens begge 30 nm og 10 nm tykke membraner kan monteres og konditioneres ved hjælp af ovennævnte protokol, spænding forspænder beskrevne henvise der kræves til 30 nm tykke membraner, medmindre andet er angivet. For membraner af forskellig størrelse, bør den anvendte spænding justeres til at generere et elektrisk felt i området 0,15-0,3 V / nm inde nanopore.

Figur 3a viser to typiske konduktans spor af en 10-nm nanopore i en 30 nm tyk membran før og efter behandling med høje elektriske felter. Ved montering af en nyligt drilled nanopore, sandsynligheden for at opnå en ustabil og støjende ionstrøm signal, der udviser en høj grad af lavfrekvente svingninger, er sædvanligvis høj. Det er vist i figur 3a nanopore fremhæver denne adfærd. Dens ledningsevne er betydeligt mindre end forventet for en nanopore af sin størrelse, sandsynligvis på grund af ufuldstændig befugtning. Ved anvendelse af høje elektriske felter på 0,27 V / nm i størrelsesorden produceret af 8 V pulser (90 pulser af 2 sekunders varighed), bliver nanopore helt våd og efterfølgende udvidet til 21 nm i diameter. På dette tidspunkt, pore udviser en stabil ledningsevne med støjsvage egenskaber. Kvantitativ analyse af støj i lignende nanopores er vist som power spectral density parceller i figur 3b. Den lavfrekvente støj amplitude unwet og / eller tilstoppede porer er meget høj (> 20 pA RMS), hvilket gør dem ubrugelige i eksperimentet. Ved konditionering med høje elektriske felter, støj effekt ved lave frekvenser (<10 kHz) er diminished med op til 3 størrelsesordener og klar til støjsvage eksperimenter.

4a viser en typisk strøm måling som det potentiale anvendte pulses mellem høje elektriske felter til forstørrelse og lav elektrisk felt måleperioder. Efter hver efterfølgende puls, den resulterende ioniske strøm gennem nanopore ved målingen spænding (dvs. nanopore ledningsevne) stiger med en endelig mængde. Dette viser, at nanopore øges i størrelse, da diameteren d kan udledes dens ledningsevne G i en opløsning af ledningsevne σ, tilnærme nanopore som havende cylindrisk geometri effektive længde l eff. Mens der findes forskellige andre modeller for at relatere nanopore ledningsevne til sin geometri 17,19-21, har følgende forhold, som inkorporerer en geometrisk sigt og en adgang modstand sigt vist sig gældende for TEM-borede nanopores i høj saltkoncentrationer, over en bred vifte af diametre af interesse for dsDNA translokation 17,22.

Når den ønskede diameter er nået, er processen stoppes automatisk af softwaren. Den resulterende nanopore diameter kan derefter bekræftes ved anvendelse af præcise IV målinger, som vist i figur 4b.

Det er vigtigt at bemærke, at nanopores behandlet med høje elektriske felter er fuldt funktionelle. Dette valideres ved påvisning af λ DNA-translokation, som vist i konduktans spor vist i figur 5a. I denne figur er dsDNA drives gennem to nanopores der blev udvidet til 11 nm og 32 nm ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde. I hvert tilfælde baseline ledeevne er yderst stabil og klare blokader observeres som dsDNA molekyler translocate gennem nanopore, viser højt signal--Støj enkelt-molekyle translokation begivenheder sammenlignet med ubehandlede porer, der udviser høj støj. Som vist i indsatsene i figur 5a er flere diskrete blokering niveauer observeret som individuelle foldede molekyler translokeres, som forventet for nanopores af disse størrelser. Histogrammer af nanopore ledningsevne under translokation begivenheder gennem hver pore er vist i figur 5b. De støjsvage egenskaber af nanopores afslører særskilte, let opløselige toppe svarende til baseline (ingen DNA), enkelt (en DNA-streng - udfoldet) og dobbelt blokering stater (to DNA-strenge - foldet). Af bemærkelsesværdigt er det faktum, at ændringen i ledningsevne svarende til en enkelt dsDNA-molekyle besætter pore er forskellig for de store og små nanoporer. Dette giver indirekte bevis for, at anvendelsen af ​​høje elektriske felter er i virkeligheden en udvidelse af eksisterende nanopores, som den samme blokering amplitude ville blive opfyldt, hvis andre porer eller revner blev oprettet i than membran under processen 17.

Tilsvarende Figur 6 illustrerer effektiviteten af høje elektriske felter til at udvide nanopores fremstillet i membraner af forskellig tykkelse. Her en nanopore skabt i en 10-nm sinx membran er i første omgang delvist unwet, viser ustabile og relativt lille ledningsevne. Ved anvendelse af skiftevis ± 3 V (± 0,3 V / nm) pulser af 4 sek varighed (30 i alt), bliver nanopore våd og udviser ideelle IV egenskaber for en 3 nm pore. Den metode blev derefter gentaget for 400 efterfølgende impulser og nanopore blev udvidet til 8 nm. Denne udvidelse, udføres på sammenlignelige elektriske felter, men lavere anvendt spændingsforspænding end for nanopores fremstillet i 30-nm-membraner, viser, at processen er primært elektrisk felt drevet. Da den nuværende blokade translokation gennem en tyndere membranen er større end den, der produceres i tykkere porer, nanopores i tynde membranerbehandlet på denne måde kan anvendes til at studere kortere molekyler, såsom proteiner med forøget følsomhed.

Figur 1
Figur 1. Nanopore celle forsamling. En siliciumnitrid membran indeholder en nanopore er placeret mellem silikone elastomer pakninger, som igen er komprimeret af to Teflon halve celler, der indeholder elektrolyt reservoirer. Klik her for at se større billede .

Figur 2
Figur 2. Nanopore condition og udvide setup. En nanopore boret i en 30 nm tyk siliciumnitrid membran (til venstre) forbinder to elektrolyt reservoirer. Acomputer bruges til at styre enten en patch-clamp forstærker eller ekstern strømforsyning (DAQ-kort), som anvender en potentielle skævhed tværs nanopore via Ag / AgCl elektroder nedsænket i elektrolytten reservoirer. Den nuværende forstærker relæer ionstrømmen målt til at blive overvåget i realtid ved hjælp af computersoftware. Dette tal er blevet ændret fra [11]. Klik her for at se større billede .

Figur 3
Figur 3. Aktuelle spor før og efter anvendelse af høje elektriske felter. (A) Ved montering, og selv efter rengøring med Piranha løsning, ledningsevnen af nanopore er ustabil og mindre end forventet for en cylindrisk 10-nm pore (blå). Efter anvendelse af 2 sec pulser af 8 V, dennanopore er fuldt befugtet og forstørret udviser en stabil ledningsevne og kan anvendes til biomolekylære sensing eksperimenter (grøn). (B) power spectral density plot af en ufuldstændigt fugtet og tilstoppet nanopore (blå og orange, henholdsvis). Ved anvendelse af 200 msek pulser af 8 V blev nanopores fugtet og snavs fjernes (grøn og rød, henholdsvis). Dette tal er blevet ændret fra [11]. Klik her for at se større billede .

Figur 4
Figur 4.. Nanopore udvide anvendelse af høje elektriske felter. (A) Skiftende mellem udvidelsen og måling potentielle bias (rød) afslører, at den ioniske strøm gennem nanopore (blå) stigninger i finite trin. Den resulterende adfærdstemmelse måling kan bruges til at udlede nanopore diameter. Når den ønskede diameter er opnået, standsedes processen. (B) Præcise IV målinger af ledningsevne bekræfter, at nanopore størrelser er steget. Sådanne grunde give et bedre estimat af porestørrelse end single-point aktuelle værdier, som de kan være egnet og deres symmetrisk og Ohmsk adfærd kan bekræftes. Dette tal er blevet ændret fra [11]. Klik her for at se større billede .

Figur 5
Figur 5. DNA-translokation gennem aircondition nanoporer. (A) tilsætning af dsDNA (48,5 kbp) til den ene side af nanopore ved en forspænding på 150 mV frembringer forbigående blokader i konduktans spor af 11-nm (blå) og 32 nm pores (rød). (B) Histogrammer af ledningsevnen, af hver af de nanopores viser diskrete toppe svarende til baseline, enkelt og dobbelt translokation begivenheder. Dette tal er blevet ændret fra [11]. Klik her for at se større billede .

Figur 6
Figur 6. Udvidelsen af nanopores i 10 nm membraner. Et nanopore i en 10 nm membran oprindeligt udviser meget lidt ledningsevne og asymmetriske IV egenskaber (orange). Ved anvendelse af 30 pulser af vekslende mellem ± 3 V (4 sekunders varighed), nanopore væder og udviser ideelle IV ejendomme med en ledningsevne overensstemmelse med det forventede for en 3 nm pore (blå). Yderligere 400 pulser af ± 3 V forstørrer nanopore til en diameter på 8 nm(Grøn). Klik her for at se større billede .

Discussion

Kontrol af nanopore størrelse er af fundamental betydning i biomolekylære sensing applikationer. Nanopore diametre skal være på rækkefølgen af ​​størrelsen af ​​de molekyler, som testes, og de skal være stor nok til at rumme prøven, men lille nok til at opnå optimal signal-til-støj. Mens kontrol af størrelse ved hjælp af den metode, der præsenteres af at anvende høje elektriske felter er ensrettet i at nanopore diametre kun steget i hele processen, kan nanopores med diametre mellem 3-100 nm være gammeldags, med subnanometer præcision. Som 3-4 nm porer kan let fremstillet ved hjælp af en TEM 23. Dette giver mulighed for pålidelig produktion af solid-state nanopores til en bred vifte af applikationer fra sondering ssDNA struktur til interaktionen af voluminøse protein-ligand-komplekser. Mens nanopore vækst over 100 nm kan være meget hurtige og mindre præcise, mere moderate forstørrelse betingelser være ansat for at opnå bedre kontrol over processen. Som sUCH, det vigtigste skridt for at opnå en effektiv størrelse kontrol er valget af puls styrke og varighed for at afbalancere Forstørrelse effektivitet og præcision der kræves for at opnå en ønsket porediameter. Dette er yderligere fremhævet af udvidelsen af ​​tyndere nanopores (10 nm tykkelse), hvor udvidelsen er observeret en lavere skævhed, men sammenlignelig elektrisk feltstyrke. Afhængig af den endelige størrelse, er det generelt muligt at forstørre en nanopore til sub-100-nm diametre i et par minutter.

Tilsvarende udelukker store lavfrekvente løbende udsving enkelt-molekyle studier, som det er næsten umuligt at skelne translokation signaler fra baggrundsstøj. Ufuldstændig befugtning 24, kan tilstedeværelsen af kulstofholdige rester tilbage efter indledende fabrikation 25 og adsorption af snavs på nanopore væg 13 forringe signalkvaliteten, som kræver ekstra rengøring med skrappe kemiske behandlinger, der ofte er inefficacious. Interessant, det er fælles for solid-state nanopore protokoller til at understrege vigtigheden af ​​at rense nanopore i Piranha-opløsning eller med ilt plasma før montering at hjælpe befugtning eller fjerne enhver forurening tilovers fra boring, billedbehandling og håndteringsprocesser. Selv med denne behandling dog nanopores ofte ikke våd eller fortsætte med at udvise høj støj, og den foreslåede løsning for mislykkede forsøg er at udføre ekstra rengøring, der kan være ekstremt tidskrævende 14. Med anvendelsen af ​​høje elektriske felter, kan disse lange protokoller ikke være nødvendigt afhængigt af programmet. Det blev fundet, at de fleste udstyr kan repareres in situ ved anvendelse af den heri beskrevne fremgangsmåde, således sparer tid og dermed behovet for at behandle barske kemikalier. De vigtigste skridt i at afbøde elektrisk støj er en simpel stigning i spænding og / eller puls varighed til helt våd pore og fjerne løst bundne rester.Nanopores behandlet på denne måde pålideligt anvendes i biomolekylære translokation eksperimenter, såsom passage af DNA og proteiner. Hvis disse molekyler klæbe til pore væggen fører til en tilstoppet og støjende elektrisk signal kan høje elektrisk felt pulser genanvendes til at fjerne forhindringen og genvinde støjsvage egenskaber for yderligere eksperimenteren uden afmontering af nanopore chip fra fluidumydelse celle.

Anvendelsen af ​​høje elektriske felter ved hjælp af opsætningen, som beskrives, er begrænset af kravet om en ekstern strømforsyning, der kan anvende op til 10 V og strøm forstærker, som mangler følsomhed og støjsvage egenskaber ved høj båndbredde (> 1 kHz) for enkelt molekyle sensing. Mens typiske biomolekylære eksperimenter afhængige af en støjsvag nuværende forstærker, der er begrænset til ± 1 V, er det ligetil at designe et enkelt system, der kunne udrette både høj elektrisk felt condition og følsom aktuel måling med en adjustabil gevinst. På trods af denne begrænsning, overgangen fra en opsætning til den anden er hurtig og ligetil. I sammenligning med de eksisterende teknikker til kontrol af nanopore størrelse såsom brugen af SEM 5, termisk oxidation og membran omforme 8 høje elektriske felter giver en hurtigere, mere præcis og billigere metode, der kan udføres på laboratoriet bænken ved hjælp af standard-udstyr og give en bredere vifte af nanopore størrelser. Evnen til hurtigt og reproducerbart reducere lavfrekvent støj gør også indledende fabrikation mere pålidelig og forlænger levetiden af ​​solid-state nanopores, som tidligere anvendte porer kan forynges til yderligere forsøg. Alt i alt over 95% af nanopores af varierende tykkelser aircondition med høje elektriske felter udstillet meget lidt lavfrekvent støj karakteristik, hvilket gør dem egnede til biomolekyler sensing. Fabrication er således lettere og mere pålidelig, hvilket gør solid-state nanopore eksperimenter mere tilgængeligt til forskere og potentielt giver mulighed for en vej mod kommercialisering af nanopore teknologier gennem mere robuste fremstillingsprocesser.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender støtte fra naturvidenskab og teknik Research Council of Canada, Canada Foundation for Innovation og Ontario Research Fund. Vi takker Y. Liu om støtte i nanopore fremstilling og karakterisering, L. Andrzejewski for værdifulde diskussioner og teknisk support, og A. MARZIALI hjælp til nanopore software og instrumentering design.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM-2100F TEM JEOL Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card National Instruments PCI-6351 Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software National Instruments Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier Keithley Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005X Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005Z Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings Marian Chicago HT6135 Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes In Vivo Metric E255
Nitric acid Fisher Scientific 52004P Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H323 Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid Fisher Scientific A300 Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride Fisher Scientific P335
HEPES Fisher Scientific BP310 Buffering KCl solution
Primary Faraday cage Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate VWR Heating piranha solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Venkatesan, B. M., Bashir, R. Nanopore sensors for nucleic acid analysis. Nat. Nanotechnol. 6, (10), 615-624 (2011).
  2. Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Dekker, N. H., Dekker, C. Noise in Solid-State Nanopores. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (2), 417-421 (2008).
  3. Tabard-Cossa, V., Trivedi, D., Wiggin, M., Jetha, N. N., Marziali, A. Noise analysis and reduction in solid-state nanopores. Nanotechnology. 18, 4484-4418 (2007).
  4. Wu, M. -Y., et al. Control of Shape and Material Composition of Solid-State Nanopores. Nano Lett. 9, (1), 479-484 (2009).
  5. Prabhu, A. S., Freedman, K. J., Robertson, J. W. F., Nikolov, Z., Kasianowicz, J. J., Kim, M. J. SEM-induced shrinking of solid-state nanopores for single molecule detection. Nanotechnology. 22, 425302 (2011).
  6. Li, J., Stein, D., McMullan, C., Branton, D., Aziz, M. J., Golovchenko, J. A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, (6843), 166-169 (2001).
  7. Rosenstein, J. K., Wanunu, M., Merchant, C. A., Drndic, M., Shepard, K. L. Integrated nanopore sensing platform with sub-microsecond temporal resolution. Nat. Methods. 9, (5), 487-492 (2012).
  8. Vanden Hout, M., Hall, A. R., Wu, M. Y., Zandbergen, H. W., Dekker, C., Dekker, N. H. Controlling nanopore size, shape and stability. Nanotechnology. 21, 115304 (2010).
  9. Li, Q., et al. Size evolution and surface characterization of solid-state nanopores in different aqueous solutions. Nanoscale. 4, (5), 1572-1576 (2012).
  10. Smeets, R., Dekker, N., Dekker, C. Low-frequency noise in solid-state nanopores. Nanotechnology. 20, 095501 (2009).
  11. Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Precise control of the size and noise of solid-state nanopores using high electric fields. Nanotechnology. 23, (40), 405301 (2012).
  12. Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Wu, M. Y., Dekker, N. H., Dekker, C. Nanobubbles in Solid-State Nanopores. Phys. Rev. Lett. 97, (8), 088101 (2006).
  13. Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-Molecule Observation of Protein Adsorption onto an Inorganic Surface. J. Am. Chem. Soc. 132, (31), 10816-10822 (2010).
  14. Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560 (2011).
  15. Wanunu, M., Meller, A. Single-molecule analysis of nucleic acids and DNA-protein interactions. Single-molecule techniques: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
  16. Tabard-Cossa, V. Instrumentation for Low-Noise High-Bandwidth Nanopore Recording. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. 59-93 (2013).
  17. Kowalczyk, S. W., Grosberg, A. Y., Rabin, Y., Dekker, C. Modeling the conductance and DNA blockade of solid-state nanopores. Nanotechnology. 22, (31), 315101 (2011).
  18. Siwy, Z., Fuliński, A. Origin of 1/fα Noise in Membrane Channel Currents. Phys. Rev. Lett. 89, (15), 158101 (2002).
  19. Liebes, Y., et al. Reconstructing solid state nanopore shape from electrical measurements. Appl. Phys. Lett. 97, (22), 223105 (2010).
  20. Kim, M. J., Wanunu, M., Bell, D. C., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniformly Sized Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, (23), 3149-3153 (2006).
  21. Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Krapf, D., Wu, M. -Y., Dekker, N. H., Salt Dekker, C. Dependence of Ion Transport and DNA Translocation through Solid-State Nanopores. Nano Lett. 6, (1), 89-95 (2006).
  22. Wanunu, M., Dadosh, T., Ray, V., Jin, J., McReynolds, L., Drndić, M. Rapid electronic detection of probe-specific microRNAs using thin nanopore sensors. Nat. Nanotechnol. 5, (11), 807-814 (2010).
  23. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 2, (4), 209-215 (2007).
  24. Powell, M. R., Cleary, L., Davenport, M., Shea, K. J., Siwy, Z. S. Electric-field-induced wetting and dewetting in single hydrophobic nanopores. Nat. Nanotechnol. 6, (12), 798-802 (2011).
  25. Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35, (6), 399-409 (2004).
Finjustere størrelse og minimere støj Solid-state Nanopores
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (80), e51081, doi:10.3791/51081 (2013).More

Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (80), e51081, doi:10.3791/51081 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter